Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 Тимус и его функции 11
физиологическая функция тимуса 11
Тимус и стрессорные факторы среды 14
Апоптоз 15
Апоптоз В ИММУ111 ЮЙ СИСТЕМЕ 20
Влияние IISP 70 на апоптоз 22
Влияние NO на апоптоз 26
Влияние высокой температуры на организм 29
Адаптация к теплу ,....32
Заключсниею 37
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
3.1. Защитные эффекты адаптации к теплу при тепловом
шоке 47
3.2 Влияние адаптации к теплу на активность инициаторных
и эффекторных каспаз в тимусе 51
Влияние адаптации к теплу на активность инициаторных каспаз 8 и 9 в тимусе 51
Влияние адаптации к теплу на активность эффекторных каспаз 3 и 6 в тимусе 53
3.3. Влияние ингибитора синтеза белков теплового шока на
антиапоптотический эффект адаптации 55
3.4 Тканеспецифичность синтеза IISP 70 61
3.4, Роль оксида азота (NO) в антиапоптотическом эффекте
адаптации к теплу 63
3.5. Влияние адаптации к теплу на апоптоз в тимусе, индуцированный ЛПС и эмоцианальным стрессом.
(Перекрестный эффект адаптации) 71
З.б.Генетическая детерминированность адаптации к теплу 75
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 77
ВЫВОДЫ 88
ЛИТЕРАТУРА 90
Список сокращений Ад — адаптация к теплу АД - артериальное давление АФК - 7-амино-4-трифторметилкумарина ЛПС ~ липополисахарид
ОДЕ - относительные дснситометрические единицы Ст - стресс ТШ - тепловой шок ФНО - фактор некроза опухоли CD ~ cluster definition/differentiation FADD - Fas-associated death domain HSP - белки теплового шока L-NNA - ЬҐ-нитро-Ь-аргинина NO — оксид азота NOS — синтаза оксида азота RIP - Receptor interacting protein TRADD - TNFR-associated death domain
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследования последних лет показали, что апоптозу принадлежит ключевая роль в реализации ряда физиологических процессов, особенно связанных с поддержанием клеточного гомеостаза и с развитием организма. Нарушение механизмов, участвующих в реализации или контроле апоптоза может стать причиной многих заболеваний. Эти заболевания могут быть обусловлены как ослаблением, так и усилением апоптоза. В случае нарушений, приводящих к ослаблению апоптоза, могут развиваться аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка. Ослабление апоптоза способствует также развитию злокачественных опухолей. С усилением апоптоза коррелируют такие заболевания как токсичные гепатиты, болезнь Альцгеймера, инфаркт миокарда, СПИД и др.
При изучении апоптоза было выявлено, что истощение и ускоренная инволюция лимфоидных органов при действии сильных или длительных стрессорных факторов происходит вследствие усиления апоптоза, вызванного этими факторами. В первую очередь это касается главного органа лимфотворения вилочковой железы. (Cohen J.J., 1992). В экспериментах показано, что к индукции апоптоза в тимусе приводят различные стрессоры, такие как иммобилизационный стресс (Hatanaka К., et al 2001.), сепсис ( Ayala A., et al 1996) и гипертермия ( Khan V.R. 2002).
Среди различных стрессорных факторов особое место занимает гипертермия. Повышение температуры может быть вызвано как внешними, например, при длительном нахождении организма в условиях повышенной температуры, так и внутренними факторами, например, при иммунной реакции, когда гипертермия опосредована деятельностью лимфоцитов. При этом с одной стороны, значительное повышение температуры, как и любой другой достаточно сильный стрессор, вызывает стресс-реакцию, увеличивает концентрацию корти костероидов и катехоламинов в крови (Brenner I,, 1998) и, как следствие, создает возможность развития апоптоза в органах иммунной
б системы. С другой стороны, гипертермия приводит к внутриклеточным повреждениям и в этом случае также способствует индукции апоптоза.
Для профилактики и коррекции стрессорных повреждений и заболеваний, имеющих в своей основе стрессорный компонент, используют адаптацию к различным факторам окружающей среды. Например, адаптацию к периодической гипобарической гипоксии используют для профилактики и лечения патологических состояний, в патогенезе которых присутствует стрессорный компонент. К таким заболеваниям относятся нарушения функции иммунной системы, неврозы, гипертоническая болезнь, параноидальные формы шизофрении и др. (Меерсон Ф.З. и др. 1989; Меерсон Ф.З. 1993; Пшенникова М.Г., 2001). В ряде экспериментальных работ применяли тепловое прекондиционирование (Bolli , 2000) и адаптацию организма к стрессу (Meerson F., et al., 1989).
Исследования последних лет показали, что защитные эффекты адаптации связаны с синтезом защитных стресс-белков группы HSPs (Beckmann R.P., et al., 1990; Malyshev I. et al., 1996). Первоначально считали, что накопление HSPs приводит к повышению теплоустойчивости организма. Однако позднее были получены доказательства того, что HSPs повышают устойчивость организма к различным стрессам: гипоксии, действию тяжелых металлов, оксидативному стрессу, компоненты бактериальных клеток и вирусов и т.д. (Jaattela М., 1992 Lepore et al, 2001). Главные молекулярные механизмы защитного действия HSPs состоят в дезагрегации аномальных белковых комплексов, утилизации и репарации поврежденных белков, регуляции синтеза белка de novo (Welch D., 1988; Hightower et al., 1994). Важную роль в формировании адаптационной защиты играет оксид азота (NO) (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998). Механизмы действия NO включают антиоксидантное (Siow N. et al,, 1999), противовоспалительное действие (Lamas S. et al., 1998) и эффекты, опосредованные продукцией цГМФ (Du Toit et al., 1998). Кроме того, NO способен активировать синтез защитных стресс-
белков группы I ISPs (Hauser G.J., et al., 1996; Kim Y.-M., et al., 1999b; Malyshev I.etal.,2000).
Известно что, 1ISP 70 способны регулировать апоптоз, обладая антиапоптотическим действием (Lang et al., 2002; Klein F., Brune, 2002). NO также может выступать в качестве фактора, регулирующего апоптоз. NO в малых и физиологических концентрациях проявляет антиапоптотическое действие (Kim Y. et al., 1999), в больших же дозах оксид азота приводит к индукции апоптоза (Murphy М., 1999.; Dimmeler S., 1997).
Таким образом, имеющиеся данные наводят на мысль о возможности антиапоптотического действия адаптации и участии в этом процессе I ISPs и NO, так как оба эти вещества синтезируются в процессе адаптации к разным факторам (Меерсон Ф.З. и др., 1994; Манухина Е.Б. и др., 1996; Kuroshima, 1995; Meerson F., Malyshev I., 1993) и в тоже время способны регулировать апоптоз. Вместе с тем влияние адаптации на ключевой механизм апоптоза — каскадную активацию каспаз - не изучалось. Соответственно, возможность потенциально эффективного использования адаптации для предупреждения и коррекции стресс-индуцированных нарушений иммунологических функций тимуса не оценивалось.
В соответствии с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении возможности адаптационной защиты клеток тимуса от индуцированного тепловым шоком апоптоза и исследовании молекулярных механизмов, вовлеченных в развитие такой защиты.
В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:
Изучить пути активации апоптоза при тепловом шоке.
Изучить влияние адаптации к теплу на индуцированный тепловым шоком апоптоз в тимусе.
Изучить роль белков теплового шока в молекулярных механизмах
антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки
влияния адаптации на синтез Hsp70 и влияния ингибитора
синтеза I ISPs на развитие защитных эффектов адаптации
Изучить роль NO в молекулярных механизмах антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез N0 и влияния ингибитора N0-синтазы на развитие защитных эффектов адаптации
Оценить возможность перекрестного антиапоптотического эффекта адаптации к теплу при сепсис и стресс - индуцированном апоптозе в тимусе.
Выявить генетическую детерминированность эффекта адаптации к теплу.
Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.
Тепловой шок приводит к активации эффекторных каспаз 3 и 6 и инициаторных каспаз 8 и 9 в клетках тимуса, При этом активность каспазы 9, вызванная тепловым шоком, выше, чем активность каспазы 8. Это свидетельствует о том, что апоптоз, индуцированный тепловым шоком, развивается в большей степени по митохондриальному пути, чем по рецептор зависимому пути.
Впервые показано, что дозированная адаптация крыс к теплу защищает клетки тимуса от индуцированного тепловым шоком апоптоза. Защитный эффект проявляется в снижении уровня активности инициаторных и эффекторных каспаз.
Впервые показано, что накопление Hsp70 в клетках тимуса в процессе адаптации сопровождается снижением активности каспаз 3, 8 и, 9, индуцированной тепловым шоком. Введение ингибитора синтеза белков теплового шока приводит к устранению адаптационного накопления IIsp70 и потенцированию активности эффекторной каспазы 3 и инициаторной каспазы 9, но не каспаз 8 индуцированной тепловым шоком.
Впервые доказано, что NO вносит вклад в формирование защитного эффекта адаптации к теплу. При этом ограничение активности эффекторных каспаз происходит как за счет действия самого NO, так и за счет активации
механизмов, связанных с накоплением HSP 70. Это подтверждается тем, что ингибитор NO-синтазы, ограничивая гиперпродукцию КО, уменьшает активность кас пазы 3 при тепловом шоке. Вместе с тем ингибитор NO-синтазы отменяет эффект адаптивного ограничения индукции HSP70 и адаптационное ограничение индуцированной тепловым шоком активности каспазы 3. Впервые показано, что адаптация к теплу ограничивает индуцированную эмоциональным стрессом и липополисахаридом (ЛПС) активность каспазы 3.
Теоретическое значение работы состоит в том, что в ней впервые продемонстрирована возможность формирования адаптационной защиты клеток тимуса от повреждающих воздействий стрессоров. Продемонстрирована избирательность пути активации апоптоза при действии на организм гипертермии. Раскрыта роль N0 и HSP 70 в защитных эффектах адаптации клеток тимуса от апоптоза индуцированного тепловым шоком. Доказано, что адаптация к теплу обладает перекрестным антиапоптотическим эффектом.
Практическое значение работы состоит в том, что в ней продемонстрирована возможность предупреждения гибели клеток иммунной системы с помощью адаптации к теплу. Это позволяет обосновать возможность применения адаптации к теплу при заболеваниях, связанных с вторичными иммунодефицитами.
Положения, выносимые на защиту:
Индукция апоптоза в тимусе при тепловом шоке развивается преимущественно по митохондрий-зависимому пути.
Адаптация организма к теплу эффективно защищает тимус от апоптоза, индуцированного тепловым шоком.
Молекулярные механизмы адаптации, опосредованные действием HSP и N0, вовлечены в антиапоптотический эффект адаптации к теплу.
Адаптация к теплу обладает перекрестным эффектом, защищая от апоптоза вызванного другими стрессорными факторами.
Апробация работы. Основные результаты проведенных исследований
были доложены на межлабораторном семинаре Отдела адаптационной
медицины НИИ ОПП (Москва, 2004), II международной научно-практической
* конференции «Дисфункции эндотелия» (Витебск, 2001), на XXI
международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва,2003), 7-м международном конгрессе Международного общества адаптационной медицины (Сан Диего, США, 2003).
*
![Влияние адаптации к периодической гипобарической гипоксической стимуляции на аллергическое воспаление при бронхиальной астме у детей [Электронный ресурс]](/i/i/4405/182178.png "Влияние адаптации к периодической гипобарической гипоксической стимуляции на аллергическое воспаление при бронхиальной астме у детей [Электронный ресурс] Дмитриева Татьяна Владимировна")
