Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Этиология миокардитов. 7
1.2. Патогенез миокардита и его осложнение - сердечная недостаточность .8
Глава 2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Характеристика обследованных больных . 42
2.2. Функциональные методы исследования. 46
2.3. Иммунологические методы исследования . 49
2.4. Серологические методы исследования. 52
2.5. Статистические методы обработки полученных результатов. 53
Глава 3. Результаты исследований 54
3.1. Данные клинического исследования 54
3.2. Роль иммунных факторов в развитии СН у больных миокардитом и МКС . 67
Глава 4. Заключение 78
Выводы 90
Практические рекомендации 91
Список литературы 92
- Патогенез миокардита и его осложнение - сердечная недостаточность
- Характеристика обследованных больных
- Иммунологические методы исследования
- Роль иммунных факторов в развитии СН у больных миокардитом и МКС
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В последние годы отмечается неуклонный рост некоронарогенных заболеваний миокарда (НЗМ), в связи с чем они продолжают оставаться одной из основных проблем сердечно-сосудистой патологии [28,31]. Ведущее место среди НЗМ по распространенности и тяжести занимают миокардиты. Согласно данным отечественных и зарубежных авторов, на них приходится от 9% до 11% общего числа кардиологических больных. В период вирусных инфекций электрокардиографические (ЭКГ) признаки повреждения миокарда встречаются в 12-43% случаев [29]. Важным признаком НЗМ является, в большинстве случаев, прогрессирующее снижение сократительной способности сердечной мышцы, нарушение системной гемодинамики, вторично присоединяющееся поражение практически всех органов и систем, а значит - ухудшение качества жизни пациентов, снижение или полная утрата трудоспособности, что определяет большое медико-социальное значение этой группы болезней. Публикации последних лет доказывают, что рецидивирующее или затяжное течение миокардита (более трех месяцев) и трансформация его в хронический миокардит являются основной причиной развития застойной сердечной недостаточности у молодых людей [153,179].
В настоящее время в литературе накоплен значительный фактический материал, касающийся непосредственного участия иммунной системы в патогенезе миокардитов [106, 151, 152]. Иммунокомпетентные клетки и различные цитокины играют значительную роль в развитиии очаговых и диффузных изменений в миокарде, определяя в конечном счете характер структурных перестроек ткани миокарда.
Представленные в литературе сведения относительно состояния иммунной системы при миокардитах немногочисленны и весьма противоречивы [18,19].
Активация Т-лимфоцитов сопровождается продукцией цитокинов, обладающих цитотоксической активностью в отношении различных антигенных детерминант. Кроме того, активация В-звена иммунитета необходима для выработки антимиокардиальных аутоантител.
В связи с тем, что основным осложнением миокардита является сердечная недостаточность, очень важным становится изучение роли иммунных факторов повреждения (цитокинов, LAK клеток, аутоантител к кардиомиозину) в развитии и прогрессировании СН у больных миокардитом.
Цель исследования.
Целью нашего исследования явилось изучение роли иммунной системы в развитии и прогрессировании сердечной недостаточности у больных с ИИМ и оценка диагностической значимости полученных результатов.
Задачи исследования.
1. Изучить изменения уровней цитокинов у больных ИИМ и МКС.
2. Изучить изменения уровня тропонина у больных ИИМ.
3. Изучить особенности изменения факторов клеточной агрессии у больных ИИМ и МКС.
4. Изучить состояние В-клеточного звена иммунной системы и аутоантител у больных ИИМ и МКС.
5. Оценить роль иммунной системы в формировании СН у больных ИИМ и МКС.
Научная новизна.
Впервые выявлен механизм озлокачествления течения миокардитов, связанный с формированием цитотоксических реакций, антител-опосредованных и направленных на неинфицированные кардиомиоциты. Причиной таких изменений, на наш взгляд, может служить выявленный нами дисбаланс в системе регуляторных цитокинов (ФНОос, ИНФа, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ12).
Практическая значимость работы.
Выявленные нами цитотоксическая активация и высокая продукция аутоантител у больных со злокачественным миокардитом, может служить основанием для назначения иммуносупрессивной терапии. Выявленный дисбаланс регуляторных цитокинов может служить основанием для назначения иммуномодулирующей терапии, однако, это требует дополнительного изучения.
Внедрение в практику.
Результаты исследований используются в клинической практике кардиопульмонологического отделения МОНИКИ и педагогической работе ФУВ МОНИКИ.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на IX Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2003) и III Конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2003).
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глав, посвященных описанию материалов, методов и результатов исследований, заключения, выводов, а также списка литературы, включающего 226 работ, отечественных 47 и 179 зарубежных авторов. Объем работы - 115 печатных страниц, включая 7 таблиц, 10 графиков и 6 рисунков.
Публикации.
По теме диссертация опубликовано 27 работ.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Дисбаланс в системе регуляторных цитокинов играет существенную роль в формировании СН у больных ИИМ.
2. Цитотоксические реакции при злокачественном течении миокардита опосредуются через аутоантитела, направленные против неинфицированных кардиомиоцитов.
Патогенез миокардита и его осложнение - сердечная недостаточность
Инфекционный агент может вызывать развитие миокардита как путем непосредственного проникновения в ткани сердца или выработки токсина, к которому чувствительны миокардиоциты, так и в результате иммунных нарушений, приводящих к повреждению миокарда. Роль различных факторов в патогенезе миокардита у конкретного больного установить трудно.
Морфологическим субстратом различных видов миокардита является сочетание альтеративных, дистрофически-некробиотических изменений мышечных клеток и экссудативно-пролиферативных изменений интерстициальной ткани.
В основе развивающегося воспаления лежат взаимосвязанные процессы повреждения тканей, клеток, выделения медиаторов, реакции микроциркуляторного русла с нарушением реологических свойств крови, повышение проницаемости сосудов.
А.И.Струков (1972) выявил нарушения основной субстанции соединительнотканной стромы сердечной мышцы при миокардитах. Они проявляются процессами деполимеризации белково-мукополисахаридных комплексов, сопровождающимися повышением сосудисто-тканевой проницаемости, что обусловливает инсудацию белков крови между коллагеновыми фибриллами и протофибриллами.
Большое значение в развитии изменений стромы миокарда при воспалении играют ферменты клеток воспалительного инфильтрата (гистиоциты, макрофаги, полиморфно-ядерные лейкоциты, моноциты). В этих клетках усиливается активность гидролаз: кислой фосфатазы, бета-глюкуронидазы, аминопептидазы. Кроме того, повышается активность окислительно-восстановительных ферментов. Под влиянием медиаторов воспаления - гистамина, серотонина, брадикинина - нарушается структура микрососудов вследствие активного сокращения эндотелиальных клеток с их округлением и образованием щелей между ними, что способствует повышенной проницаемости сосудистой стенки, развитию отека, геморрагии, гипоксии.
Сложные пусковые механизмы воспаления обусловливают развитие гипоксии миокарда, что в свою очередь, ведет к нарастающему ацидозу сердечной мышцы. В условиях ацидоза происходит усиленный распад АТФ, вследствие чего в миокардиоцитах нарушается физиологическое равновесие электролитов, развивается миолиз. Результатом всех этих процессов является нарушение сократительной способности миокарда [31]. Среди сложных метаболических нарушений в сердечной мышце при миокардите особую роль играют процессы, связанные не с нарушением доставки кислорода, как при коронарогенных поражениях, а с нарушением утилизации кислорода кардиомиоцитом, обусловленным изменениями в самой системе энергетического обеспечения миокарда. Исследования биоптатов миокарда больных миокардитом позволили установить прямую корреляционную взаимосвязь между степенью изменения энергетической функции митохондрий (ускорение окисления сукцината, снижение степени окислительного фосфорилирования) с выраженностью СН [38]. Основное повреждение системы энергообразования при миокардитах связано с нарушением структуры митохондрий [23, 24] и накоплением ненасыщенных жирных кислот [23, 158] в результате нарушения гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях [12, 14, 42]. Повышение отношения лактат/пируват и развитие ацидоза сопровождается значительным снижением содержания НАД и увеличением НАДН+, а также потерей митохондриями цитохрома С - ключевого фермента цепи переноса электронов [14,15,16, 26, 40]. К. Quartini et al., (1995) установили, что при ДКМП и миокардите имеет место компенсаторное увеличение общего содержания ЛДГ, которое коррелирует с повышением ЛДГ5 в биоптатах [44, 45, 184, 195]. Оно происходит на фоне снижения содержания миокардиальных ферментов [6, 52, 195]. Повышенное содержание изоэнзимов ЛДГ в миокарде коррелирует со снижением ФВ. Показано, что у больных миокардитом происходит снижение содержания в миокарде нуклеиновых кислот, гликогена, синтеза АТФ, активации протеолитических ферментов и увеличение числа рибосом, усиление синтеза белка [6, 27, 31]. При этом у 11% больных ДКМП наблюдается повышение продукции миокардом лактата. Дилатация полостей миокарда ведет к повышению потребления миокардом кислорода и экстракции лактата в кровь [184]. Нарушение утилизации кислорода при миокардите влечет за собой трехкратное повышение содержания в крови недоокисленных продуктов превращения углеводов - лактата и пирувата. Большинство исследователей указывают на прямую связь между образованием лактата, увеличением отношения лактат/пируват и степенью декомпенсации СН [22, 38] (рисунок 1). При развитии гипоксии падает степень повышения сродства гемоглобина к кислороду, развивающаяся как результат накопления в крови недоокисленных продуктов обмена и развития ацидоза. И происходит это на фоне нарушения утилизации кислорода вследствие присоединения гистотоксической гипоксии. Говоря о метаболических расстройствах при миокардитах, следует отметить активацию перекисного окисления липидов. Чрезмерная активация свободно - радикального окисления играет основную роль в повреждении мембран клеток, которое ведет к изменению структурно-функциональных свойств мембран и внутриклеточного метаболизма [9, 14, 15,16, 37].
Характеристика обследованных больных
Определение серологического уровней ТпТ и ТпІ у пациентов с подозрением на миокардит было продемонстрировано в некоторых исследованиях [51, 53, 58, 80,91,92,99,122,134,137,138,140,205].
Интересным в этом плане представляется исследование B.Lauer et al. (1998), целью которого было установить: (1) может ли измеряемый уровень ТпТ у этих пациентов ощутимо определять гибель миокардиоцитов; (2) до какой степени это коррелирует с результатами ЭМБ; и (3) может ли измерение ТпТ обеспечить неинвазивную диагностику миокардита. Повышенный уровень ТпТ ( 0,1нг/мл) был обнаружен у 28 из 80 пациентов (35%). Миокардит был диагностирован иммуногистологически у 26 из 28(93%) с повышенным уровнем ТпТ и у 23 из 52 (44%) с нормальным уровнем ТпТ. Уровень ТпТ чаще повышался у пациентов с более короткой, чем с более длинной продолжительностью миокардита. После 6 месяцев уровень ТпТ был повышен только у 4 из 28 пациентов с миокардитом, но при ЭМБ обнаружены признаки текущего миокардита у 14 пациентов. Таким образом, было показано, что измерение ТпТ - очень чувствительный путь обнаружения миокардиального повреждения клетки у пациентов, клинически подозреваемых в наличии миокардита и чувствительность данного метода тем выше, чем на более ранних сроках после появления признаков миокардита он был измерен. Миокардиальное повреждение клетки может быть даже в отсутствии гистологических признаков миокардита. Дополнительный иммуногистохимическии анализ у этих пациентов часто представлен лимфоцитарной инфильтрацией. Повышенные уровни ТпТ имеют высокое прогностическое значение в определении течения миокардита в этой группе [138].
Аналогичные работы были посвящены определению уровня ТпІ у пациентов с миокардитом, экспериментальной и клинической корреляции между гистологическим и серологическим диагнозом миокардита [91, 140, 205]. Так как гистологический диагноз миокардита требует присутствия повреждения миоцита, Smith S.C. et al. (1997) стремились определить, может ли измерение Tnl помогать в диагностике миокардита [205]. Для утверждения ценности данного подхода Tnl был сначала измерен у мышей с аутоиммунным миокардитом. Tnl были повышены у 24 из 26 мышей с миокардитом, но не были повышены в любом из животных контроля (Р . 001). Затем Tnl были измерены в сыворотке 88 пациентов с подозрением на миокардит. Tnl был повышен у 18 из 53 (34%) пациентов с миокардитом и только у4из35(11%) пациентов без миокардита (Р=. 01). В данной работе было отмечено, что диагностическая ценность метода опредления Tnl тем выше, чем короче сроки миокардита.
Другая группа исследователей [ПО] оценивала повышение уровня Tnl при экстракардиальных и кардиальных болезнях, отличных от острого коронарного синдрома. В исследование было включено 102 пациента, в сыворотке которых был обнаружен Tnl с уровнем выше 0,6 нг/мл, при этом у 35 из 102 пациентов имели место другие диагнозы: кардиомиопатия, миопатия, почечная недостаточность, сепсис. Среднее значение уровня Tnl у пациентов с этими диагнозами было значительно меньше (2,0±1,9 vs 24,7± 28,2 нг/мл, р . 001).
Такое неспецифическое повышение в сыворотке Tnl при специфических экстракардиальных болезнях было отмечено и в нескольких других исследованиях [72, 81, 88, 95, 169, 170], каждое из которых ограничивалось исследованием одного заболевания. Эти исследования продемонстрировали повышение уровня Tnl при экстракардиальных болезнях, но в относительно низких диапазонах. Точный механизм, объясняющий повышение в сыворотке кардиального тропонина при заболеваниях, отличных от острого коронарного синдрома, остается неясным. В настоящее время существует несколько версий этого механизма. Одна из версий предполагает возникновение миокардиального некроза на уровне миофибрилл без образования инфаркта, при этом уровень сердечного тропонина, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, повышается в ответ на незначительное миокардиальное повреждение. Этим механизмом объясняют повышение Тп при миокардитах, застойной сердечной недостаточности, включая застойную сердечную недостаточность неишемического происхождения. Иной механизм повышения Тп в сыворотке при сепсисе. Сепсис может подавлять сердечную функцию путем генерации различных медиаторов, которые обладают прямым токсическим эффектом на сердце, что может быть причиной увеличения в сыворотке сердечного тропонина. Таким образом, для увеличения в сыворотке кардиального тропонина не обязательно наличие некроза кардиальных миофибрилл, потому что кардиальная депрессия при сепсисе полностью метаболическая и полностью обратима после лечения сепсиса. Повышение кардиального тропонина при серьезных нарушениях центральной нервной системы может быть вызвано повреждением автономного тонуса и повышенной симпатической активностью, связанной с этими нарушениями. Таким образом, определение ТпТ и Tnl может быть полезно для диагностической оценки как у пациентов с подозреваемым миокардитом, так и у пациентов, страдающих другими серьезными болезнями.
Иммунологические методы исследования
Венозную кровь пациентов стабилизировали 2,7% раствором этилендиаминтетраацетата натрия из расчета 1 мл препарата на 10 мл крови. Лимфоциты выделяли в одноступенчатом градиенте плотности по методу Boyum (1968): в стерильных условиях кровь разводили 1:2 раствором Хенкса без Са2+и Mg2+, наслаивали по 10 мл разведенной крови на 3 мл раствора фиколла/верографина с удельным весом 1,077 и центрифугировали 30 минут при 600 g. Мононуклеарные клетки, содержащиеся в интерфазе, осторожно собирали, переносили в силиконированные пробирки и трижды отмывали центрифугированием в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+ при 300 g в течение 10 минут.
Клетки ресуспензировали в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР). Содержание лимфоцитов во взвеси определяли их визуальным подсчетом в камере Горяева и доводили ЗФР до нужной концентрации. Жизнеспособность лимфоцитов определяли по прокрашиванию погибших клеток 0,1% раствором трипанового синего.
Фенотипирование поверхностных антигенов лимфоцитов Для оценки исходной экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитами периферической крови использовали взвесь клеток в ЗФР с концентрацией клеток во взвеси 2,5 млн/мл.
Реакцию проводили в микроварианте на стекле. В пленке "Parafilm" проделывали отверстия диаметром 3 мм., Приготовленную таким образом пленку фиксировали на обезжиренное предметное стекло наплавлением. В каждую образовавшуюся лунку вносили по 10 мкл раствора поли-Ь-лизина и выдерживали 30 мин. при 37С. Эту и все последующие инкубации проводили во влажной камере. По истечении времени капли поли-Ь-лизина удаляли, а затем в каждую лунку вносили по 10 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов, и препарат также выдерживали в термостате в течение 30 мин. На следующем этапе излишки клеток удаляли, после чего в лунки вносили по 4 мкл раствора соответствующих моноклональных антител. Препарат выдерживали в течение 30 мин. при 4С, затем снова промывали ЗФР и вносили в лунки по 4 мкл рабочего раствора Fab-фрагментов антимышиных антител, меченых флюорохромом. Выдерживали 30 мин. при 4С, промывали ЗФР, излишки жидкости удаляли. В лунки вносили по 20 мкл забуфе-ренного фосфатами раствора глицерина (глицерин смешивали с ЗФР 1:1 по объему). Препарат микроскопировали в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа "Люмам ИЗ". Оценивали наличие и специфичность флюоресценции (по критериям Фримель Г., 1987) не менее чем у 200 клеток. Клетки с морфологией моноцитов не учитывали. В каждом опыте проводили контроль жизнеспособности клеток с трипано-вым синим (не менее 95%), а также контроль неспецифического связывания меченной сыворотки (не более 4%). Процент клеток, неспецифически связавших меченые антитела, учитывали при оценке результатов опыта.
Микроплашки покрывали очищенным человеческим кардиомиозином при 4С на протяжении 12 часов при концентрации 10мг/мл в ОЛМ бикарбонатном буфере (рН 9,6). Затем плашки отмывали Твином 20 и стабилизировали при t 37С в течение 1 час 1% BSA. Затем снова плашки отмывали Твином 20 и добавляли сыворотку в разведении, начиная с 1/250. Сыворотку разводили дважды Твином. Разведенную сыворотку инкубировали с кардиомиозином в течение 12 часов при 4С, все тесты выполнялись дважды. Затем плашки отмывались Твином 20 и покрывались античеловеческим IgM, IgG и IgA, конъюгированные с щелочной фосфатазой (растворение 1/250) и были отмыты 50мл раствора. Затем плашки инкубировали в течение 1 час при t 37С. Плашки снова отмывались Твином 20, затем был добавлен парафенилфосфат в диэтаноламиновом буфере. Оптическая плотность была измерена при длине волны 410 nm.
Оценку цитокинового статуса проводили по результатам определения концентрации в периферической крови следующих цитокинов: интерлейкинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-12, интерферона ИФН- а, а также ФНО-а с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Для этих целей применялись коммерческие ИФА-наборы отечественного (НПО "Протеиновый контур", г. Санкт-Петербург) и зарубежного ("Innogenetics", Бельгия; "Research & Diagnostic Systems", Англия; "Biomar Diagnostics Systems", Германия; "Promega", США и др.) производства. Результаты реакции учитывали на спектрофотометре "Мультискан" (Финляндия).
Роль иммунных факторов в развитии СН у больных миокардитом и МКС
Согласно современным представлениям, повреждение миокарда при миокардитах связано, главным образом, с запуском цитотоксических иммунных реакций изначально в отношении клеток, инфицированных кардиотропным вирусом [57, 98, 176, 183]. При этом иммунные реакции направлены на осуществление основной задачи - элиминации вирусного генома. Неизбежным следствием этого является повреждение кардиомиоцитов, сопровождающееся изменением их антигенной структуры. Внутриклеточные антигены становятся доступными для контакта с иммунокомпетентными клетками, что, при определенных условиях, может послужить основой для аутоиммунизации. В случае несостоятельности механизмов контроля и самоограничения иммунного ответа происходит повреждение обширных участков миокарда. Таким образом, с точки зрения клинической иммунологии, миокардит представляет собой вариант аутоиммунного состояния [129].
Целью нашего исследования явилось изучение роли иммунной системы в развитии и прогрессировании сердечной недостаточности у больных с ИИМ и оценка диагностической значимости полученных результатов. Под нашим наблюдением находилось 46 больных с симптомами сердечной недостаточности, развившейся на фоне активного миокардита у 27 пациентов и как следствие перенесенного миокардита у 19. Клиническое состояние больных и степень СН оценивались на основании физикального и инструментального обследования. С учетом клинического статуса больных, ФК СН, гемодинамических показателей и чувствительности к проводимой терапии больные миокардитом были распределены на две группы. Первую группу (Мз) составили 12 больных, которые характеризовались злокачественным течением миокардита, что проявлялось более выраженной сердечной недостаточностью (ФК СН 3,0±0,3), чаще встречались нарушения ритма по типу политопной желудочковой экстрасистолии и пароксизмов желудочковой тахикардии, а также нарушения проводимости (АВ блокады и блокады левой ножки пучка Гиса) с плохо поддающимися коррекции симптомами СН (ФВ 25,9± 12,1%). Во вторую группу (Мд) вошли 15 больных миокардитом с более доброкачественным течением миокардита и сердечной недостаточности (ФК СН 2,5±0,6; ФВ 42,5±11,2%). Состояние иммунной системы оценивали на основании общего содержания Т- и В-лимфоцитов в периферической крови, экспрессии активационных маркеров Т- и В-лимфоцитами, уровня цитокинов: ФНОа, ИНФа, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ИЛ 12 в периферической крови, уровня аутоантител к кардиомиозину и адениннуклеотид транслокатору. С целью выявления острого повреждения миокарда использовалась тест система для определения уровня тропонина в крови.
Оказалось что, не смотря на тяжесть СН и выраженность иммунологических сдвигов уровень тропонина не превысил диагностического значения, позволяющего однозначно судить о литическом повреждении кардиомиоцитов. Лишь у одного пациента выявлен повышенный уровень тропонина в раннем сроке заболевания. Так, K.Bachmaier с соавт. (1995) была продемонстрирована почти 100% специфичность и 60% чувствительность тропонина как маркера повреждения миокарда у мышей с острым миокардитом [53]. Другая группа авторов показала, что наиболее часто повышенный уровень тропонина у больных миокардитом определяется в первый месяц от начала заболевания [137, 138, 140]. Полученные нами данные могут лишь свидетельствовать об отсутствии прямых признаков острого литического повреждения миокарда у большинства больных с миокардитом и явлениями СН.
Вероятно, в декомпенсации СН у больных миокардитом играют роль иные механизмы. Одним из механизмов, приводящий к декомпенсации СН является высокая активность цитокинов, блокирующих функцию кардиомиоцитов.
О функциональном состоянии иммунной системы принято судить на основании изучения пролиферативной активности лимфоидных клеток и продукции ими антител и цитокинов. В нашем исследовании уровень ФНОа был повышен у всех больных миокардитом, и не у одного больного МКС и здоровых доноров, а уровень ИФНа был повышен лишь у больных Мз группы.
Повышение уровня ФНОа в периферической крови больных миокардитом обычно рассматривается как фактор, утяжеляющий течение заболевания. Так, A.Matsumori с соавт. (1994) указали, что ФНОа способен подавлять сократимость кардиомиоцитов, снижать артериальное давление и способствовать развитию отека легкого [159]. Эта точка зрения хорошо согласуется с данными Y.Okura (1997), K.Bachmaier (1997), показавшими, что данный эффект ФНОа связан с его способностью активировать синтез N0-синтазы, повышая тем самым содержание в тканях окиси азота, которая, активируя гуанилатциклазу, ограничивает поступление Са в цитоплазму кардиомиоцитов и оказывает отрицательный инотропный эффект [54, 174].
Наконец, нельзя не учитывать способность ФНОа усиливать экспрессию Fas - антигена на клетках - мишенях, подготавливая их тем самым к запрограммированной клеточной гибели - апоптозу [178].
