Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1. Причины интоксикации нитратами и нитритами 9
2. Метаболизм нитритов в эритроцитах 12
3. Влияние нитритов на эритроцитарную систему 16
4. Влияние различных факторов на активность эритродиереза 20
5. Лечение нитритных интоксикаций 24
6. Значение альфа-токоферола для организма 28
ГЛАВА 2. Характеристика материала и методов исследования 33
Глава 3. Состояние эритроцитарнои системы крыс при длительной нитритной интоксикации 42
Резюме 60
Глава 4. Влияние токоферола на состояние эритроцитарнои системы крыс при длительной нитритной интоксикации 63
Резюме 99
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 103
Выводы 115
Литература 117
- Причины интоксикации нитратами и нитритами
- Метаболизм нитритов в эритроцитах
- Влияние нитритов на эритроцитарную систему
- Влияние токоферола на состояние эритроцитарнои системы крыс при длительной нитритной интоксикации
Введение к работе
Актуальность темы: В последнее время увеличилось отрицательное влияние нитратов и нитритов на здоровье человека и животных [Ажипа ЯМ. и др., 1990]. Они способны оказывать свое действие на всех структурно-функциональных уровнях: от целого организма до отдельных молекул. В основе системных механизмов этого влияния лежит реакция превращения нитрит-ионов в N0. Это звено определяет способность нитрит-ионов окислять гемоглобин и образовывать комплексы Hb-NO, влиять на активность растворимой гуанилатциклазы и уровень цГМФ, а также на внутриклеточную концентрацию ионов кальция. NO является одним из универсальных регуляторов клеточного и тканевого метаболизма [Реутов В.П. и др., 1994; Hanafy К.А. etal.,2001].
В настоящее время активно исследуется роль оксида азота в регуляции функционирования важнейших систем организма: нервной, сердечнососудистой, дыхательной, иммунной и других [Лямина Н.П. и др., 2004; Проскуряков С.Я. и др., 2000; Abakumov М.М., Golikov P.P., 2005; Biondi С. et al., 2005; Chen L.Y., Mehta J.L., 1998; Choi H.-S. et al., 2002; Crawford J.H. et al., 2006; Dusse L.M. et al., 2007; Fujii J. et al., 2005; Grisham M.B. et al., 1998; Marin J., Rodriguez-Martinez M.A., 1997; Miller M.R., Megson I.L., 2007; Wang T. et al., 2003], однако, несмотря на большое количество работ, посвященных NO, пока не определены все точки его приложения. В литературе мало освещен вопрос о роли нитритов и оксида азота в регуляции эритроцитарного равновесия и, в частности, в механизмах регуляции процесса разрушения эритроцитов. Поэтому, актуальным является исследование влияния оксида азота на эритрон и процесс эритродиереза.
Эритроцитарная система может рассматриваться в качестве первой мишени действия нитритов (метгемоглобинобразование, окислительное повреждение белков и липидов) и первого защитного механизма, работающего благодаря высокой суммарной способности эритроцитов связывать нитриты и свободные радикалы [Baird J.K., 1984; Zavodnic LB. et al., 1999].
При нитритной интоксикации отмечаются изменения количественных показателей периферической крови, которые могут быть связаны как с мет-гемоглобинемией, так и с усилением процессов перекисного окисления ли-пидов мембран эритроцитов, снижением активности системы антиоксидант-ной защиты [Бурбелло А.Т. и др., 1991; Crow С.К., 1984], изменением проницаемости и увеличением жесткости мембран [Zavodnic LB. et al., 1999], изменением деформируемости красных клеток крови [Bateman R.M., Jagger J.E., 2001].
Литературные данные о влиянии нитритов на эритроцитарную систему противоречивы: ряд авторов сообщает об увеличении содержания эритроцитов и гемоглобина при повторных поступлениях нитритов в организм [Герман СВ., 1999; Середенко М.М. и др., 1984], имеются сведения о снижении этих показателей [Петухов Н. И., Рыбкин А.И., 1972]. Вместе с тем, следует отметить, что имеющиеся данные практически не учитывают динамики изменений показателей при разных сроках воздействия и путей влияния нитро-соединений на систему крови.
Механизмы элиминации нежизнеспособных эритроцитов из кровеносного русла при нитритной интоксикации не изучены. При физиологических и многих патологических состояний эритроциты разрушаются преимущественно внутриклеточно макрофагами. Токсическое влияние нитритов на красные клетки изменяет нормальную структуру их мембран, снижается содержание сиаловых кислот [Kunimoto М. et al., 1984]. Эритроциты воспринимаются макрофагами как старые и активно фагоцитируются [Bratosin D. et al., 1998]. Оксид азота, влияя на макрофаги, способен стимулировать все стадии фагоцитоза [Покровский А.А., Тутельян В.А., 1976; Реутов В.П., Орлов С.Н., 1993; Ке X. et al., 2001]. В нашей лаборатории на основе методики Mantovani В.[1987] был разработан способ оценки фагоцитарной активности перитоне-альных макрофагов крыс, который позволяет определить уровень эритрофа-гоцитоза по количеству адгезированных и поглощенных клеток [Мясоедова Е.Е., 2005].
При нитритной интоксикации наблюдается снижение активности системы антиоксидантной защиты. В этих условиях для предупреждения повреждения клеток описано применение протекторов (метиленовый синий, производные виолуровой кислоты [Бурбелло А. Т. и др., 1991], ферроцены, 5-окси-6-метилуроцил [Шугалей И. В. и др., 1994], витамин Е [Бурбелло А. Т. и ДР-, 1991]).
Токоферол является одним из наиболее доступных лекарственных препаратов с антиоксидантной активностью. Он способен ингибировать процессы перекисного окисления липидов, обладая высокой константой взаимодействия со свободными радикалами [Shimojo Т., 1981]. Токоферол раньше других антиоксидантов расходуется в окислительных реакциях, протекающих в липидах. Следует отметить большую распространенность дефицита этого витамина в популяции, что может усугублять повреждающее действие нитритов. В доступных источниках информации не удалость найти сведений о влиянии токоферола на изменение состояния эритрона при хронической нитритной интоксикации, а также данных о его влиянии на активность клеточных механизмов эритродиереза.
Цель: изучение функционального состояния эритроцитарной системы белых крыс и влияния альфа-токоферола при хронической нитритной интоксикации.
Задачи:
Оценить показатели эритроцитарной системы крыс в динамике хронической нитритной интоксикации.
Определить состояние клеточных механизмов эритродиереза при хронической нитритной интоксикации.
Исследовать влияние альфа-токоферола на показатели эритроцитарной системы крыс и процесс эритродиереза при хронической нитритной интоксикации.
Научная новизна:
В результате проведенных исследований впервые были оценены изменения со стороны эритроцитарной системы (состояние периферической крови и активность эритропоэза) в динамике хронической нитритной интоксикации. Впервые установлено, что под влиянием длительного поступления нитрита натрия увеличивается активность клеточных механизмов эритродиереза. Изучен защитный эффект различных доз альфа-токоферола на эритроцитар-ную систему и эритродиерез при хронической нитритной интоксикации. Установлено, что альфа-токоферол при введении с нитритом натрия предотвращает развитие эритропении, в больших дозах вызывает эритроцитоз, снижает выраженность изменений формы эритроцитов, уменьшает активность клеточного эритродиереза.
Научно-практическая значимость работы:
В работе установлена динамика изменений состояния периферической крови, эритропоэза, клеточных механизмов эритродиереза белых крыс при хронической нитритной интоксикации. Дано научное обоснование использования гематологических критериев (показатели периферической крови: концентрация эритроцитов, их поверхностная цитоархитектоника, резистентность к действию гемолитических факторов; активность эритропоэза и эритродиереза) для оценки состояния организма при хронической нитритной интоксикации различной длительности. Дано теоретическое обоснование применения препарата альфа-токоферола для коррекции хронической нитритной интоксикации.
Результаты работы внедрены в учебный процесс (лекционный курс) ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Росздрава» на кафедре нормальной физиологии (Акт о внедрении предложения «Регуля-торное влияние альфа-токоферола на процессы клеточного эритродиереза»), на кафедре патофизиологии и иммунологии (Акт о внедрении предложения «Гематологические эффекты хронической нитритной интоксикации»), на ка-
федре фармакологии и клинической фармакологии (Акт о внедрении предложения «Защитное действие альфа-токоферола при хронической нитритнои интоксикации»).
Положения, выносимые на защиту:
При хронической нитритнои интоксикации отмечаются фазные изменения содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина, изменяется поверхностная цитоархитектоника и резистентность эритроцитов к действию гемолитических факторов, стимулируется эритропоэз в красном костном мозге и экстрамедуллярный эритропоэз в селезенке, активируются клеточные механизмы эритродиереза.
Альфа-токоферол при поступлении в организм на фоне интоксикации нитритом натрия предотвращает фазу анемизации, в больших дозах вызывает эритроцитоз, уменьшает степень нарушений поверхностной цитоархитектоники эритроцитов, качественно меняя направленность ее сдвигов в сторону обратимых изменений формы, снижает активность клеточных механизмов эритродиереза.
Апробация работы:
Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на: Итоговых конференциях студентов и молодых ученых ИвГМА в рамках «Недели науки» (Иваново, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005 гг.), студенческой научной конференции «Молодая наука в классическом университете» (Иваново, 2002 г.), 68-й республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2003 г.), Межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2003 г.),: Межрегиональной студенческой научной конференции «Студенческая медицинская наука 2003» (Воронеж, 2003 г.), I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005 г.), IV научно-практической конфе-
ренции «Природа и человек. Антропогенное воздействие на окружающую среду» (Иваново, 2005 г.), XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004 г.), XX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007 г.), международной научной конференции «Актуальные проблемы адаптации организма в норме и патологии» (Ярославль, 2005 г.).
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста. Содержит введение, обзор литературы, 2 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы. Библиографический указатель включает 217 источников: 56 отечественных и 161 зарубежных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 19 рисунками.
Причины интоксикации нитратами и нитритами
Нитраты и нитриты являются наиболее широко распространенными элементами круговорота азота в природе. На протяжении всей эволюции жизни на Земле количество этих веществ было стабильным. Однако с ростом антропогенных влияний на азотистый баланс проблема азотсодержащих соединений стала важной с экологической и медико-биологической точки зрения [Ажипа Я.И. и др., 1990]. Основными источниками нитратов и нитритов, воздействующих на организм человека и животных, является вода и пищевые продукты. Применение азотных удобрений приводит к возрастанию уровня нитратов в почве, а, следовательно, в грунтовых и поверхностных водах, сельскохозяйственных культурах. Эти вещества применяются в виде пищевых добавок и консервантов [Журавлев В.Ф., Цапков М.М., 1986]. Нитраты и нитриты широко используются в медицине как вазодилататоры, действующие на гладкомышечные клетки вен и артерий [Marin J., Rodriguez-Martinez М.А., 1997; Miller M.R., Megson I.L., 2007], бронходилататоры [Wang Т. et al., 2003], а также в качестве антидотов при отравлении цианидами [Gee S.J. et al., 1987; Gracia R., Sheperd G., 2004]. Существуют и другие пути поступления (через легкие, кожу). Диоксид азота, попадая в атмосферу с выхлопными газами автомобилей и затем, соприкасаясь с эпителием легких, образует азотистую и азотную кислоты [Шмаров Д.А. и др., 2000]. Показано также, что нитриты постоянно присутствуют в организме, эндогенно синтезируясь, причем синтез происходит при любом уровне их в пищевом рационе.
В 1981 году были опубликованы рекомендации, выработанные исследовательской группой Всемирной Организации Здравоохранения по гигиеническим критериям состояния окружающей среды для нитратов, нитритов, N-нитрозосоединений. Однако гигиенисты до сих пор спорят о величине предельно допустимых концентраций для нитратов и нитритов, так как в организме при их метаболизме образуются еще и ряд других соединений азота [Ажипа Я.И. и др., 1990]. Определение уровня поступления этих веществ на душу населения связано с большими трудностями. Кроме того, контроль над содержанием нитратов и нитритов в продуктах питания ведется нерегулярно и на крайне низком уровне технического обеспечения количественного анализа этих веществ. Поэтому, в настоящее время велик риск развития нитрат-но-нитритной интоксикации.
Было установлено, что нитраты и нитриты могут оказывать регулятор-ное, фармакологическое и токсикологическое действие на всех структурно-функциональных уровнях организма. Однако оставалось непонятным, почему эти простые соединения с умеренной окислительной активностью могли вызывать столь широкий спектр эффектов. Проведенные в течение нескольких лет исследования позволили сделать вывод, что в основе универсального механизма влияния нитратов и нитритов лежит реакция их превращения в оксид азота [Реутов В.П. и др., 1994; Реутов В.П. и др., 1995]. Именно это звено превращения определяет многочисленные свойства нитритов: способность окислять гемоглобин и образовывать комплексы Hb-NO, влиять на активность растворимой гуанилатциклазы и уровень цГМФ, а также на внутриклеточную концентрацию ионов кальция [Реутов В.П. и др., 1993; Hanafy К.A. et al., 2001]. NO относится к двухатомным нейтральным молекулам. Малые размеры и отсутствие заряда обеспечивают этой молекуле высокую проницаемость через мембраны клеток и субклеточных структур. NO может окислиться в NO2" и NO3 и тем самым перейти в малоактивное состояние. Кроме того, при окислении NO возможно образование таких высокотоксичных продуктов, так N02 и пероксинитрит [Chirino Y.I. et al., 2006; Romero N. et al., 2006; Rubbo H. et al., 1994].
Свободные радикалы кислорода, NO и образующийся в присутствии кислорода NO2 могут уменьшать активность большинства ферментных систем, а при взаимодействии с белками (SH-группами цистеина, ОН-группами тирозиновых остатков) и ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембран клеток и субклеточных структур, повреждать их [Беда Н.В.,
Недоспасов А.А., 2006; Реутов В.П. и др., 1978; Соколовский В.В., 1974; Baker P.R. et al., 2005; Batthyany С. et al., 2006; Rubbo H. et al., 1994]. Ненасыщенные жирные кислоты легко окисляются по двойным связям, превращаются в перекисные и затем - гидроперекисные соединения. Они нестойки и легко разрушаются, выделяя активный кислород, что может являться причиной обменных нарушений и мембранных повреждений [Droge W., 2002]. Эти процессы сопровождаются увеличением содержания специфического продукта распада перекисей - малонового диальдегида (Наньковская И.Н., 1991).
Как показывают исследования последних лет, оксид азота представляет собой исключительно важный регулятор множества физиологических функций организма, как в норме, так и в патологии [Bryan N.S. et al., 2006].
Нарушение механизмов регуляции с участием NO отмечают при гипер-тензии [Marin J., Rodriguez-Martinez М.А., 1997; Лямшш Н.П. и др., 2004], ишемии [Crawford J.H. et al., 2006; Grisham M.B. et al., 1998], тромбозах [Aba-kumov M.M., Golicov P.P., 2005; Chen L.Y., Mehta J.L., 1998; Dusse L.M. et al., 2007], инфекциях [Проскуряков С.Я. и др., 2000; Choi H.-S. et al, 2002], опухолевом росте [Schallreuter K.U., Wood J.M., 1991], патологии беременности [Fujii J. et al., 2005; Biondi C. et al., 2005]. При некоторых терминальных состояниях (шок, уремическое кровотечение, краш-сшщром) наблюдается резкое повышение уровня оксида азота в крови, который, оказывая цитотокси-ческое и иммуногенное действие, может явиться фактором эндогенной интоксикации, играющей важную роль в течение и исходе критических состояний [Голиков П.П. и др., 2000; Golikov P.P. et al., 2006; Hlerholzer С. et al., 1998].
Метаболизм нитритов в эритроцитах
При поступлении в кровь нитрит-ионы проникают через эритроцитар-ные мембраны. Транспорт ионов через мембрану осуществляется достаточно быстро, однако механизм его пока не исследован. Предполагают, что важную роль в этом играет белок полосы 3 цитоскелета, участвующий в переносе оксида азота в эритроцит [Реутов В. П. и др., 1995], другие авторы отрицают эту возможность [Zavodnik I.B. et al., 1999]. Транспорт нитритов через мембрану мало чувствителен к снижению температуры, но увеличивается при снижении показателя гематокрита. На него не оказывают влияние ингибиторы диффузии (например, флоретин). В течение транспорта нитрит-ионов внеклеточный рН остается стабильным [Jensen F.B., 2005]. Внутри клетки эти ионы располагаются в цитозоле и не связаны с внутриклеточными белками [Dejam A. et al., 2005].
Реакции взаимодействия нитритов с гемоглобином включают систему уравнений, описывающих промежуточные этапы этой реакции, супероксидный анион-радикал, перекись водорода, нитрат- и нитрит-ионы, оксид азота, двуокись азота, а также продукты окисления гемоглобина [Реутов В.П. и др., 1997; Степуро И.И. и др., 1997] . Для боле полной характеристики этих процессов исследования проводились на гемолизате и эритроцитах.
По результатам исследований взаимодействия гемолизата с нитритом натрия известно, что в процессе окисления оксигемоглобина нитритом натрия образуются Н202, Н02, 02" радикалы и феррильная форма гемоглобина. Первая, медленная стадия реакции окисления оксигемоглобина протекает с образованием метгемоглобнна и радикалов N02 и 02\ Радикалы 02 быстро дисмутируют с образованием перекиси водорода: О/ + О/ + 2Н+ -+ Н202 + 02. Далее перекись водорода взаимодействует с метгемоглобином с образованием феррильной формы. Нитрит натрия и полученная при этом свободно-радикальная форма феррплгемоглобина в несколько стадий вовлекаются в ряд реакций, ответственных за развитие аутокаталитической фазы окисления: Hb(III) + Н202 - Hb(IV)-OH + НО-Hb(IV)-OH + N02"- N02+ Hb(IV)-OH Hb(I V)-OH + N02- - N02 + Hb(III) + OH" Hb02 + N02 - Hb(III) + NO/ + 02 Оксигемоглобин взаимодействует с феррильной формой гемоглобина и способен трансформировать ее в метгемоглобин: Hb(IV)-OH + НЬ02 - 2Hb(III) + 02 + ОН" Поэтому, при увеличении в растворе концентрации оксигемоглобина наблю дается торможение аутокаталитической фазы реакции. Нитрозильный радикал NO2 в процессе взаимодействия с оксигемогло-бином регенерирует в NO2 . Одновременно N02 димеризуется с образованием N2O4: N02+N02- N204. Это соединение спонтанно распадается на нитрат- и нитрит-ионы.
При понижении парциального давления кислорода происходит диссоциация комплекса гемоглобина и кислорода и увеличивается количество равновесной концентрации дезоксигемоглобина, что в результате окислительно-восстановительной реакции приводит к образованию NO, так как дезоксиге-моглобин эффективно восстанавливает нитрит-ионы в NO: Hb(II) + N02 + Н+ - NO + Hb(III) + ОН"
При взаимодействии дезоксигемоглобина с NO образуется R-конформер нитрозогемоглобина, который отличается от других ферроформ гемоглобина высокой устойчивостью к действию нитритов и медленно окисляется до метгемоглобина.
Образование нитрозогемоглобина сильно снижается при повышении давления кислорода в растворе, а уровень метгемоглобина возрастает. Это связано с тем, что в присутствии кислорода и N02 уменьшается концентрация N0 в результате реакций образования N203, нитрит-ионов. Кроме того, известно, что оксигемоглобин катализирует практически полное превращение нитрит-ионов в нитрат-ионы.
Для эритроцитов при понижении давления наблюдаются примерно те же закономерности в образовании мет- и нитрозогемоглобина под действием нитрит-ионов. Отличие заключается в том, что образование дезоксигемоглобина происходит при больших значениях парциального напряжения кислорода в растворе, и значение рО250 возрастает. Понижение сродства кислорода к гемоглобину в эритроцитах вызвано влиянием неорганических фосфатов: 2,3-дифосфоглицерата, АТФ, АДФ, которые, связываясь в активном центре гемоглобина, вызывают конформационный переход из R- в Т 15 конформацию, характеризующуюся низким сродством к кислороду. Кроме того, в эритроцитах замедляются скорости окисления окси- и дезоксигемог-лобина в мет- и нитрозогемоглобин в сравнении с водными растворами фер-роформ гемоглобина.
Это может быть связано с тем, что в эритроцитах имеются внутриклеточные антиоксиданты, в первую очередь, восстановленный глутатион, который окисляется в GSSG NO2 и другими радикалами, возникающими при воздействии нитрит-ионов на ферроформы гемоглобина. Восстановленный глутатион увеличивает медленный период реакции и тормозит развитие аутока-талитической фазы.
Влияние нитритов на эритроцитарную систему
При окислительном стрессе, вызванном нитритной интоксикацией, в эритроцитах индуцируется образование ковалентных комплексов спектрина и гемоглобина. В результате происходит концентрация внутреннего слоя липи-дов, что приводит к множественным клеточным повреждениям, включающие изменения формы, деформируемости мембраны, фосфолипидной организации [Snyder L.M. et al., 1985]. Фосфолипиды перемещаются из мембраны в цито-золь, образуются комплексы липидов и гемоглобина [Moxness M.S. et al., 1996]. Усиливаются процессы протеолиза [Baird J.К., 1984]. Окисление нитритами гемоглобина и сульфгидрильных групп мембран эритроцитов способствует увеличению мембранной жесткости [Zavodnic I.B. et al., 1999], снижению микровязкости и способности к изменению формы эритроцитов по сравнению с контролем [Bateman R.M., Jagger J.E., 2001; Bor-Kucukatay М. et al., 2003; Carvalho F.A. et al., 2006], что обуславливает сокращение жизни эритроцитов [Шашкин А. В., Тресков И.А., 1986]. Увеличивается неоднородность механических свойств эритроцитарной мембраны, которая является следствием реорганизации ее структуры [Стародубцева М. Н. и др., 2006]. Эти изменения вызывают нарушения на уровне микроциркуляции [Lipowsky Н.Н. et al., 1993] .
Морфологические изменения сопровождаются дисбалансом в клеточном окислительно-восстановительном потенциале [Di Cola D. et al., 1988] в виде смещения соотношения окисленных и восстановленных фракций тиол-дисульфидной и аскорбатной систем в сторону накопления окисленных форм [Бурбелло А.Т. и др., 1991; Shugalei I.V., Lvov S.N., 1992]. В исследованиях in vitro было показано, что в эритроцитах оксид азота способен стимулировать регенерацию аскорбиновой кислоты из ее окисленных форм [Spagnuolo M.S. etal.,2006].
Нарушается проницаемость мембран эритроцитов. Через цГМФ [Muzyamba М.С. et al., 2000], а также вследствие окислительного стресса увеличивается активность К-С1 котранспорта [Ochiai Н. et al., 2006], который играет важную роль в регуляции объема и в поддержании ионного гомеоста-за клетки, а также необходим для нормальной деформируемости красных клеток крови [Ney Р.А. et al., 1990]. В то же время активируется Na+/H+ обмен [Petrov V., Lijnen P., 1996], важный для осмотического баланса клетки.
Двуокись азота, образующаяся при метаболизме нитритов, окисляет сульфгидрильные группы субстратов белковой и небелковой природы с очень большой скоростью по сравнению с нитритным ионом. В исследованиях in vitro количество эритроцитов, лизированных NO2, было в 14 раз больше, чем при действии нитрит-иона [Соколовский В.В., 1974]. В результате увеличивается вход свободного гемоглобина из эритроцитов, может быть ги-пербилирубинемия за счет непрямой фракции [Герман СВ., 1999].
N0 способен изменять энергетический метаболизм ретикулоцитов, усиливая гликолиз, повышая поглощение глюкозы и накопление лактата, стимулируя активность пируваткнназы, повышается уровень АДФ и АМФ, при этом концентрация АТФ не изменяется [Maletic S.D. et al., 1999].
Само по себе образование метгемоглобина вызывает гипоксию организма, кислородная емкость крови падает. В норме содержание метгемоглобина в крови составляет менее 1%. Различают три степени тяжести метге-моглобинемии: легкая (МетНЬ 18 - 20%), средняя (МетНЬ 20 - 36%), тяжелая (МетНЬ более 36%). При уровне МетНЬ более 75% наступает смерть. Если количество метгемоглобина не превышает 5 - 15%, то такая форма метгемог-лобинемии называется «бессимптомной» или хронической [Гоженко А.И. и др., 1996].
Вследствие развития гемической гипоксии в крови накапливаются не-доокисленные продукты углеводного обмена, повышается концентрация лактата, понижается соотношение лактат/пируват [Курбат Н.М., Кораблев М.В., 1982]. В отличие от других типов пшоксических состояний, наблюдается повышение сродства гемоглобина к кислороду, кривая диссоциации пигмента крови сдвигается влево прямо пропорционально концентрации метгемоглобина в крови. При хроническом воздействии нитрита натрия в первые недели содержание 2,3-дифосфоглицерата было ниже контрольных цифр, затем появлялась тенденция к нормализации с последующим превышением контрольного уровня [Середеііко М.М. и др., 1987]. Это может быть связано с выбросом в циркуляцию незрелых эритроцитов, которым присуще более высокое содержание фосфатов [Bunn Н., Drysdall J.M., 1971]. Обратимые ге-моглобинфосфатные комплексы стимулируют диссоциацию оксигемоглобина, улучшая кислородное снабжение тканей. При острой нитритной интоксикации, наоборот, кривая диссоциации оксигемоглобина сдвигается вправо за счет увеличения содержания 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах.
Другим механизмом снижения сродства гемоглобина к кислороду является АТФ [Моисеева О.И., 1985]. В течение первого месяца парентерального поступления нитритов в организм содержание АТФ повышено [Сере-денко М.М. и др., 1987]. Это можно объяснить тем, что снижается активность Са2+, Mg2+ и Na+, К+АТФ-азы [Kunimoto М. et al., 1984]. В исследованиях in vitro наоборот, снижается уровень АТФ в клетке [Kashiba М., Inoue М., 2000]. Между поддержанием формы эритроцитов и содержанием АТФ существует определенная зависимость: при уменьшении АТФ утрачивается способность к изменению формы.
Влияние токоферола на состояние эритроцитарнои системы крыс при длительной нитритной интоксикации
Реакция эритрона на действие нитрита натрия сопровождается изменениями качественных характеристик мембран эритроцитов. Наблюдается повышение резистентности эритроцитов за счет двух процессов: активации образования молодых клеток и ускорения гемолиза эритроцитов с низкой стойкостью под действием нитритов. Уже с 3-го дня увеличивается длительность кислотного гемолиза, эритрограмма имеет вид двухфазной кривой, что свидетельствует о наличии в крови группы высоко устойчивых клеток. К 14-му дню кривая резистентности эритроцитов возвращается к исходному уровню. На 21-й день интоксикации отмечается смещение эритрограммы влево. Глицериновая резистентность достоверно не изменяется. Осмотическая резистентность повышается во все сроки эксперимента за счет увеличения продолжительности гемолиза.
Существенные изменения претерпевает поверхностная цитоархитекто-ника эритроцитов у крыс с нитритной интоксикацией. С 3-го по 14-й день опыта количества дискоцитов снижается за счет увеличения количества как обратимо деформированных клеток, так и необратимо деформированных (предгемолитических) форм эритроцитов. Наибольшие изменения наблюдаются на 3-й и 14-ые сутки. Количество дискоцитов снижается преимущественно за счет эритроцитов с множественными выростами. На 21-й день показатели поверхностной цитоархитектоники эритроцитов возвращаются к исходным значениям.
У животных опытных групп наблюдается усиление эритропоэза. Уже на 3-й день эксперимента возрастает количество ретикулоцитов, при этом увеличения содержания эритроидных клеток в красном костном мозге, селезенке, печени не отмечается. Вероятно, усиление эритропоэза на этом этапе происходит за счет увеличения интенсивности функционирования имеющихся структур. С 7-го дня увеличение содержание ретикулоцитов сопровождается гиперплазией эритроидного ростка красного костного мозга и селезенки, о чем свидетельствует повышение количества эритроидных клеток в нем и активация экстрамедуллярного эритропоэза в селезенке. На 14-е сутки количество ретикулоцитов, содержание эритроидных клеток в красном костном мозге и в селезенке достигает максимальных значений. В дальнейшем концентрация ретикулоцитов и количество эритроидных клеток в кроветворных органах снижается, оставаясь выше исходных значений. Изменений эритропоэза в печени мы не наблюдали.
У животных опытных групп отмечается активация клеточных механизмов эритродиереза во все сроки нитритной интоксикации. Увеличивается количество макрофагов, адгезирующих эритроциты, преимущественно за счет розеток 1-го типа. Одновременно повышается процент макрофагов с фа-госомами и диффузными гемоглобиновыми включениями. Индекс адгезионно-фагоцитарной активности макрофагов повышен на 14-й и 21-й день эксперимента, индекс завершенного эритрофагоцитоза увеличен во все сроки наблюдения, максимально на 21 день.
Таким образом, полученные на первом этапе эксперимента результаты свидетельствуют о том, что длительное поступлении нитритов в концентрации 0,2 г/л в организм животных оказывает влияние на показатели эритро-цитарной системы. Характер этого влияния зависит от длительности интоксикации. Наблюдаются трехфазные изменения концентрации эритроцитов и гемоглобина. Падение концентрации эритроцитов в начальные сроки воздействия на фоне необратимых (предгемолитических) изменений их формы свидетельствует об усилении процесса эритродиереза. Развивающееся в этих условиях активация эритропоэза, в основе которой лежит эритроидная гиперплазия красного костного мозга и селезенки, имеет компенсаторное значение, обеспечивая восстановление показателей эритроцитарного состава крови к концу эксперимента.
Второй этап эксперимента проводился на 90 крысах-самках. Животные были разделены на 5 групп. 1-я группа получала инъекции альфа-токоферола 15 мг/кг два раза в неделю, 2-я - альфа-токоферол 150 мг/кг два раза в неделю, 3-я - вместо питьевой воды 0,2% раствор нитрита натрия и внутримышечные инъекции стерилизованного растительного масла, 4-я -раствор нитрита натрия и альфа-токоферол в дозе 15 мг/кг два раза в неделю, 5-я - раствор нитрита натрия и альфа-токоферол 150 мг/кг два раза в неделю. Перед началом эксперимента, на третий, седьмой, четырнадцатый и двадцать первый день у крыс производился забор периферической крови. Оценивали те же показатели, что и на первом этапе. Состояние кроветворных органов и клеточных механизмов эритродиереза оценивали во 2 и 5 группе на седьмой и двадцать первый день.
