Введение к работе
Актуальность проблемы: Широкая распространенность онкологических заболеваний, их медицинская, социальная и экономическая значимость, делают проблемы изучения механизмов онкогенеза и терапии злокачественных опухолей одними из ключевых в современном здравоохранении. В Российской Федерации, по данным ГУН НИИ Онкологии им. проф. Н.Н. Петрова (г. Санкт-Петербург), ежегодно регистрируются злокачественные опухоли приблизительно у 470 000 человек, при этом отмечается неуклонный рост данного показателя во всех возрастных группах у мужчин и у женщин. Согласно прогнозам, количество впервые диагностируемых случаев заболеваний новообразованиями к 2010 году достигнет во всём мире 14 – 19 млн. ежегодно (Мерабишвили В.М., 2007). Значительную долю из них будут составлять лимфопролиферативные болезни, в том числе, лимфомы различных типов, степени злокачественности и устойчивости к противоопухолевой терапии, имеющие большой удельный вес в структуре онкопатологии и в настоящий момент (Байков В.В., 2007; Greenlee R.T. et al., 2000; Prijck B.De. et al., 2007).
При этом, по некоторым неопластическим заболеваниям наблюдаются выраженные половые различия (Ernberg I., 2006). Так, показатели онкозаболеваемости по органам системы пищеварения у женского населения значительно ниже, по сравнению с мужским населением (27,7 % и 34,0 % соответственно). Аналогичная картина наблюдается при исследовании дыхательной системы, где заболеваемость мужчин приблизительно в 6 раз превышает таковые показатели у женщин (Мерабишвили В.М., 2006). В тоже время, по целому ряду нозологических форм (рак желудка, рак прямой кишки, миеломная болезнь и др.) половых различий практически не наблюдается (Мерабишвили В.М., 2006; Обрезан А.Г. и др., 2007). Таким образом, изучение зависимости развития опухолей от пола индивидуума представляется весьма актуальным.
Несмотря на определённую автономность, злокачественные клетки находятся в тесном взаимодействии с защитными системами организма и испытывают их постоянное воздействие (Барышников А.Ю., 2003; Васильев А.Г., 2000). Одной из таких систем является система гемостаза. Имеющиеся сообщения, в основном, указывают на то, что различные неопластические процессы по мере своего развития могут приводить к серьёзным изменениям функционирования системы гемостаза организма, клинические проявления которых (тромбозы и эмболии) являются второй по частоте причиной смерти и инвалидизации больных в экономически развитых странах и существенно увеличивают стоимость проводимого лечения (Аяпбергенова Г.О., 2009, Levine M. et al., 1997; Prandoni P. et al., 2005; Remiszewski P. et al., 1999).
Показано, что вероятность возникновения тромбоза у больных онкологического профиля в 10 – 100 раз выше, по сравнению с пациентами с другими заболеваниями (Конев В.Г. и др., 2005; Luzzato G., Schafer A.I., 1990). Наличие онкопатологии рассматривается как фактор высокого риска тромбозов и тромбоэмболических осложнений (ТЭО), что имеет большое значения для тактики терапии (Ходоренко С.А. и др., 2008; Prandoni P., 1997). И, наоборот, тромбозы могут являться первым маркером развивающейся опухоли. Так, частота выявления онкологического заболевания после эпизода идиопатического тромбоза в среднем составляет 2 – 5 % и зависит от локализации и гистологического типа опухоли (Blom J.W. et al., 2005; Falanga A., Rickles F. R., 1999). Одними из наиболее часто упоминаемых злокачественных опухолей, приводящих к подобным нарушениям, являются лимфомы (Баркаган З.С., 2001).
Однако вероятно, характер взаимодействия в паре гемостаз организма – опухоль двусторонен и, в свою очередь, гемостатические и антигемостатические механизмы способны оказывать влияние на течение опухолевого процесса, ускоряя или замедляя его. В настоящее время возлагаются большие надежды на возможность изменения характера развития неопластического образования путем воздействия на его окружение, в том числе и на систему гемостаза.
Анализ опубликованных данных экспериментальных исследований и клинических наблюдений, в основном, указывает на значительное прямое влияние коррекции системы гемостаза антиагрегантами и антикоагулянтами, прежде всего низкомолекулярными гепаринами, на течение заболевания и общую выживаемость онкологических пациентов, однако механизмы этого явления до конца не понятны. Несмотря на большое количество работ, посвящённых рассматриваемому вопросу, комплексное изучение нарушений системы гемостаза при развитии злокачественных опухолей не проводилось и механизмы воздействия гемостатических механизмов, в том числе при их фармакологической коррекции, на новообразование остаются не ясными.
Всё вышеизложенное определяет актуальность настоящих исследований.
Цель исследования: комплексное исследование особенностей состояния системы гемостаза при развитии неопластического процесса и влияние ее изменений на рост опухоли на модели перевиваемой лимфосаркомы Плисса (ЛФС).
Задачи исследования:
-
Разработать методику перевивки ЛФС, дающую в 60 – 80 % случаев успешную перевиваемости опухоли, что позволит с большой точностью анализировать получаемые в ходе основных серий экспериментов данные;
-
Исследовать половые особенности при перевивке ЛФС;
-
Исследовать особенности состояния системы гемостаза (сосудистый, клеточный и плазменный компоненты) крыс при развитии ЛФС;
-
Проанализировать эффективность воздействия на рост и развитие ЛФС лекарственных препаратов, влияющих на параметры системы гемостаза: антикоагулянтов прямого действия (низко- и среднемолекулярных гепаринов), прокоагулянтов, препаратов улучшающих микроциркуляцию.
Научная новизна и теоретическая значимость работы: Впервые проведено комплексное исследование изменений системы гемостаза при развитии ЛФС и влияния гемостатических механизмов на рост и развитие опухоли по 9 параметрам (количество циркулирующих эндотелиоцитов и тромбоцитов, адгезионная и агрегационная способности тромбоцитов, активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, время рекальцификации плазмы, концентрация фибриногена и уровень растворимых комплексов мономерного фибрина в плазме крови).
Установлено, что развитие ЛФС сопровождается нарушением функционирования всех компонентов системы гемостаза, проявляющимся эндотелиальной дисфункцией, активацией клеточного компонента и гиперкоагуляцией.
Показано, что рост и развитие ЛФС зависят от дозы перевиваемого опухолевого материала и пола животного, при этом самки крыс обладают большей устойчивостью к развитию лимфосаркомы. Впервые определено минимальное количество клеток ЛФС, дающее воспроизводимый рост опухоли в 60 – 80 процентов случаев, что имеет большое значение для экспериментальных исследований в различных областях клинической и фундаментальной онкологии.
Впервые проведен анализ воздействия на состояние системы гемостаза у животных с перевиваемой ЛФС лекарственных препаратов, применяющихся в онкологической практике (антикоагулянты, препараты улучшающие микроциркуляцию) и их антагонистов (прокоагулянты). Полученные на модели лимфосаркомы Плисса данные свидетельствуют о том, что разнонаправленные воздействия на систему гемостаза оказывает значительное влияние на развитие неопластического процесса.
Применение антикоагулянтов прямого действия увеличивает вероятность успешной перевивки ЛФС («прививаемость») и ускоряет течение опухолевого процесса. Прокоагулянты, напротив, значительно снижают прививаемость ЛФС и замедляют развитие лимфосаркомы. При введении препаратов, улучшающих микроциркуляцию (ксантинола никотинат и пентоксифиллин), показано, что рост ЛФС зависит не только от их способности к коррекции нарушений гемостатических механизмов, но и от других фармакологических свойств препарата, возможно, напрямую тормозящих развитие лимфосаркомы Плисса (пентоксифиллин).
Практическая значимость: Полученные данные уточняют представления о характере изменений системы гемостаза при развитии лимфосаркомы Плисса. Показано, что рост ЛФС сопровождается активацией системы гемостаза подопытных животных. Установленный факт дисфункции гемостатических механизмов при ЛФС позволяет использовать эту модель опухолевого роста при изучении паранеопластического синдрома Труссо.
Выявленная высокая частота успешной перевивки ЛФС при применении антикоагулянтов прямого действия является основанием для инициации комплексного клинического и экспериментального исследования о целесообразности массового применения этих препаратов при злокачественных опухолях любых локализации и гистологического типа.
Внедрение в практику: Результаты диссертационного исследования используются на кафедре патологической физиологии с курсами теоретической иммунопатологии и медицинской информатики ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава в научно-исследовательской работе и при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами III – VI курсов.
Апробация работы: Основные положения работы доложены на Межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, ГОУ ВПО СПбГМУ им. И.П. Павлова, 2007, 2008, 2009) и обсуждены на Всероссийской научно–практической конференции «Посттромботическая болезнь» (Санкт-Петербург, СПбГУ, 2009).
Публикации: По теме диссертационного исследования опубликованы 9 научных работ.
Структура диссертации: Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 9 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 5 глав с изложением результатов собственных исследования, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и библиографического указателя, включающего 212 литературных источников, из них 142 отечественных и 70 иностранных авторов.
Степень личного вклада в результаты исследования: Весь материал, представленный в диссертации, получен, систематизирован и проанализирован лично автором. Автором осуществлен анализ научной литературы по теме диссертационного исследования за последние 15 лет, проведены эксперименты по перевивке лимфосаркомы Плисса подопытным животным и определению состояния системы гемостаза в норме и в условиях развития опухолевого процесса. Результаты исследования статистически обработаны, проанализированы и описаны лично автором. Работа выполнена на кафедре патофизиологии c курсами теоретической иммунопатологии и медицинской информатики ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава.
Положения, выносимые на защиту:
-
При перевивке лимфосаркомы Плисса выявлена прямая зависимость частоты успешной перевивки опухоли и темпов ее роста от дозы перевиваемого опухолевого материала. Доза 550 (225) клеток/животное обеспечивает успешную перевивку опухоли у 84 (27) % крыс-самцов и 68 (25) % крыс-самок.
-
Пол животного играет значительную роль в развитии лимфосаркомы Плисса: частота успешной перевивки опухоли и темпы ее роста при использовании одинаковой перевивочной дозы у самок крыс значительно меньше чем у самцов.
-
В ходе развития перевиваемой лимфосаркомы Плисса происходит постепенное формирование дисфункции гемостатических механизмов, затрагивающее все компоненты системы гемостаза, в основном направленное на активацию процессов тромбообразования и свертывания крови.
-
Воздействуя на систему гемостаза крыс, можно оказывать влияние на развитие перевиваемой лимфосаркомы Плисса: уменьшение прогемостатического потенциала крови антикоагулянтами прямого действия и препаратами, улучшающими микроциркуляцию повышает частоту успешных перевивок («прививаемость») и ускоряет темпы роста опухоли; стимуляция системы гемостаза протамина сульфатом наоборот способствует снижению прививаемости опухоли и замедлению темпов ее роста.
-
Применение пентоксифиллина, препарата, улучшающего микроциркуляцию, корректируя нарушения системы гемостаза крыс, которым перевита лимфосаркома Плисса, одновременно ингибирует развитие опухоли в организме подопытных крыс.
Характеристика клона лимфосаркомы Плисса
Использованы 541 самец и 240 самок белых крыс с массой тела 185–200 г, разведения ГП «Рапполово». Для поддержания опухоли и предварительного определения необходимого объема опухолевого материала использовались ещё 540 животных разного пола. Питание и содержание крыс соответствует нормам «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» согласно приказа МЗ СССР № 1179 от 10 октября 1983 г. Экспериментальная работа проводится в соответствии с морально-этическими требованиями.
Клон лимфосаркомы Плисса (ЛФС) поддерживается путем перевивки крысам опухолевого материала подкожно на боковой поверхности туловища в дозе 0,2 мл гомогената ткани опухоли в 0,2 мл физиологического раствора.
Наблюдение за развитием ЛФС ведется по следующим критериям: 1. процент животных в группе, у которых сформировался опухолевый узел – «прививаемость», 2. срок появления пальпируемого первичного опухолевого узла (сутки), 3. динамика роста узла – определяется по увеличению объема опухолевого узла (см3) на 1, 5, 9, 13 и 15 сутки от момента выявления ЛФС, 4. срок гибели подопытных животных (сутки). При указанном объеме опухолевого материала ЛФС возникает в 100% случаев вне зависимости от возраста и пола и животного. Первичный пальпируемый узел возникает на 5,5±0,9 сутки (n = 181). Средняя продолжительность жизни крысы после перевивки ЛФС в указанной дозе составляет 17,3±3,97 дня (n = 181).
Исследование зависимости развития лимфосаркомы Плисса от количества перевиваемых опухолевых клеток и пола животного
Работа выполнена работа на 511 половозрелых крысах, 271 самце и 240 самках. Ткань опухоли смешивали с физиологическим раствором, гомогенизировали и производили подсчет опухолевых клеток в единице объема в камере Горяева. Полученную взвесь, содержащую 22000, 11000, 5500, 2250, 1500 клеток в 1 мл, вводили крысам-самкам, поделенным на пять групп, в подкожную клетчатку правого бока в объеме 0,1 мл. Пяти группам крыс-самцов перевивка ЛФС производится аналогичным образом по 0,1 мл в разведениях 11000, 5500, 2250, 1500, 750 клеток в 1 мл.
Исследование системы гемостаза
и ее коррекции при развитии лимфосаркомы Плисса
Обследованные группы крыс (самцы):
-
группа «контроль» – для исследования параметров системы гемостаза в норме у крыс (n = 20).
-
группа «ЛФС» – животные, с перевиваемой ЛФС (стандартная доза опухолевого материала - 550 клеток на крысу) (n = 35).
-
группа «воспаление» – группа крыс с моделированием воспалительного процесса путем подкожного введения 5% взвеси клеток селезенки в физиологическом растворе полученной от живых доноров с целью исключения влияния эффектов воспаления на параметры системы гемостаза (n = 20).
-
группа «физ. раствор» – животные с перевиваемой ЛФС, которым на протяжении 7 суток подкожно вводится физиологический раствор в объеме 0,1 мл с целью исключения влияния неспецифических эффектов систематического введения лекарственных препаратов на параметры системы гемостаза при развитии опухоли (n = 35).
-
группа «Клексан» – животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится НМГ (Клексан) в дозе 150 МЕ/кг в течение 7 суток от момента перевивки ЛФС однократно подкожно (n = 35).
-
группа «Гепарин» – животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится СМГ (Гепарин натрий) в дозе 500 МЕ/кг в течение 7 суток от момента перевивки ЛФС два раза в сутки (по 250 МЕ/кг) подкожно (n = 35).
-
группа «Пентоксифиллин» – животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится пентоксифиллин в дозе 10 мг/кг в течение 7 суток от момента перевивки ЛФС однократно внутривенно (n = 35).
-
группа «Ксантинол» – животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится ксантинола никотинат в дозе 6 мг/кг в течение 14 суток от момента перевивки ЛФС однократно внутримышечно (n = 35).
-
17 группа «Протамин» – животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится протамина сульфат в дозе 6 мг/кг в течение 3 суток от момента перевивки ЛФС однократно внутривенно (n = 35).
Взятие крови у подопытных животных и ее обработка
Взятие крови осуществляли в вакуумные системы с цитратным антикоагулянтом путем пункции сердца крысы под эфирным наркозом. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы производили центрифугирование крови с ускорением 240 g в течение 7 минут и последующим перенесением плазмы в другую пробирку. Обедненную тромбоцитами плазму получали из обогащенной путем центрифугирования с ускорением 1200 g в течение 15 минут.
Диагностика нарушений системы гемостаза
Оценку состояния системы гемостаза проводили по 9 параметрам на 3 и 15 сутки, после перевивки опухоли. Определяли: концентрацию циркулирующих эндотелиоцитов и тромбоцитов, адгезивную способность тромбоцитов, агрегационную активность тромбоцитов, активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, время рекальцификации плазмы, концентрацию фибриногена и уровень растворимых комплексов мономерного фибрина в плазме крови (качественный этаноловый тест).
Методы статистической обработки экспериментальных данных
Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакета программ статистической обработки данных SPSS for Windows 13.0. Данные представлены в виде М±SD (среднее арифметическое ± среднее квадратическое отклонение). Для проверки характера распределения применяли тест Колмогорова – Смирнова. Результаты оценивали, применяя t-критерий Стьюдента для независимых и зависимых выборок (при нормальном характере распределения), критерий Вилкоксона (при распределении отличном от нормального), дисперсионный и корреляционный анализ. Статистически значимым уровнем отличий считали вероятность не менее 95% (р < 0,05).
