Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 18
1.1. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний 18
1.1.1 .Влияние сахарного диабета 2 типа на развитие сердечно сосудистых заболеваний 19
1.1.2..Влияние ожирения на развитие сердечно-сосудистых заболеваний..21
1.1.3 .Метаболический синдром и инсулинорезистентность 23
1.1.4.Факторы риска инфаркта миокарда и их влияние на прогноз заболевания 26
1.2.Воспаление 29
1.2.1. Белки острой фазы воспаления и их роль в патогенезе заболеваний ..31
1.2.2. Цитокины и их роль в патогенезе заболеваний 41
1.2.3. Роль воспаления в развитии атеросклероза 47
1.2.4. Воспаление и артериальная гипертония 51
1.2.5. Воспаление и ожирение 56
1.2.6. Воспаление и сахарный диабет 2 типа 58
1.2.7. Воспаление и инсулинорезистентность 59
1.2.8. Воспаление и инфаркт миокарда 65
1.3. Генетическая обусловленность сердечно-сосудистых заболеваний и их факторов риска 68
1.3Л.Полиморфизмы генов при сердечно-сосудистых заболеваниях 69
1.3.2. Полиморфизмы генов при сахарном диабете 2 типа 75
1.3.3. Полиморфизмы генов при ожирении 77
1.3.4. Взаимосвязь полиморфизмов генов 79
1.3.5 .Заключение 81
Глава 2. Материалы и методы исследования 82
2.1. Клиническая характеристика больных 82
2.2.0бщеклинические, лабораторные и функциональные методы обследования 87
2.3. Определение острофазовых белков (орозомукоида, церулоплазмина, а 1-антитрипсина, С-реактивного белка, гапто глобина, С3 компонента комплемента) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини 92
2.4. Определение цитокинов (IL-4, IL-6, IL- 8, IL-10, IL-12, TGF-p, TNF-a, INF-y) методом твердофазного иммуноферментного анализа 94
2.5. Расчет зоны некроза миокарда по данным мониторирования КФК 95
2.6. Определение поражения коронарных артерий методом коронароангиографии 98
2.7. Определение полиморфизмов генов АРОА1, АРОЕ, АСЕ, IRS1, IL-10 и TNF-a 99
2.8. Методы статистической обработки полученных данных 101
Глава 3. Результаты собственных исследований 103
3.1. Изучение воспалительных процессов у больных ишемической болезнью сердца 103
3.2. Влияние сопутствующих сахарного диабета 2 типа и ожирения на показатели БОФ у больных ишемической болезнью сердца 113
3.3.Изучение воспалительных показателей у больных артериальной гипертонией 116
3.3.1. Корреляционный анализ воспалительных показателей у больных артериальной гипертонией 119
3.3.2. Анализ показателей артериального давления у больных АГ 122
3.3.3. Анализ показателей ЭХО КГ у больных артериальной гипертонией 123
3.3.4. Изучение влияния степени ожирения и нарушений липидного обмена у больных артериальной гипертонией на маркеры воспаления 123
3.4. Изучение воспалительных процессов при остром инфаркте миокарда 125
3.4.1. Динамика воспалительных показателей у больных острым инфарктом миокарда 125
3.4.2. Изучение динамики воспалительных показателей у больных острым инфарктом миокарда при осложнениях в госпитальном периоде 131
3.4.3. Изучение взаимосвязи динамики воспалительных показателей в остром периоде инфаркта миокарда и отдаленным прогнозом инфаркта миокарда (в течение года наблюдения) 147
3.4.4. Изучение динамики воспалительных показателей у больных острым инфарктом миокарда при сопутствующих ожирении и сахарном диабете 2 типа 154
3.4.5. Сопоставление уровней острофазовых белков при остром инфаркте миокарда с размерами зоны некроза миокарда 166
3.4.6. Факторный анализ показателей острофазового ответа и зоны некроза миокарда больных острым инфарктом миокарда 167
3.5. Изучение ассоциации полиморфизмов генов с сердечно-сосудистыми заболеваниями 171
3.5.1.Полиморфизмы генов АРОА1, АРОЕ, АСЕ, IRS1, IL-10 и TNF-a - особенности клинических проявлений ИБС 171
3.5.2.Полиморфизмы генов АРОА1, АРОЕ, АСЕ, IRS1, IL-10 и TNF-a - особенности клинического течения ОИМ 192
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 200
4.1. Влияние факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний на воспаление и поражение коронарных сосудов 200
4.2. Влияние факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний на воспалительные процессы и течение острого инфаркта миокарда 214
4.3.Роль полиморфизмов генов АРОА1, АРОЕ, АСЕ, IRS1, IL-10 и TNF-a при ишемической болезни сердца 225
4.4. Роль полиморфизмов генов АРОА1, АРОЕ, АСЕ, IRS, IL-10 и TNF-a при инфаркте миокарда 236
Выводы 241
Практические рекомендации 245
Список литературы 247
- Белки острой фазы воспаления и их роль в патогенезе заболеваний
- Определение острофазовых белков (орозомукоида, церулоплазмина, а 1-антитрипсина, С-реактивного белка, гапто глобина, С3 компонента комплемента) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини
- Корреляционный анализ воспалительных показателей у больных артериальной гипертонией
- Влияние факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний на воспалительные процессы и течение острого инфаркта миокарда
Введение к работе
Актуальность проблемы
Сердечно-сосудистые заболевания, несмотря на современные технологии диагностики и лечения, продолжают лидировать по распространенности, инвалидизации и смертности населения [Оганов Р.Г. 2003].
Приоритетной группой для проведения специфических профилактических мер по предупреждению сосудистых событий являются пациенты не только с установленным сердечно-сосудистым заболеванием (ССЗ), но и имеющие высокий риск их развития [Люсов В.А.,1999]. Существующая в настоящее время система оценки риска ССЗ (Systematic Coronary Risk Evaluation (SCORЕ)) включает такие факторы, как пол, возраст, курение, повышение систолического артериального давления, повышение уровня общего холестерина (или соотношения ХС/ХС ЛПВП). К повышению общего риска ССЗ приводят наличие семейной предрасположенности, низкий уровень ХС ЛПВП, повышенный уровень триглицеридов, снижение толерантности к глюкозе, повышенный уровень С-реактивного белка и фибриногена, а так же ожирение (ОЖ) [Карпов Ю.А.2007].
Внимание к этим факторам, как повышающим риск ССЗ, основано, в первую очередь, на данных многоцентровых клинических исследований [PROGRESS, HOPE, EUROPA UKPDS], результаты которых либо указывают на повышение заболеваемости сердечно-сосудистой системы у лиц с наличием данных факторов риска, либо свидетельствуют о том, что продолжительный тщательный контроль над этими факторами приводит к значительному снижению частоты сердечно-сосудистых осложнений [Арутюнов Г.П.1999].
При оценке влияния факторов риска на развитие сердечно-сосудистой патологии необходимо учитывать, что многие из них взаимосвязаны между собой и взаимно усиливают негативное влияние на поражение сосудов. Повышение артериального давления является одним из наиболее значимых факторов риска ССЗ. Доказано, что контроль над уровнем АД, может снизить риск инсульта на 40-50% [Чазова И.Е.,2007; Шальнова С.А.,2001].
В настоящее время под пристальным вниманием медиков находится метаболический синдром, включающий в себя большинство факторов риска ССЗ. В основе его развития находятся инсулинорезистентность, гиперинсулинемия и абдоминальное ожирение [Кисляк О.А., Сторожаков Г.И., 2005; Шостак Н.А.,2002].
Согласно современной теории развития атеросклероза, факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний приводят к эндотелиальной дисфункции и инициируют воспалительную реакцию [Шевченко О.П., Мишнев О.Д., 2005]. Субклиническое воспаление обусловлено последовательным каскадом взаиморегулируемых факторов, включающих клеточный, гуморальный иммунитет, первичные (интерферон, интерлейкины, факторы роста) и вторичные (белки острой фазы воспаления (БОФ), компоненты системы комплемента) медиаторы воспаления [Назаров П.Г., 2001].
Сахарный диабет 2 типа (СД) и синдром инсулинорезистентности так же приводят к развитию реакции воспаления через увеличение цитокинов (IL-6 и др.), поступающих из жировой ткани и гепатоцитов. В то же время существует теория, согласно которой увеличение цитокинов и БОФ являются противодействующим фактором гипергликемии и инсулинорезистентности.
Нарушения ренин - ангиотензиновой системы и окислительный стресс при артериальной гипертонии активируют факторы воспаления, что в свою очередь, замыкая порочный круг, усугубляет ее течение.
Многие факторы риска ССЗ (нарушения липидного метаболизма, нарушения углеводного обмена, функция тромбоцитов и др.) генетически обусловлены. Таким образом, факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний тесно взаимосвязаны и могут иметь между собой взаимные воспалительную и генетическую основы. Можно предположить, что сердечно-сосудистые заболевания являются конечной точкой, общей для метаболических и воспалительных процессов.
Цель исследования:
Изучить патогенетическую роль факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний в развитии воспаления, формировании поражения коронарных сосудов и течении сердечно-сосудистой патологии.
Задачи исследования:
1. Оценить зависимость атеросклеротического поражения сосудов сердца от нарушений липидного обмена и проанализировать взаимосвязь воспалительных процессов с дислипидемией у больных ишемической болезнью сердца (ИБС).
2. Определить уровни белков острой фазы воспаления, относящихся к различным функциональным группам (СРБ, церулоплазмина, С3-компонента комплемента, 1-антитрипсина, гаптоглобина, орозомукоида) и цитокинов (TNF-a, INF-g, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10) у больных ИБС и сопоставить полученные результаты с течением заболевания и степенью выраженности атеросклеротического поражения артерий сердца, используя данные коронарографии.
3. Оценить влияние факторов риска – СД 2 типа и ожирения на уровни белков острой фазы воспаления и цитокинов у больных ИБС, сопоставить полученные результаты с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца и объемом поражения коронарных артерий.
4. Определить зависимость уровней маркеров воспаления (СРБ, фибриногена, TNF-a, INF-g, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-) у больных ССЗ от наличия артериальной гипертонии и сопоставить полученные данные с клиническими проявлениями и биохимическими маркерами.
5. Определить взаимосвязь воспалительных показателей у больных ССЗ с нарушениями углеводного и жирового обменов.
6. Определить динамику белков острой фазы воспаления (СРБ, церулоплазмина, С3-компонента комплемента, 1-антитрипсина, гаптоглобина, орозомукоида) и цитокинов (TNF-a, INF-g, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TGF-) у больных острым инфарктом миокарда и выявить взаимосвязь течения и исхода заболевания с воспалительными показателями.
7. Оценить зависимость выраженности воспалительных показателей у больных острым инфарктом миокарда от величины размеров некроза миокарда.
8. Оценить особенности динамики острофазовых белков и цитокинов у больных ОИМ при наличии СД 2 типа и ожирения, выявить влияние факторов риска на течение и исход заболевания.
9. Провести анализ генетических полиморфизмов (гена APOE, гена APOA1, гена ACE, гена IRS1, гена IL-10, гена TNF-) у больных ИБС и оценить их связь с поражением коронарных артерий и течением заболевания.
10. Провести анализ генетических полиморфизмов (гена APOE, гена APOA1, гена ACE, гена IRS1, гена IL-10, гена TNF-) у больных ССЗ с сопутствующими факторами риска – дислипидемией, артериальной гипертонией, СД 2 типа и ожирением. Изучить ассоциацию сопряжения разных полиморфных вариантов генов с факторами риска ССЗ.
11. Провести анализ генетических полиморфизмов (гена APOE, гена APOA1, гена ACE, гена IRS1, гена IL-10, гена TNF-) у больных ССЗ с выраженностью воспалительных реакций.
12. Провести анализ генетических полиморфизмов у больных ОИМ и оценить их связь с течением и исходом заболевания; с наличием сопутствующих факторов риска - сахарного диабета 2 типа и ожирения; с выраженностью воспалительных реакций.
Научная новизна
Впервые у больных с сердечно-сосудистой патологией проведен анализ содержания в плазме крови четырнадцати воспалительных маркеров, представителей острофазовых белков и цитокинов, каждый из которых является многофункциональным, задействован в различных звеньях воспаления и в комплексе наиболее полно отражают течение воспалительного процесса. Полученные результаты выявляют активную роль воспаления в развитии сердечно-сосудистых заболеваний.
Впервые сопоставлен широкий спектр воспалительных показателей у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями с особенностями клинического течения и прогнозом. Выявленные изменения воспалительных показателей позволяют оценить роль факторов воспаления в развитии осложненного течения заболевания и патогенетические предпосылки неблагоприятного исхода.
Впервые сопоставлены уровни цитокинов и белков острой фазы воспаления с данными коронарографии у больных ИБС и установлена зависимость поражения коронарных артерий от цитокиновой активности и показателей острофазового ответа. Результаты наших исследований подтверждают участие воспаления в атеросклеротическом поражении сосудов сердца, активность факторов воспаления в плазме крови больных коррелирует с атеросклеротическим поражением сосудов. При наличии признаков нестабильности атеросклеротической бляшки определяется высокая активность воспалительных показателей. Впервые выявлены маркеры, являющиеся косвенными признаками множественного поражения артерий и нестабильности атеросклеротической бляшки.
Впервые у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями сопоставлены клиническое течение и прогноз заболеваний с факторами риска и маркерами воспаления. Выявлены особенности течения воспалительных процессов при наличии артериальной гипертонии, сопутствующих сахарного диабета 2 типа и ожирения, обуславливающие негативное влияние факторов риска ССЗ на клинические последствия. Выявлена взаимосвязь факторов воспаления с показателями углеводного и жирового обменов. Полученные результаты раскрывают механизмы воздействия факторов риска на развитие ССЗ через воспалительные процессы.
Впервые у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями с сопутствующими факторами риска изучены полиморфизмы шести генов, этиологически связанные с липидным и углеводным обменами, ренин - ангиотензиновой системой и воспалением. Проведена оценка степени взаимосвязи полиморфизмов каждого гена с развитием кардиоваскулярной патологии и ее течением. Проведен анализ сочетания разных полиморфных вариантов генов с факторами риска ССЗ и выявлено сопряжение генотипов гена АСЕ и воспалительного гена IL-10. Выявлена генетическая предрасположенность к развитию сердечно-сосудистых заболеваний у больных с сопутствующими артериальной гипертонией, ожирением и сахарным диабетом 2 типа, обусловленная полиморфизмами воспалительных генов и гена АРОА1.
Практическая значимость
Выявление связи полиморфизмов генов аполипопротеинов , IL-10 и TNF- с течением ишемической болезни сердца и факторами риска ССЗ, позволяет определять на ранних этапах больных с риском развития данной патологии и своевременно проводить профилактические мероприятия.
Выявленная взаимосвязь выраженности воспалительных показателей с атеросклеротическим поражением коронарных артерий и признаками нестабильности атеросклеротической бляшки может быть использована для выявления пациентов с риском множественного поражения коронарных сосудов и острых коронарных событий с дальнейшей профилактикой осложнений, своевременного терапевтического и хирургического лечения.
Выявленные изменения воспалительных показателей у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями могут служить маркерами для определения пациентов с повышенным риском развития осложнений ССЗ и неблагоприятным прогнозом острых коронарных событий. Использование воспалительных маркеров в практической медицине позволит индивидуализировать программу лечения и реабилитации больных ССЗ с учетом риска неблагоприятного течения.
Взаимосвязь маркеров воспаления с течением и прогнозом ССЗ говорит о необходимости принимать во внимание при назначении сердечно-сосудистых препаратов возможность их воздействия на воспалительные процессы, влияя тем самым на течение и исход заболевания.
Раннее развитие ССЗ с тяжелыми клиническими последствиями в группе больных с сахарным диабетом 2 типа и ожирением коррелировало с повышением активности воспалительных процессов у этих пациентов, что должно учитываться при составлении схем лечения этих больных.
Положения, выдвигаемые на защиту
1.Генетическая предрасположенность лежит в основе влияния факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний и воспаления на развитие атеросклероза и его клинические последствия и обусловлена полиморфизмами генов, ответственных за обмен липопротеидов, ангиотензинпревращающего фермента, а так же воспалительных генов IL-10 и TNF-.
2. Развитие воспалительной реакции лежит в основе патогенетического воздействия факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний – сахарного диабета 2 типа, ожирения, артериальной гипертонии и дислипидемии на атеросклеротическое поражение сосудов, активность которой, определяемая по уровням острофазовых белков, компонентов системы комплемента, про- и противовоспалительных цитокинов, имеет свои особенности при каждом факторе риска.
3. Выраженность воспалительной реакции у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, оцениваемая по уровням маркеров воспаления, отражает степень атеросклеротического поражения коронарных артерий и обуславливает клинику, течение и прогноз заболеваний.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, из них 17 статей в центральных рецензируемых журналах, 2 – в зарубежных изданиях, 1 – авторское изобретение.
Апробация работы
Апробация работы состоялась 3 июля 2008 года на межкафедральной научно-практической конференции кафедр поликлинической терапии Московского факультета, госпитальной терапии Московского факультета, факультетской терапии Педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, кафедры клинической фармакологии РМАПО, ФГМУ Медицинский центр при Спецстрое России, отделений кардиологии и кардиореанимации 13 ГКБ.
Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на всероссийских конгрессах Российского научного общества кардиологов (2006, 2007, 2008 гг), «Человек и лекарство» ( 2005, 2006, 2007, 2008 гг), I Национальном конгрессе терапевтов (2006), международной конференции «Здоровье и образование XXI в веке» ( 2006, 2007 гг), Всероссийском научном форуме «КАРДИОЛОГИЯ» (2006, 2008 гг), Международной научно-практической конференции «Современные аспекты метаболического синдрома – взгляд в будущее» (2006), Всероссийской ежегодной научно-практической конференции «Актуальные вопросы военной и практической медицины» (Оренбург, 2007 г), Съезде кардиологов и терапевтов центра России (Рязань, 2008 г), межрегиональной конференции «Сочетанные заболевания внутренних органов в терапевтической практике» (Иркутск, 2008 г), конгрессе International Congress Inflammation (Vena, Austria,1993).
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), содержит выводы, практические рекомендации и указатель литературы, включающий 428 ссылки на 88 отечественных и 340 зарубежных источников. Работа изложена на 290 страницах машинописного текста, иллюстрирована 95 таблицами и 90 рисунками.
Белки острой фазы воспаления и их роль в патогенезе заболеваний
К БОФ относятся около 30 белков плазмы. Белки острой фазы являются в первую очередь ингибиторами и дезактиваторами тех ферментов, которые высвобождаются при деструкции клеток и могут приводить к вторичному повреждению ткани (390).
Среди БОФ выделяют следующие группы: белки-медиаторы, белкиг-ингибиторы, транспортные, иммунорегуляторы, репараторы резорбаторы.
Один белок по своим функциональным свойствам может относиться сразу к несольким группам. Роль этих белков в воспалении различна. Так, С-реактивный белок участвует в связывании липидов и липопротеидов низкой плотности, активации комплемента, взаимодействии Т- и В-лимфоцитов.
В зависимости от динамики уровня белка при воспалительной реакции выделяют позитивные и негативные белки. Концетрация позитивных белков в плазме, как правило, повышается более, чем на 25%, а негативных наоборот снижается. Представителями позитивных белков являются орозомукоид, a 1-антитрипсин, гаптоглобин (Нр), церулоплазмин (ЦП), фибриноген, С-реактивный белок (СРБ). Негативные белки - альбумин, трансферрин, липопротеины низкой и очень низкой плотности (70).
Орозомукоид (ОР) ингибирует Т-лимфоциты, активирует пролиферацию фибробластов, связывает коллаген. Показана диагностическая и прогностическая роль БОФ при различных заболеваниях. Нпример железосодержащие белки, комплексирующиеся с гемоглобином, являются ранним маркером многих воспалительных процессов и микробных поражений. При изучении БОФ и иммуноглобулинов А, М, G у больных туберкулезом выявлена корреляция показателей между собой, с диаметром кожной пробы, течением заболевания (76, 180).
Повышение компонентов комплемента, церрулоплазмина, С-реактивного белка отмечалось в эксперименте при неспецифическом воспалительном процессе в легких.
При изучении спектра БОФ и гуморального иммунитета у больных с нарушением мозгового кровообращения выявлено их прогностическое значение, тесная корреляция показателей между собой и с обширностью -поражения.
В то же время при использовании БОФ для определения прогноза ; больных ревматоидным артритом прогностической значимости не было выявлено.
Для суждения о течении репаративных процессов у больных ИМ предлагают использовать изменение концентрации глико - и мукопротеидов, как адекватно отражающих течение воспалительной макрофагальной реакции ИМ, а метаболиты коллагена (оксипролин) формирование постинфарктного рубца. У больных ИМ в остром периоде выявлены лейкопоэтические изменения крови, которые коррелировали со степенью поражения и отличались от таковых при стенокардии. При изучении белкового спектра плазмы крови больных ИМ отмечают изменения их фракций: снижение суммарного количества преальбуминов, снижение альбуминовой фракции, увеличение пост-альбуминов и медленно-движущихся фракций гаптоглобинов, снижение бысто-движущихся фракций гаптоглобинов. В то же время обще количество белков значительных изменений не претерпевает (26,58). Существуют немногочисленные работы по исследованию прогностической значимости БОФ при ИМ. Описывается трехфазность изменений уровня БОФ при данном заболевании. В первой фазе происходит повышение СРБ, ОР, ЦП, ингибиторов протеаз, антихимотрепсина, Нр и фибриногена, достигающих максимума к 5 дню и нормализующихся при благоприятном исходе к концу 3-ей недели. Вторая фаза — снижение на 5 сутки и нормализация к концу 3-ей недели отрицательных острофазных белков - альбумина, трансферина и др. Третья фаза - постепенное увеличение концентраций церулоплазмина и СЗ-компонента комплемента с максимумом в конце 2-ой недели. В то же время другие авторы отмечают пик церулоплазмина и СЗ-компонента комплемента к 5 дню ИМ и не выявляют достаточной корреляции между уровнем БОФ и ферментами ИМ (55,80).
При определении зоны некроза по фракции ЛДГ и сопоставлении с уровнями гаптоглобина, а 1-антитрипсина (al-AT), OP, СРБ, фибриногена и других белков, выявлены высокие коэффициенты корреляции (186).
Все виды тканевого повреждения заканчиваются репарацией. Инициатором этого процесса является СРБ, который запускает комплементный каскад, происходит элиминация обломков клеток, а затем под контролем ингибиторов протеаз воссоздание соединительной ткани. ОР способствует росту фибробластов и связыванию коллагена. СРБ является представителем сразу нескольких функциональных групп острофазовых белков: медиаторов, транспортных белков, иммунорегуляторов. В последние годы вновь возрасло внимание к СРБ, это связано с расшифровкой структуры и биологических свойств данного белка (397,414). В противоположность всем другим белкам острой фазы СРБ не содержит углеводного компонента, т.е. является негликозилированным белком. СРБ активирует комплемент так же эффективно, как и антитела класса G, и таким образом может вызывать воспалительные, литические и опсонические эффекты коплемента (338). Обнаружено участие этого белка в регуляции функции иммунокомпетентных клеток (395). СРВ активирует моноциты, регулирует функцию нейтрофилов, осуществляя контроль потенциальной цитотоксичности нейтрофилов, повышает фагоцитоз нейтрофильных частиц. На ранних этапах воспаления СРВ является элементом механизма активации макрофагов, индуцируя хематаксис и выработку супероксида. С-РБ выполняет защитную функцию в организме, блокируя продукцию медиаторов воспаления, связывая фосфолипиды мембран (275, 413). В то же время другими авторами отмечается возможность ингибирования хемотаксиса, дгрануляции, фагоцитоза и иммцносупрессивное действие СРВ. СРВ способствует удалению фрагментов поврежденных клеток и продуктов их распада за счет связывания с липопротеидами низкой (ЛПНП) и относительно низкой плотности (283, 297, 371). В организме больных СРВ образуют устойчивые комплексы с ЛПНП, откладываясь в определенных депо, в частности в стенках сосудов (268, 327). Образованные комплексы начинают активно поглощаться макрофагами, накапливаясь в их вакуолях, вследствии чего макрофаги превращаются в ; пенистые клетки. Патологический процесс в стенке сосуда усугубляется усилением местной воспалительной реакцией, сопровождающейся продукцией монокинов и активных радикалов.
Определение острофазовых белков (орозомукоида, церулоплазмина, а 1-антитрипсина, С-реактивного белка, гапто глобина, С3 компонента комплемента) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини
Определение белков острой фазы (БОФ) возможно биохимическими и иммунохимическими методами. Раньше в основном определяли биохимическими методами. Однако он наиболее трудоемок и сложен в воспроизведении результатов. Между биохимическим и иммунохимическим методами выявлена высокая степень корреляции (4). Радиальная иммунодиффузия по Манчини (48) один из наиболее широко используемых в настоящее время методов для количественного определения белков плазмы крови человека. Для БОФ также используют электроиммунодиффузию, но СРБ. имеет отрицательную подвижность за счет взаимодействия с ионами буферного раствора и орозомукоид -вследствии появления десиалированных форм, имеющих иную электрофоретическую подвижность. В последнее время получил распространение метод лазерной нефелометрии, основанный на измерении мутности, возникающей при реакции АГ - AT.
Мы остановились на методе определения БОФ по способу радиальной иммунодиффузии по Манчини. Метод основан на образовании радиальной иммунопреципитации в смеси агаровый гель - антисыворотка к определенному белку с испытуемой сывороткой. Содержание белка определяют по отношению к стандартной сыворотке с известной концентрацией белка (42).
Аппаратура и реактивы: водяная баня, стеклянные пластины 9x12, П-образные рамки толщиной 1 мм, игла - пробойник с диаметром 2 мм, пробирки, пипетки, микрошприц на 2 мкл, агар «Дифко», краситель амидочерный, стандартные сыворотки Standart-Human-Serum «Behring», моноспецифические сыворотки против БОФ: OP, al-AT, Сз компонент комплемента (СЗ), СРБ, полученные в институте микробиологии и эпидемиологии им.Габричевского; ЦП (Human-Coeruloplasmin «Behring»), спирт, эфир, веронал, мединал, уксусная кислота, физиологический раствор. При повторном исследовании БОФ в 2007 году использовались антисыворотки к ОР производства фирмы «Sigma» (США) и калибратор белков плазмы крови производства фирмы «Sentinel» (Италия, СРБ стандарт «Human» (Германия).
Ход реакции: приготовляют веронал-мединаловый буфер рН 8,6, 2% агарозу. При Т - 56С смешивают агарозу и вероналмединаловый буфер с растворенной в нем предварительно антисывороткой к БОФ в соотношении 1:1, общий объем составляет 8 мл. Стеклянные пластинки размером 9x12, предварительно обезжиривают смесью Никифорова и покрывают равномерным слоем смеси агар-антисыворотка. Для этого на стеклянную пластинку помещают П-образную рамку, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, зажимают зажимами. Пространство между стеклами заливают смесью агар-антисыворотка. После застывания агарозы с антисывороткой, снимают верхнее стекло. В слое агарозы с помощью пробойника вырезают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм друг от друга. На каждом стекле размещается 30 лунок. В лунки 1 ряда вносят микрошприцом по 2 мкл стандартной сыволротки не разведенной и в разведении 1:2, 1:4, 1:8 для построения калибровочной кривой. Остальные лунки заполняют исследуемой сывороткой. Пластины с заполненными сывороткой лунками помещают во влажную камеру на 24 часа. После инкубации пластины промывают физиологическим раствором, высушивают и окрашивают амидочерным раствором. Измеряют диаметр колец преципитации. Строят калибровочную кривую по диаметру колец стандартной сыворотки. По калибровочной кривой определяют процентное содержание белка в каждой сыворотке. Зная содержание БОФ в стандартной сыворотке, определяем количество БОФ в исследуемой сыворотке. Исследование уровня СРБ в клинике проводилось иммунотурбидиметрическим методом с помощью тест-карт фирмы BioSistem (Испания), нижний предел обнаружения 0,25 мг/л.
2.4. Определение цитокинов (IL-4, IL-6, IL- 8, IL-10, IL-12, TGF-P, TNF-a, INF-y) методом твердофазного иммуноферментного анализа (проводилось в лаборатории иммуногенетики РАМН (зав.лабораторией -д.м.н. А.Л.Пухальский) и в лаборатории ФГМУ Медицинскиого центра при Спецстрое России).
Материалы и оборудование: полуавтоматические пипетки, прибор для встряхивания, рамки со стрипами, спектрофотометр, мерные цилиндры. Использовались наборы реактивов для иммуноферментного анализа цитокинов человека фирмы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург).
Принцип работы набора: в наборах использовались «сендвич»-варианты твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к исследуемому интерлейкину. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе коньюгировано с биотином. На первой стадии анализа интерлейкин, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный интерлейкин взаимодействует с коньюгатом вторых антител - биотин. Количество связавшегося коньюгата прямо пропорционально количеству интерлейкина в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу. Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченных антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация IL в определяемых образцах. 2.5. Расчет зоны некроза миокарда по данным мониторирования КФК.
Существует ряд методов определения размеров зоны некроза при инфаркте миокарда. Прекардиальное электрокардиографическое картирование сердца используется при остром инфаркте миокарда передней и переднебоковой стенок левого желудочка. Результаты сопоставления электрокардиографических признаков с данными вскрытия показывают, что трансмуральный инфаркт миокарда может не сопровождаться формированием зубца Q (QS), тогда как при субэндо-кардиальном некрозе зубец Q регистрируется у значительной части (по некоторым данным, до 50 %) больных. Существует ряд заболеваний и синдромов, при которых электрокардиограмма «симулирует» инфаркт миокарда
Нуклидные методы исследования: метод основан на сцинтиграфии с талием. При сканировании сердца выявляются зоны, в которых талий не фиксируется. Недостатком является невозможность дифференцировать острый инфаркт от старых рубцовых изменений.
Второй метод - это сцинтиграфия с пирофосфатом, меченым технецием. Метод основан на том принципе, что пирофосфат связывает ионы кальция внутри функционирующих миокардиоцитов. При сцинтиграфии выявляются поля фиксации пирофосфата, которые содержат участки некроза. Б рубцовых участках миокарда кальция нет, следовательно, там фиксации пирофосфата не происходит.
Корреляционный анализ воспалительных показателей у больных артериальной гипертонией
При проведении корреляционного анализа между изучаемыми показателями, отражающими жировой обмен и воспалительными показателями были получены следующие данные:
1. ВЖТ и фибриногеном (г = 0,4, р 0,05),
2. ВЖТ и IL-10( г = -0,3, р 0,09).
У больных АГ выявлялись тесные корреляционные связи между про- и противовоспалительными цитокинами:
1. IL-6 и TNF-a (г = 0,4, р 0,01),
2. IL-6 и IL-8 (г = 0,3, р 0,02),
3. IL-6 и IL-10 (г = 0,3, р 0,06),
4. IL-8 и СРБ (г = 0,63, р 0,01).
У больных с АГ без нарушений углеводного обмена корреляционные взаимосвязи выявляются в меньшей степени, чем в общей группе пациентов и в основном связаны с массой тела пациентов: 1 .ИМТ и TNF-a (г = 0,4, р 0,06),
2. ИМТ и IL-4 (г = 0,4, р 0,05),
3. общая жировая ткань и TNF-a (г = 0,46, р 0,06),
4. IL-6 и IL-10 (г = 0,43, р 0,05),
5. IL-4 и IL-8 (г = 0,7, р 0,001). У пациентов с нарушениями углеводного обмена наблюдались корреляционные связи различной силы воспалительных показателей с показателями углеводного и липидного обменов, а так же СРБ с интерлейкинами:
1. стимулированная глюкоза и TNF-a (г = 0,69, р 0,01),
2. стимулированная глюкоза и IL-4 (г = 0,64, р 0,05),
8. СРБ и фибриноген (г = 0,4, р 0,1),
9. СРБ и IL-4 (г = 0,5, р 0,05),
10. СРБ и IL-6 (г = 0,43, р 0,07),
11. СРБ и IL-8 (г = 0,88, р 0,001),
У пациентов с различными нарушениями углеводного обмена так же наблюдались корреляционные связи между цитокинами (таблица 28).
Длительность течения АГ оказывала влияние на корреляционные связи между цитокинами. На ранних стадиях связи были более сильными, при длительности АГ более 5 лет корреляция между цитокинами ослабевала, однако отмечалась между большим числом показателей (таблица 29).
При изучении показателей инсулина у больных артериальной гипертонией гиперинсулинемия натощак была выявлена у 52% пациентов, из них у 20% не было признаков нарушения углеводного обмена (НТУ, СД 2 типа, гипергликемии). Инсулинорезистентность по НОМА IR определялась у 76% пациентов, по индексу Саго - у 32%. Пациенты двух -групп статистически достоверно отличались по показателям НОМА IR: в 1 группе 5,06 во 2 группе - 3,2. Инсулинорезистентность (ИР) так же была выявлена у пациентов без нарушений углеводного обмена. Показатели во 2 группе были выше пограничных значений для диагностики (2,77). По средним показателям индекса Саго отличий выявлено не было (0,5 + 0,23 и менее 0,33) При анализе взаимосвязей была выявлена корреляция между гиперинсулинемией и ИР: 1 .инсулин и С-пептид (г = 0,5, р 0,05),
2. НОМА IR и С-пептид (г = 0,5, р 0,05),
3. НОМА IR и инсулин (г = 0,96, р 0,01),
4. индекс Саго и С-пептид (г = - 0,46, р 0,05),
5. индекс Саго и инсулин (г = - 0,65, р 0,01).
При анализе взаимосвязи гиперинсулинемии и инсулинорезистентности с воспалительными показателями были получены следующие данные: 1 .инсулин натощак и СРБ (г = 0,44, р 0,05),
2. индекс Саго и фибриноген (г = - 0,6, р 0,01),
3. индекс Саго и СРБ (г = - 0,31, р 0,17),
4. индекс Саго и IL-6 (г = - 0,34, р 0,17),
5. индекс Саго и TNF-a (г = - 0,33, р 0,18).
Влияние факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний на воспалительные процессы и течение острого инфаркта миокарда
Данные госпитального мониторирования БОФ при ОИМ выявили достоверные повышения уровней исследуемых показателей в сравнении с больными ИБС без некроза миокарда. Степень подъема уровней БОФ соответствовала имеющимся литературным данным при других стимулирующих факторах: воспаление, инфекция, травма, злокачественный рост и др. (44, 55, 81). Динамика БОФ в госпитальном периоде ОИМ характеризовалась постепенным подъемом уровней БОФ, начиная с первых суток заболевания с максимальными цифрами к 7 суткам заболевания и постепенной нормализацией к 21-28 дню ОИМ. Сходная динамика изучаемых БОФ наблюдается при воспалительных реакциях, инициируемых другими факторами. Это говорит о том, что, несмотря на небольшой размер тканевого повреждения при ОИМ, в организме происходят значительные изменения на различных органных и системных уровнях, направленные на нивелирование некроза, по-видимому, реакция является неспецифической и не зависит от природы повреждающего агента.
При анализе провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-12, INF-y отмечалось повышение их уровня начиная с первых суток заболевания. Цитокины IL-12 и INF-y достигали максимального подъема к 7 суткам заболевания, IL-6 - к 14 суткам инфаркта миокарда, IL-8 - к 21 суткам. Снижение уровней цитокинов IL-6, IL-12, INF-y происходило к 21 суткам инфаркта миокарда. Оценивая динамику провоспалительных цитокинов, можно отметить ее сходство с полученной нами динамикой острофазовых белков при ИМ. Это соответствует данным развития воспалительного ответа при других инициирующих факторах и подтверждает тесную взаимосвязь компонентов воспалительной реакции (4,60). Цитокины непосредственно участвуют в регуляции воспалительной реакции, обладают синергичным и перекрестным взаимодействием (300, 304). IL-6 служит индуктором синтеза ряда БОФ, в том числе СРБ и СЗ-компонента комплемента, поэтому его подъем с первых суток ОИМ подтверждает его регуляторную функцию. Активность IL-8, вызывающего стимуляцию лизосомальных ферментов нейтрофилов и стимуляцию ангиогенеза, определяет его функцию регулировать фагоцитоз непосредственно в зоне некроза с последующими репаративными функциями. Динамика IL-12 и INF-y синергична и связана со способностью IL-12 усиливать синтез INF-у ,который в свою очередь способен так же активировать макрофаги в отношении некротизированных тканей (77).
В динамике противовоспалительных цитокинов отмечался подъем IL-4 и IL-10 с первых суток ОИМ, с пиком к 7 суткам IL-10 и его последующим резким снижением, повышение IL-4 наблюдалось до 14 суток с последующей резкой нормализацией. В общей картине развития противовоспалительной активности цитокинов обращает на себя внимание их резкое снижение после достижения максимальных значений. Такая динамика, по-видимому, связана с тем, что на определенном этапе возникает необходимость торможения воспалительных реакций с постепенным переходом к репаративным процессам. В этом случае процесс регулируется противовоспалительными цитокинами. IL-4 блокирует продукцию основных воспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a и ингибирует активацию макрофагов и моноцитов. IL-10, в свою очередь, ингибирует INF-y, а так же IL-6, IL-12, TNF-a.
Подъем TGF-P достигал максимума к 14 суткам инфаркта миокарда и в госпитальном периоде нормализация показателя не наблюдалась. Очевидно, что такая динамика связана с тем, что TGF-P в большей степени ингибирует не цитокины, а лимфоциты и БОФ: Нр, ЦП, СРБ, OP, а2 макроглобулин. Кроме того, его действие сопряжено с репаративной функцией, в случае инфаркта миокарда - с формированием рубца.
Цитокиновая сеть саморегулируется и изменение продукции каждого из цитокинов неизбежно приводит к нарушению синтеза других участников воспалительного процесса, что в целом ведет развитию гипер или гипореактивности воспаления (316). При изучении уровней БОФ у больных с осложненным течением ОИМ (нарушения ритма и проводимости, рецидивирующее течение, недостаточность кровообращения) были выявлены более высокие уровни показателей, чем 217 при благоприятном течении заболевания. Одновременно наблюдалась задержка нормализации уровней БОФ. Учитывая, что значения уровней БОФ зависят от характера воспалительного процесса в миокарде (12, 26), можно предположить, что одна из причин более тяжелого течения ОИМ, является гиперреактивность острофазового ответа и нарушение репаративных процессов в миокарде. С другой стороны, поскольку большинство БОФ являются ингибиторами и дезактиваторами ферментов(14, 22), освобождающихся при деструкции клеток, уровень их, по-видимому, и определяется величиной поражения, приводящего к их появлению. Это подтверждается данными клинических исследований о зависимости осложнений ОИМ у больных в зависимости от размеров некроза миокарда (9). В свою очередь, нами так же выявлена корреляционная зависимость уровней БОФ с размерами инфаркта.
