Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Центральные механизмы регуляции водного обмена 10
Орган-мишень антидиуретического гормона — почка 26
Воспаление и водный обмен 56
Заключение 63
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 65
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 77
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 88
Глава 5. ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94
ЛИТЕРАТУРА 96
- Центральные механизмы регуляции водного обмена
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- РЕЗУЛЬТАТЫ
- ОБСУЖДЕНИЕ
- ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Водный обмен всегда был объектом пристального внимания исследователей, но современные представления о транспорте воды через биологические мембраны сформировались совсем недавно — в середине 90-х годов XX века, после открытия аквапоринов — семейства белков водных каналов. Именно это открытие позволило заполнить «белые пятна» в наших знаниях о механизмах обмена воды в организме и, в частности, механизмах действия антидиуретического гормона (АДГ), реабсорбции воды в почках и концентрации мочи.
Однако, несмотря на существенный прогресс в этой области знаний, многие вопросы до сих пор остаются нераскрытыми. К их числу относится и регуляция водного обмена при различных патологических состояниях. В последнее время этому разделу стало уделяться особое внимание, поскольку исследование патологических процессов нередко позволяет лучше понять нормальные физиологические процессы. Так, в частности, стали появляться работы, которых изучается состояние собирательных трубочек почки при нарушении оттока мочи, при ишемии почек1, а также при действии воспалительных факторов2.
Среди различных патологических состояний воспаление занимает особое место. С одной стороны это связано с тем, что нарушения регуляции водного обмена, возникающие при воспалении, имеют большое значение для практической медицины, а с другой — в воспалительной реакции наиболее ярко проявляется взаимодействие основных регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной. ' Fernandez-Llama P., Andrews P., Turner R., Saggi S., Dimari J., Kwon Т.Н., Nielsen S., Safirstein R., Knepper MA. Decreased abundance of collecting duct aquaporins in post-ischemic renal failure in rats II J. Am. Soc. Nephrol. 1999. Vol. 10. P. 1658-1668. - Kwon Т.Н., Frokiaer J., Fernandez-Llama P., Knepper M.A., Nielsen S. Reduced abundance of aquaporins in rats with bilateral ischemia-induced acute renal failure: prevention by alpha-MSH II Am J. Physiol. 1999. Vol. 277. P. F413-427. 2 Tamma G., Wiesner В., Furkert J., Hahm D., Oksche A., Schaefer M., Valenti G., Rosenthal W., Klussmarm E. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho II J. CelL Sci. 2003. Vol. 116. P. 3285-3294.
5 Появившаяся в конце XX века концепция нейроиммуноэндокринологии позволяет по-новому осмыслить роль медиаторов иммунной системы в адаптивных реакциях организма3. Для моделирования воспалительной реакции общепринятой является модель с внутрибрюшинным введением бактериального эндотоксина — липополисахарида (ЛПС) в высоких дозах (200—250 мкг/100 г веса тела). Ранее было показано, что такая модель не только приводит к выраженной эндотоксемии и активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, но и запускает экспрессию цитокинов в тех органах, которые находятся вне очага воспаления4.
Но, несмотря на явную важность этой темы и интенсивные исследования в этой области, ряд аспектов до сих пор не изучен. В частности, есть отдельные данные о влиянии ЛПС на экспрессию аквапорина-25, однако экспрессия рецептора АДГ 2-го типа (У2-рецептора) в условиях воспаления практически не изучена. Имеются сведения, что ЛПС и цитокины могут усиливать апоптоз в культуре клеток почечных канальцев6, но насколько значим этот механизм в целом организме — также не известно. По-прежнему не исследована динамика изменений, происходящих в собирательных трубочках почки после введения ЛПС. Но до сих пор не было проведено систематического исследования системы «У2-рецептор—аквапорин-2» под действием ЛПС, и именно это и обусловило направление нашей работы.
Акмаев И.Г., Гриневич В.В. Нейроиммуноэндокринология гипоталамуса, -М.: Медицина, 2003. -168 с. - Besedovsky Н.О., Del Rey A. Immune-neuroendocrine interactions: facts and hypothesis II Endocr. Rev. 1996. Vol. 17. P. 64-102. 4 Гриневич B.B., Поскребышева E.A., Савелов H.A., Абрамова Н.А., Акмаев И.Г. Иерархические взаимоотношения между органами гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГТАС) при воспалении // Успехи Физиол. Наук 1999. Т. 30. №4. С. 50-66. - Grinevich V., Ma Х.М., Verbalis J., Aguilera G. Hypothalamic pituitary adrenal axis and hypothalamic- neurohypophyseal responsiveness in water-deprived rats II Exp. Neurol. 2001. Vol. 171. P. 329-341. 5 Jonassen Т.Е., Graebe M., Promeneur D., Nielsen S., Christensen S., Olsen N.V. Lipopolysaccharide-induced acute renal failure in conscious rats: effects of specific phosphodiesterase type 3 and 4 inhibition II J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002. Vol. 303. P. 364-374. 6 Jo S.K., Cha D.R., Cho W.Y., Kim H.K., Chang K.H., Yun S.Y., Won N.H. Inflammatory cytokines and lipopolysaccharide induce Fas-mediated apoptosis in renal tubular cells II Nephron. 2002. Vol. 91. P. 406-415.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы— изучение состояния системы «V2-рецептор—аквапорин-2» в собирательных трубочках почки крысы в условиях острого воспаления. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
Исследовать динамику изменений осмолярности плазмы крови в условиях острого экспериментального воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением ЛПС.
В этой же модели воспаления исследовать динамику уровня биологически активного Уг-рецептора и экспрессии его мРНК в собирательных трубочках почки.
В этой же модели воспаления исследовать динамику уровня аквапорина-2 и экспрессии его мРНК в собирательных трубочках почки.
Оценить концентрационную функцию почки в описанной модели, исследовав осмолярность мочи.
Исследовать экспрессию основных воспалительных цитокинов (интерлейкина-ір и интерлейкина-6) в ткани почки в условиях экспериментального воспаления.
Исследовать влияние введения ЛПС на апоптоза в мозговом веществе почки.
Научная новизна исследования. На основании экспериментальных данных обнаружен ряд особенностей в функционировании собирательных трубочек почек при остром воспалении:
Впервые показано, что острое воспаление нарушает концентрационную функцию почек, что выражается в снижении осмолярности мочи.
Впервые исследована динамика уровней белка и мРНК Уг-рецептора и аквапорина-2 в собирательных трубочках почки в условиях
7 воспаления. Это позволило объяснить тот факт, что при введении ЛПС почка выходит из-под контроля АДГ.
Обнаружено, что в условиях воспаления отмечается диссоциация между динамикой изменений уровней мРНК аквапорина и содержанием этого белка в клетке.
Впервые описана индукция в мозговом веществе почки экспрессии воспалительных цитокинов — интерлейкина-1(3 и интерлейкина-6 под действием ЛПС.
Показано, что изменения, происходящие в собирательных трубочках почки в условиях острого воспаления, носят функциональный и временный характер и не связаны с апоптозом клеток собирательных трубочек.
Теоретическая и практическая значимость. Работа представляет собой теоретический базис для внедрения новых диагностических и терапевтических подходов в клинике. Полученные данные о состоянии почки в условиях острого воспаления могут быть полезны для коррекции нарушений водного баланса при септическом шоке и других близких состояниях у человека.
Основные положения, выносимые на защиту.
В условиях воспаления почка выходит из-под контроля АДГ, что связано со снижением уровней Уг-рецептора и аквапорина-2 и проявляется снижением осмолярности мочи.
В этой ситуации ведущая роль в регуляции функции собирательных трубочек принадлежит провоспалительным цитокинам— интерлейкину-1 и интерлейкину-6.
Нарушение концентрационной функции почек носит временный характер и связано не с гибелью клеток почечных канальцев.
Центральные механизмы регуляции водного обмена
Вода в виде питья и пищи поступает в организм через желудочно-кишечный тракт, всасывается в кровь и выделяется почками в виде мочи. В условиях, когда поступление жидкости в организм ограничено, почки начинают концентрировать мочу, задерживая воду в организме, при этом осмолярность мочи повышается. Концентрационная функция почек регулируется АДГ— гормоном ГГНС. АДГ выделяется в кровь под воздействием специфических стимулов, тем или иным образом связанных с недостатком воды в организме. И наоборот, когда воды в организм поступает достаточно, секреция АДГ минимальна. Таким образом, водный баланс поддерживается, в основном, почками, и регулируется АДГ, который синтезируется в ГГНС. Кроме того, АДГ обладает мощным сосудосуживающим действием, за что получил второе название — вазопрессин.
Материалы и методы
Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Wistar (питомник Кардиологического Научного Центра РАМН, Москва) весом 200-250 г: Животные содержались по 5 в клетке, получали свободный доступ к воде и сухому корму. Световой день составлял 14 часов. Адаптация к условиям вивария (кафедра гистологии педиатрического факультета Российского государственного медицинского университета и лаборатория микроанатомии медицинского факультета университета г. Йена, Германия) проводилась в течение 2 недель. За это время животных приучали к рукам ухаживающего персонала. За день до начала эксперимента животных взвешивали и рассчитывали дозировки ЛПС.
Всего в экспериментах, с учетом проведения предварительных опытов для отладки методик и повторных опытов, было задействовано 112 крыс.
1. Контроль (6 крыс). С помощью одноразового инсулинового шприца крысам внутрибрюшинно вводили 300 мкл стерильного физиологического раствора.
2. Однократное введение ЛПС. Использовали ЛПС, полученный из культуры Esherichia coli (Серотип 0111:В4, №L-3012, лот №36Н4130, Sigma, США). Дозировка ЛПС составляла 250 мкг на 100 г веса животного. За день до начала эксперимента готовили базовый раствор ЛПС, из которого отбирали нужное количество и растворяли до окончательного объема 300 мкл стерильным физиологическим раствором. Инъекции выполняли одноразовыми инсулиновыми шприцами. Крысы из экспериментальной группы были убиты декапитацией через 3 ч (7 крыс), 6 ч (9 крыс), 12 ч (7 крыс) и 24 ч (7 крыс) после введения ЛПС. После декапитации кровь их туловища собирали в охлажденные гепаринизированные пробирки, центрифугировали, собирали плазму и замораживали ее на сухом льду для последующего определения содержания натрия. Пробы мочи были получены путем аспирации шприцом из мочевого пузыря после декапитации. Для проведения гибридизации in situ, полуколичественного ПЦР с обратной транскрипцией и определения количества белка аквапорина-2 методом Western blotting сразу же после декапитации почки или их части иссекались, замораживались на сухом льду и хранились в пластиковых контейнерах при -70"С до проведения анализа.
Результаты
После внутрибрюшинного введения ЛПС изменений в концентрации Na в плазме крови (и, следовательно, осмолярности) не отмечалось (таблица 1).
Через 3 ч после внутрибрюшинного введения ЛПС происходило выраженное снижение осмолярности мочи (на 65% от исходного уровня), которое сохранялось в течение суток (ниже 50% от исходного уровня через 24 часа).
Введение ЛПС вызывает снижение связывания радиоактивного лиганда с Уг-рецептором мембранами собирательных трубочек (таблица 2, рисунок 9). Параллельно с этим отмечалось выраженное снижение уровня мРНК Уг-рецептора (рисунок 10А и Б). Так, уровень мРНК Уг-рецептора снижался более чем на 90% от исходного уровня через 3 и 6 ч после введения ЛПС и постепенно нарастал к 24 ч, но даже к этому времени не достигал контрольных величин.
Через 3 ч после введения ЛПС уровень белка аквапорина-2 значительно снижался, оставаясь пониженным вплоть до 24 ч (таблица 3, рисунок 11А и Б). При этом статистически значимое снижение обнаружено только в гликозилированной форме аквапорина-2 с молекулярным весом 36—45 кД.
Иммуногистохимическое окрашивание на аквапорин-2 после введения ЛПС показало, что через 6 часов после введения ЛПС общая интенсивность окрашивания уменьшается с преимущественным снижением окраски на апикальной мембране главных клеток собирательных трубочек. Однако типичный характер окрашивания с более интенсивным окрашиванием апикальной мембраны и слабоокрашенной цитоплазмой сохраняется (рисунок 12).
При изучении экспрессии мРНК аквапорина-2 оказалось, что ее уровни также снижаются. При этом максимальное снижение отмечалось через 3 и 6 часов, но уже через 12 часов уровни мРНК аквапорина-2 не отличались от контрольных. Важно отметить, что к 24 ч уровни мРНК аквапорина-2 даже несколько превышали контрольные величины (на 20%). Однако подобное нарастание не было статистически достоверным (рисунок 13).
Обсуждение
Как и было показано ранее188, однократное внутрибрюшинное введение ЛПС не влияет на осмолярность плазмы крови. Также известно, что в аналогичной модели уровень АДГ в плазме крови остается неизменным. Это можно объяснить тем, что, с одной стороны, осмолярность плазмы остается неизменной, ас другой, что воспаление, вызванное введением ЛПС, не приводит к выраженному снижению АД, которое бы могло стимулировать выделение АДГ.
Однако, несмотря на это, отмечалось выраженное нарушение концентрационной функции почек: после введения ЛПС осмолярность мочи снижалась более чем на 60% и даже через 12 часов достигала лишь половины от исходного уровня. Это хорошо согласуется с результатами других работ, в которых показано, что даже небольшое и кратковременное воздействие на почку, приводит к очень выраженным и длительным изменениям, в частности, к нарушению концентрационной функции кровотока и, в итоге, к уменьшению объема мочи190. Это может объяснить отсутствие полиурии при нарушенной концентрационной функции.
Таким образом, можно предположить, что в отсутствии выраженных влияний со стороны АДГ, гемодинамических и осмотических стимулов, те изменения, которые происходят в почках при введении ЛПС, связаны с действием факторов воспаления, как синтезирующихся локально, так и поступающих из системного кровотока. То есть при воспалении собирательные трубочки почки выходят из-под контроля АДГ и регуляция их функции осуществляется под действием факторов воспаления.
Уг-рецептор после введения ЛПС. В настоящей работе было показано, что воспаление, вызванное однократной инъекцией ЛПС, приводит к выраженному снижению уровней биологически активного Уг-рецептора на мембранах собирательных трубочек почки. Одного этого уже достаточно, чтобы вызвать нарушение концентрационной функции почки, поскольку снижение числа активного Уг-рецептора автоматически приведет к нарушению выхода аквапорина-2 на апикальную мембрану и, соответственно, функции собирательных трубочек в целом (что и проявляется в снижении осмолярности мочи).
Выводы и заключение
1) Воспаление, вызванное введением ЛПС не вызывает существенных изменений в осмолярности плазмы. Однако при этом происходит отчетливое снижение осмолярности мочи.
2) В условиях воспаления снижается синтез Уг-рецептора и аквапорина-2 в собирательных трубочках почки. Таким образом, почка частично выходит из-под контроля АДГ.
3) Описанные изменения сочетаются с нарастанием в мозговом веществе почки экспрессии воспалительных цитокинов— интерлейкина-13 и интерлейкина-6.
4) В условиях воспаления отмечается диссоциация между динамикой возвращения к исходным значениям уровней белка и мРНК аквапорина-2.
5) В условиях острого воспаления не выявлено нарастания фрагментации ДНК (т.е. апоптоза) в мозговом веществе почки, что отражает сохранность клеток собирательных трубочек и свидетельствует о временном характере происходящих в них изменений синтеза V2-рецептора и аквапорина-2.
Заключение. За последнее десятилетие наши знания о физиологии и патологии водного баланса претерпели существенные изменения, наиболее значимые из которых— понимание механизмов работы V-рецепторов и открытие белков водных каналов — аквапоринов. Почти сразу же эти фундаментальные открытия нашли практическое применения. В качестве одного из примеров можно привести нефрогенный несахарный диабет, патогенез которого стал понятен только после открытия Уг-рецептора и аквапорина-2. В последние годы внимание ученых сосредоточилось на способности почки адаптироваться к различным патологическим процессам: системному воспалению (сепсис), нарушению кровоснабжения (сосудистый шок), нарушению оттока мочи (мочекаменная болезнь). Интересно, что несмотря на столь разные патологические процессы, во многих работах звучит вывод о том, что в патологических условиях почка выходит из под контроля традиционных факторов. Любопытно и то, что нарушения функции почки также носят сходный характер: на фоне морфологически сохранных структур нефрона отмечается выраженное снижение уровня аквапорина-2 в собирательных трубочках, что выражалось в нарушении концентрационной способности почки и падении осмолярности мочи. В тоже время, изменения, происходящие С V2-рецептором в патологических условиях, почти не изучены и здесь настоящая работа отчасти восполняет этот пробел.
Дальнейшие исследования в этой области должны быть выполнены на более серьезном методическом уровне. Чрезвычайно скупы сведения о регуляции экспрессии гена Уг-рецептора и очень немногое известно о регуляции активности готового белка. Необходимо продолжить изучение роли цитокинов в регуляции функции собирательных трубочек. Эти молекулы могут действовать как сами по себе, так и вызывать синтез других регуляторных молекул, таких как эйкозаноиды и окись азота. Данные о влиянии простагландинов на ген и молекулу аквапорина-2 также противоречивы и требуют дальнейшего уточнения. Возможно, что опыты на культурах клеток, экспрессирующих Уг-рецептор и аквапорин-2 помогут найти ответы на эти вопросы и заполнить пробел в этой области знаний о физиологии и патологии водного обмена.
![Некоторые патогенетические и прогностические факторы хронической сердечной недостаточности у больных сахарным диабетом 2-го типа [Электронный ресурс]](/i/i/4416/213137.png "Некоторые патогенетические и прогностические факторы хронической сердечной недостаточности у больных сахарным диабетом 2-го типа [Электронный ресурс] Починка Илья Григорьевич")
![Клинико-морфологическая характеристика и течение инфаркта миокарда при его сочетании с гипертонической болезнью и сахарным диабетом 2-го типа [Электронный ресурс]](/i/i/4482/196489.png "Клинико-морфологическая характеристика и течение инфаркта миокарда при его сочетании с гипертонической болезнью и сахарным диабетом 2-го типа [Электронный ресурс] Золотова Татьяна Евгеньевна")
