Введение к работе
Актуальность исследования. Участие типовых патологических процессов -стресса и гипоксии - в патогенезе различных заболеваний ставит перед современной медициной проблему повышения резистентности организма к таким повреждающим факторам. В основе действия этих факторов, реализующихся, в том числе, при истощающих острых физических нагрузках (ОФН) лежит активация свободнорадикальных процессов, поэтому актуальной проблемой является коррекция состояний организма, связанных с чрезмерным увеличением уровня активных форм кислорода (АФК). В качестве такой защиты нередко используют экзогенные антиоксиданты, однако их применение не всегда эффективно, поскольку вызывает подавление собственной, эндогенной антиоксидантной системы организма [Сазонтова Т.Г. и др., 1987; Mosconi С. et al., 1988; Buckman T.D. et al. 1993; Barja G. et al., 1994; Jaeschke H., 1995]. Поэтому перспективными являются методы, позволяющие ограничивать чрезмерную активацию свободнорадикальных процессов за счет индукции синтеза собственных защитных, в частности, антиоксидантных систем, путем периодического, ограниченного по интенсивности АФК-сигнала. К таким методам относятся адаптационные тренировки с помощью периодического изменения уровня кислорода при нормобарической или гипобарической гипоксии.
К настоящему времени показано, что помимо известной роли избыточного уровня АФК в развитии патологических состояний [Меньшикова Е.Б. и др., 2008] образование АФК и инициация свободнорадикальных процессов является естестественным, физиологическим процессом, постоянно протекающим в организме. При этом главными физиологическими функциями АФК являются: окисление поврежденных молекул с целью их дальнейшей утилизации [Ungemach F.R., 1985; Сазонтова Т.Г., 1989; Zolotarjova N. et al., 1994], синтез молекул мессенджерного типа, например, эйкозаноидов при свободнорадикальном окислении ПНЖК фосфолипидов [Hemler М.Е. et al., 1979; Roberts A.M. et al., 1981] и сигнальная роль АФК.
В последние годы активно изучается роль редокс-сигнализации и АФК-зависимой внутриклеточной системы передачи внешнего сигнала к клеточному ядру с последующей инициацией синтеза белков [Semenza G.L., 1999; Chandel N.S., et al., 2000]. Показано, что при физиологических условиях АФК участвуют в ключевых регуляторных механизмах клетки [Nanji А.А. et al., 1995; Lee P.J. et al., 1996; Suzuki Y.J. et al, 1997]. Благодаря АФК, инициирующих редокс-сигнализацию, в отсутствие специфических рецепторов развивается клеточный ответ на действие гипоксии, окислителей и восстановителей. Помимо этого, медиаторы, действие которых опосредовано специфическими рецепторами - гормональными, цитокиновыми, также активируют неспецифическую редокс-сигнализацию и участвуют в перекрестной активации и взаимодействии рецепторов, что является основой перекрестных эффектов адаптации, при которых тренировка к одному повреждающему фактору повышает резистентность организма к действию другого фактора.
Важнейшим следствием инициации редокс-сигнализации является активация факторов транскрипции: NF-kB [Flohe L. et al., 1997], AP-1 [Maulik N. et al., 1999], HIF-la, HIF-3a [Wiener CM. et al., 1996; Semenza G.L., 1999; Сазонтова Т.Г. и др., 2007], индуцирующих защитные белки и способствующих адаптации и выживаемости организма. Так, к настоящему времени известно более 60 генов, активируемых HIF-la. Основными белками ответа на АФК-сигнал при стрессе, гипоксии, ишемии являются ферменты антиоксидантной защиты, белки семейства HSP, Fe-регулируюшие белки, ферменты репарации, пероксиредоксины [Graven К.К. et al., 1993; Maulik N. et al., 1999; Peng J. et al., 2000; Ryter S.W. et al., 2000; Zhukova A.G. et al., 2004]. В результате
редокс-сигнализация приводит к насыщению клетки молекулами, повышающими ее защиту от повреждающих воздействий, причем эндогенная, т.е. сформировавшаяся в самой клетке защита [Ни M.L., et al., 1989; Mosconi С, et al., 1988] эффективней внешней, с помощью экзогенных добавок. Причина этого лежит в кратности действия редокс-сигнализации, при которой АФК-индукция факторов транскрипции и протекторных белков, в том числе антиоксидантов, сменяется их ингибированием высоким уровнем тех же антиоксидантов, и синтез защитных белков прекращается. Для повторной индукции защитных систем необходим новый АФК-сигнал, поэтому с помощью поступления периодических АФК-сигналов и следующей за ними индукции протекторных систем реализуется основной принцип периодической адаптации. Так, повторяющаяся, ограниченная генерация АФК с последующим синтезом протекторных систем является механизмом повышения резистентности организма при адаптации к стрессу [Сазонтова Т.Г. и др., 1987], физическим нагрузкам [Сазонтова Т.Г., 1989; Powers S.K. et al., 1994], холоду [Spasic М.В. et al, 1993], гипоксии [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], пищевым адаптогенам [Sanz M.J. et al., 1994; Cai Y.N. et al., 1995], диете с ПНЖК n-3 класса [Hu ML. et al., 1989; Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. 1995], на основе чего сформулирована концепция участия АФК в создании неспецифической компоненты повышения устойчивости организма [Sazontova T.G. et al., 2007] при периодически действующем факторе внешней среды.
Показано, что длительное применение адаптации к интервальной нормобарической гипоксии повышает резистентность мембран сердца, печени и коры головного мозга к действию АФК, однако формирование защитного эффекта за более короткое время требует углубления гипоксии, увеличения АФК-сигнала, что ведет к чрезмерному синтезу защитных белков и, тем не менее, отсутствию ограничения интенсивности АФК-процессов [Sazontova T.G. et al., 1994].
Для увеличения эффективности адаптации и усиления АФК-сигнала без побочных эффектов, периоды нормоксии при адаптации к гипоксии заменили периодами умеренной гипероксии, что усилило АФК-сигнал без углубления гипоксии. Новый вид адаптации к гипоксии и умеренной гипероксии (патент № 2289432 от 20.12.2006 г.), отличается более ранним, чем при гипоксии-нормоксии, повышением резистентности мембранных структур [Сазонтова Т.Г., 2004] и более быстрым достижением защитного эффекта у больных ИБС [Маев Э.З., и др., 2004], что важно для практики применения этого метода в терапии и профилактике.
Несмотря на то, что за последние 5 лет показана потенциальная способность нового метода адаптации в защите мембранных структур от АФК-индуцированных повреждений in vitro [Жукова А.Г., 2007], ничего не известно о возможности реализации подобного защитного эффекта адаптации к гипоксии-гипероксии на уровне организма. Отсутствуют исследования защитных эффектов нового вида адаптации при повреждениях, вызванных ограничением подвижности или, напротив, истощающей, острой физической нагрузкой (ОФН), хотя оба эти фактора реализуют свое действие посредством активации АФК-процессов, защита от которых показана in vitro при адаптации к гипоксии-гипероксии. Восполнить этот пробел было задачей настоящего исследования.
Кроме того, поскольку адаптация к комбинированному действию факторов внешней среды: физическим нагрузкам, холоду, и/или гипоксии зачастую обладает большей эффективностью, чем адаптация к каждому из них по отдельности, а истощающая ОФН, подобно соревновательной, обладает гипоксической и стрессорной компонентой, было основание полагать, что тренировка к физическим нагрузкам, в комбинации с адаптацией к гипоксии и/или гипероксии, может оказаться
более эффективной в отношении повышения физической выносливости организма. Однако, подобные исследования малочисленны, а в отношении адаптации к гипоксии-гипероксии вообще не проводились, поэтому вопрос об эффективности и перекрестных эффектах такой адаптации остается открытым. Поиск ответа на этот вопрос также явился предметом настоящего исследования.
Цель данного исследования состояла в комплексном изучении влияния адаптации к гипоксии и гипероксии на эффективность тренировок к физическим нагрузкам и роли свободнорадикальных процессов и индуцибельных и конститутивных белков семейства HSP в повышении физической выносливости.
В рамках этой цели решали следующие экспериментальные задачи:
Оценить интенсивность свободнорадикальных процессов и уровень индукции белков срочного ответа: ферментов антиоксидантной защиты, индуцибельных HSP72 и НОх-1 и конститутивной - НОх-2 при гипокинезии разной длительности в сердце и печени.
Изучить возможность предупреждения с помощью предварительной адаптации к интервальной нормобарической гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии снижения устойчивости мембранных структур при гипокинезии.
Оценить влияние преварительного, однократного сеанса гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии на уровень компонентов редокс сигнализации -фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией - HIF-la и белков семейства HSP при острой физической нагрузке.
Выявить возможность ограничения с помощью адаптации к изменению уровня кислорода активации свободнорадикальных процессов и индукции синтеза стресс-белков - HSP72, НОх-1 и железо-регулирующего белка IRP при истощающей острой физической нагрузке.
Оценить влияние адаптации к гипоксии-нормоксии и к гипоксии-гипероксии на физическую выносливость, а также комбинации адаптации к изменению уровня кислорода с тренировками к физическим нагрузкам на эффективность таких тренировок.
Сравнить действие адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии при использовании их отдельно или совместно с тренировкой к физическим нагрузкам на уровень свободнорадикального окисления и синтез индуцибельных - HSP72, НОх-1 и конститутивных белков - HSC73, НОх-2, SERCA 2.
Научная новизна определяется основными результатами работы.
Впервые изучено действие гипокинезии различной длительности на резистентность мембранных структур к действию АФК. Через 3 ч в сердце и печени резистентность снижена на фоне роста в сердце уровня защитных белков -антиоксидантных ферментов и конститутивной НОх-2 и, напротив, снижения в печени уровня СОД, конститутивной, и индуцибельной гемоксигеназы. Увеличение длительности гипокинезии до 72 ч приводит в сердце к массированному синтезу защитных белков, что стабилизирует резистентность мембран к действию АФК; в то же время, в печени интенсивность АФК-процессов нарастает при ингибировании протекторных белков.
Впервые показано, что предварительная адаптация к изменению уровня кислорода ограничивает повышенную активацию свободнорадикального окисления -при гипоксии-гипероксии на 81%, при гипоксии-нормоксии на 32% - и синтез индуцибельных стресс-белков семейства HSP, вызванных гипокинезией в сердце, скелетной мышце и печени. При этом установлено, что адаптация к периодической
4 гипоксии-гипероксии обладает более выраженным, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, протекторным действием.
При сопоставлении изменения уровня компонентов редокс сигнализации -фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией HIF-la и стресс-белков: HSP72 и НОх-1 - выявлена сходная динамика их индукции при истощающей ОФН до и после однократного сеанса гипоксии-нормоксии или гипоксии-гипероксии. Индукция HIF-la в сердце происходит значительно быстрее, чем в печени. Впервые обнаружено, что прекондиционирование с помощью однократного сеанса гипоксии-гипероксии, но не гипоксии-нормоксии, повышает физическую выносливость организма в 1,4 раза и снижает синтез стресс-белков при истощающем ОФН.
Впервые выявлена возможность повышения выносливости при ОФН с помощью нового вида адаптации к периодической гипоксии-гипероксии. Установлено, что предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии обладает большей эффективностью, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, в повышении длительности и интенсивности плавания при истощающей ОФН.
Впервые проведено сравнение действия адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии при истощающей ОФН. Оба вида адаптации ограничивают свободнорадикальные процессы, восстанавливают до контроля сниженную при ОФН активность ферментов антиоксидантной защиты и предупреждают повышенную индукцию синтеза HSP72 в печени и в сердце. Адаптация к гипоксии-гипероксии, но не к гипоксии-нормоксии, также снижает в сердце и печени повышенный уровень НОх-1 и восстанавливает уровень 1RP.
Впервые проведена сравнительная оценка влияния двух видов адаптации к изменению уровня кислорода при использовании их отдельно или в комбинации с тренировками к физическим нагрузкам на длительность и интенсивность истощающего плавания. Совмещение тренировки к физическим нагрузкам с адаптацией к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии увеличивает длительность плавания в 2-3 раза. Комбинация физической тренировки с адаптацией к гипоксии-нормоксии не влияет на интенсивность плавания, а с адаптацией к гипоксии-гипероксии - повышает до 90% долю активного плавания от общего времени удержания на воде.
Впервые показано, что комбинация двух видов тренировок: к физическим нагрузкам и к изменению уровня кислорода, особенно эффективно в режиме гипоксии-гипероксии, ограничивает активацию свободнорадикальных процессов при ОФН при более экономном синтезе АФК-зависимых белков, что проявляется в снижении в сердце и печени повышенной при физической тренировке активности ферментов антиоксидантной защиты, НОх-1 и железорегулирующего белка IRP. Впервые при тренировке к физическим нагрузкам в сердце показано увеличение уровня конститутивных HSC73 и НОх-2 - в 1,8 раза и индуцибельной НОх-1, что в целом свидетельствует о наличии гипоксической компоненты такой тренировки. Совмещение физической тренировки с адаптацией к гипоксии-гипероксии, но не к гипоксии-нормоксии уменьшает гипоксическую компоненту.
Впервые выявлено антистрессорное и стимулирующее физическую активность действие нового вида адаптации к гипоксии-гипероксии. Комбинация такой адаптации с тренировкой к физическим нагрузкам значительно более эффективна, чем отдельные виды адаптации. Это явление выражается в наибольшем повышении выносливости организма, что связано с увеличением резистентности мембранных структур к свободнорадикальным процессам и нормализацией уровня АФК-индуцибельных и
5 конститутивных белков HSC73, НОх-2, IRP и SERCA-2, ответственного за Са-гомеостаз сердца.
Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней благодаря проведенному комплексному исследованию впервые показано защитное действие адаптации к гипоксии-гипероксии от стрессорных и гипоксических нарушений, индуцированных гипокинезией и острой истощающей физической нагрузкой и изучена роль свободнорадикальных процессов и адаптационного синтеза индуцибельных и конститутивных белков в повышении физической выносливости организма.
Практическое значение работы определяется тем, что в ней на основе сравнительного изучения эффективности и цены адаптации к гипоксии-нормоксии и к гипоксии-гипероксии экспериментально обоснована возможность расширения спектра применения адаптации к периодическому изменению уровня кислорода, т.е. использования ее в тех случаях, при которых данная адаптация ранее не применялась или была малоэффективна - при защите от активации свободнорадикальных процессов в сердце и повышении физической выносливости и устойчивости к стрессогенным, соревновательным нагрузкам.
Положения, выносимые на защиту.
Кратковременная и длительная гипокинезия повышает интенсивность свободнорадикальных процессов с одновременным увеличением уровня защитных белков в сердце и снижением их в печени. Предварительная адаптация к периодической гипоксии-гипероксии в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии ограничивает вызванную гипокинезией активацию свободнорадикальных процессов и увеличение уровня индуцибельных стресс-белков HSP72 и HSP32 в сердце, скелетной мышце и печени.
Однократный сеанс гипоксии-гипероксии, но не гипоксии-нормоксии, повышает физическую выносливость организма при истощающем плавании и предотвращает вызванное острой физической нагрузкой увеличение уровня стресс-белков семейства HSP. Изменение уровня стресс-белков - индуцибельных форм HSP72 и НОх-1 и фактора транскрипции HIF-la имеет сходную динамику, причем индукция HIF-la в сердце происходит значительно быстрее, чем в печени.
Предварительная адаптация к периодической гипоксии-гипероксии, в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии повышает физическую выносливость при истощающей физической нагрузке. Оба вида адаптации ограничивают повышенную интенсивность свободнорадикальных процессов, свойственную такой нагрузке, восстанавливают сниженный уровень активности ферментов антиоксидантной защиты и предупреждают чрезмерную индукцию стресс-белка HSP72, а в случае адаптации к гипоксии-гипероксии, также нормализуется уровень НОх-1 и железорегулирующего белка IRP.
4. Сочетание адаптации к гипоксии-гипероксии с тренировкой к физическим
нагрузкам значительно более эффективно, чем отдельные виды адаптации. Это
выражается в повышении эффективности тренировок, увеличении резистентности
мембран к свободнорадикальным процессам при более экономном функционировании
- нормализации в сердце и печени повышенного при физической тренировке уровня
антиоксидантных ферментов, НОх-1 и IRP, а при адаптации к гипоксии-гипероксии, и
синтеза конститутивных белков HSC73, НОх-2 и SERCA-2, ответственного за Са-
гомеостаз сердца.
Апробация работы: Апробация работы проведена на заседании межлабораторной конференции ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН
14.04.2009г. (г. Москва). Основные положения работы были доложены и обсуждены на VIII Международном научном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006); V Международном конгрессе по патофизиологии (Beijing, China, 2006); на XIII конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» (Москва, 2006); VI Международной конференции "Hypoxia in Medicine" (Milan, Italy, 2006); V Международном симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 2007); XX Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007); Всероссийской научной конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы состоит из 233 источника. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками, 4 таблицами и 7 схемами.
