Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Ожирение и основные звенья его патогенеза 10
1.2. Обмен липидов в организме 17
1.3. Экспериментальные модели ожирения 24
1.4. Функции печени и ее роль печени в жировом обмене 28
1.5. Морфо-функциональные характеристики гепатоцитов и клеток Куп-фера и их роль в жировом обмене 31
1.6. Функциональные связи клеток Купфера и гепатоцитов 40
1.7. Изменение печени при ожирении 42
1.8. Резюме 45
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Экспериментальные модели ожирения 46
2.2. Световая микроскопия 50
2.3. Электронная микроскопия 50
2.4. Оценка фагоцитарной активности клеток Купфера 51
2.5. Биохимические методы исследования 52
2.6. Статистические методы 52
Глава 3. Некоторые биохимические показатели крови, состояние гепатоцитов и клеток купфера при алиментарном ожирение у крыс
3.1. Биохимические показатели крови 53
3.2. Гепатоциты и клетки Купфера на светооптическом уровне 56
3.3. Ультраструктурные особенности гепатоцитов з
3.4. Ультраструктурные особенности клеток Купфера 62
3.5. Фагоцитарная активность клеток Купфера в норме и при алиментарном ожирении 64
Глава 4. Некоторые биохимические показатели крови, состояние гепатоцитов и клеток купфера при генетически обусловленном ожирении у мышей линии C57B1/6J
4.1. Биохимические показатели крови у черных и желтых мышей 71
4.2. Морфология гепатоцитов и клеток Купфера на светооптическом уровне у черных и желтых мышей 74
4.3. Сравнительная характеристика ультраструктуры гепатоцитов у черных и желтых мышей 77
4.4. Сравнительная характеристика ультраструктуры клеток Купфера у черных и желтых мышей 82
4.5. Фагоцитарная активность клеток Купфера у черных и желтых мышей 84
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 88
Выводы 105
Список литературы
- Экспериментальные модели ожирения
- Световая микроскопия
- Ультраструктурные особенности гепатоцитов
- Сравнительная характеристика ультраструктуры клеток Купфера у черных и желтых мышей
Экспериментальные модели ожирения
В ряде выполненных в последние годы исследований показано, что при смещении равновесия "поступление/потребление энергетических субстратов" в сторону преобладания "поступления" возможно увеличение количества жировых клеток во взрослом организме за счет превращений фибробластов в адипоциты (Репин А.С., 1990; Jonge, Bray, 1997). Результаты многочисленных исследований позволяют считать, что ключевым звеном в системе регуляции количества жировой ткани в организме являются сами адипоциты, которые могут выделять ряд биологически активных веществ, регулирующих аппетит (Rosenbaum et al., 1997). Кроме того, участие жировых клеток в контроле массы жировой ткани может зависеть от количества непосредственно вырабатываемого адипоцитами тепла (Алмазов В.А. с соавт., 1999).
Механизмы, определяющие количество клеток, тесно связаны с ли-пидным обменом. Экспериментально было показано, что ген ADD1/SREBPI контролирует не только превращение фибробластов в адипоциты, но также синтез жирных кислот и холестерина (Yokoyama et al., 1993). По-видимому, экспрессия этого гена в значительной степени определяет гиперхолестеринемию, нередко отмечаемую у людей с ожирением. С другой стороны, известно, что уровень холестерина, связанного с ЛПВП, в плазме у таких больных снижен (Arai et al., 1994).
Жировая ткань обладает эндо-, ауто- и паракринной функциями. Ее активность в значительной мере генетически обусловлена. Идентифицировано 5 генов, с наличием которых связано развитие спонтанного ожирения у мышей (Spiegelman, Flier, 1996). Часть из этих генов и продуктов их экспрессии идентифицированы и у человека. Более подробная информация в этой области получена в отношении ОВ-гена, локализованного у человека во второй хромосоме. Результатом экспрессии ОВ-гена в адипоцитах явля 14 ется синтез выделяемого в кровь специфического белка - лептина. В настоящее время исследования, посвященные механизмам регуляции экспрессии гена лептина, находятся на самом начальном этапе. Выявлен четкий параллелизм между количеством лептина в крови и содержанием жировой ткани в организме (Friedman, 1997). Было показано, что экспрессия гена определяется не только количеством жировой ткани в организме, но и содержанием триглицеридов в жировых клетках (Considine et al., 1996; Havel et al., 1996; Jenkins et al., 1997). Экспрессия гена лептина возрастает под влиянием инсулина, глюкокортикоидов, эстрогенов (Rosenbaum et al., 1997;Shimizuetal., 1997).
В экспериментальных исследованиях показано, что введение лептина грызунам сопровождается уменьшением аппетита, снижением массы тела при одновременном увеличении энергозатрат, уменьшении содержания инсулина и глюкозы в крови (Havel et al., 1996). Результаты ряда исследований позволили сформулировать представление о том, что лептин является основным белком, регулирующим аппетит через центральную нервную систему по принципу обратной связи (Considine et al., 1996). Однако эти связи утрачиваются при наличии ожирения, для которого характерно сохранение аппетита при высоких концентрациях лептина в крови (Mizuno et al., 1996). При ожирении это может быть обусловлено снижением чувствительности к лептину на уровне центральной нервной системы (Friedman, 1997).
На основании анализа результатов собственных исследований некоторые авторы приходят к выводу о двойной роли лептина в регуляции аппетита у человека (Karhunen et al., 1997). В состоянии равновесия энергетического баланса он не играет роли в возникновении чувства голода или насыщения и является индикатором количества жировой ткани в организме. В то же время при неустойчивом энергетическом балансе (голодание, увеличение приема пищи) лептин может активно влиять на чувство насыщения и тем самым обеспечивать поддержание постоянного количества жировой ткани в организме.
Жировые клетки выделяют наряду с лептином ряд других белков, выполняющих аутокринные и паракринные функции (York, 1996). К их числу относятся адипсин и туморонекротизирующий фактор-альфа (TNF-а). TNF-а синтезируется многими клетками организма, в том числе моноцитами и макрофагами. При наличии ожирения способность адипоцитов к его синтезу значительно увеличивается. Действие его направлено на уменьшение чувствительности к инсулину на уровне рецепторов, а также увеличение секреции лептина (Yang et al., 1997; Halle et al., 1998; Winkler et al., 1998; Dandona et al., 1999).
Адипсин обладает способностью стимулировать деление адипоцитов. При ожирении его содержание снижено, что может приводить к уменьшению пролиферации адипоцитов (Flier et. al., 1987).
В последние годы достаточно интенсивно изучается возможная роль [3-адренорецепторов в патогенезе ожирения. Это обусловлено способностью всех типов (3-адренорецепторов стимулировать липолиз. Особенностью жировых клеток является наличие в них (З -адренорецепторов (Ramsay, 1996). Мутация гена fb-адренорецептора приводит к увеличению триглицеридов, общего холестерина и холестерина ЛПНП и уменьшению холестерина ЛПВП в крови (Sakane et al., 1997; Garcia-Rubi et al., 1998). Однако отсутствие данной мутации не исключает возможного изменения активности адренорецепторов жировых клеток при висцеральном ожирении и их роли в возникновении характерной дислипидемии, в частности, гипертриглицеридемии с одновременным увеличением содержания в крови свободных жирных кислот, ЛПОНП и ЛПНП (Hoffstedt et al., 1997; Lonnqvist et al., 1997).
Световая микроскопия
Интересно отметить, что гепатоциты крыс контрольной группы тоже содержали небольшое количество мелких вакуолей. Их количество ощутимо увеличивалось при одноразовой жировой нагрузке (животный жир ad libitum за 12-15 часов до забоя). Наиболее активно вакуоли накапливались в периферических клетках. Однако при этом вакуоли оставались мелкими, распределялись по цитоплазме клеток равномерно, не смещая ядро.
Клетки Купфера на гистологических препаратах не всегда можно однозначно дифференцировать от эндотелиоцитов и клеток фибробласти-ческого ряда. Их отличительными особенностями является наличие в цитоплазме плотной зернистости и включений гемосидерина. Они обычно имеют крупное кругло-овальное базофильное ядро и светлую цитоплазму неправильных очертаний с легким метохроматическим оттенком. Никаких особенностей в строении клеток по сравнению с контролем на светоопти-ческом уровне обнаружено не было, но количество их при алиментарном ожирении оказалось значительно ниже (табл. 6).
Таблица 6 Морфометрических показателей клеток Купфера при алиментарном ожи рении у крыс, М±т, М (min-max) Показатели Контроль(6) Ожирение (7) Численная плотность, мм 2 43,4±1,30 35,5±1,91 Площадь сечения, мкм2 20,8±2,84 11,7±1,77 Относительный объем, % цитоплазма 61,6±3,05 61,5±4,13 лизосомы 22,9±2,64 11,7±1,% жировые включения 0,6(0-5) 3,5(0-25) Примечание: - достоверность различий с контролем при Р 0.05, в скобках - число животных, для каждого показателя проведено 20 измерений у каждого животного. 3.3. Ультраструктурные особенности гепатоцитов
У контрольных крыс гепатоциты представляли собой крупные полигональные клетки с центрально расположенным ядром. В ядрах, как правило, содержалось минимальное количество гетерохроматина и одно-два крупных рыхлых ядрышка. В цитоплазме располагались крупные комплексы шероховатой и гладкой эндоплазматическои сети, многочисленные мелкие митохондрии, лизосомы разного строения и скопления гранул гликогена (рис. 9). В некоторых гепатоцитах обнаруживались отдельные капли жира типичного строения с признаками расщепления липидов (рис. 10).
В образцах печени от животных с алиментарным ожирением ультраструктура гепатоцитов отличалась большим разнообразием по насыщенности органоидами и их состоянию. Гепатоциты центральной части долек практически не отличались от контрольных, более сильные изменения касались гепатоцитов периферической части долек. Несмотря на крупные размеры, подавляющее большинство этих клеток имели все признаки снижения функциональной активности и избыточного накопления жиров и углеводов. Четко проявлялись признаки снижения активности ядер: уменьшение их размеров, накопление неактивного хроматина (гетерохроматина), уплотнение ядрышек, уменьшение количества ядерных пор (табл. 5). Около ядра располагались небольшие скопления шероховатой и гладкой эндоплазматическои сети. В отличие от контрольных образцов печени, в расширенных цистернах которых обнаруживалось электронно-плотное содержимое, при ожирении в портальных гепатоцитах сеть выглядела запустевшей. Комплексы Гольджи в гепатоцитах у крыс с ожирением были мелкими, имели уплощенные цистерны и небольшое количество светлых пузырьков. Здесь же в околоядерной зоне находились немногочисленные митохондрии обычного строения. Они имели четкую наружную и внутреннюю мембрану, хорошую сохранность крист и умеренной электронной плотности матрикс. Их размеры не отличались от митохондрий гепатоцитов контрольной группы. Снижение относительных объемов структур, отвечающих за синтез и энергообеспечение, отражает и абсолютное уменьшение их объемов, поскольку не компенсируется увеличением размеров клеток. Пероксисомы встречались редко. Это были округлые образования, похожие на первичные лизосомы, но с умеренно электронноплотным содержимым и плотной сердцевиной. Часто они располагались вблизи митохондрий. Их размеры и структура не отличались от соответствующего контроля.
Большая часть цитоплазмы гепатоцитов была заполнена многочисленными, разными по размерам, округлыми или овальными каплями жира, относительный объем которых превышал контрольные величины в 100 раз. Их содержимое было однородным по структуре и электронной плотности (рис. 11). Жировые включения не имели признаков локального растворения, характерного для аналогичных структур контрольных животных. Как правило, вплотную к жировым включениям прилежали крупные скопления гликогена, объем которого был увеличен в 1,5 раза. Однако, структура гликогена в некоторых случаях была необычной: вместо гранул обнаруживалась пылевидная зернистость и мелкие волокнистые остатки. Суммарный объем липидных включений и гликогена в некоторых гепатоцитах достигал 50-80% объема цитоплазмы
Ультраструктурные особенности гепатоцитов
При общей умеренной степени повреждения клеток периферические отделы долек страдали больше, чем их центральные зоны. При более тяжелых степенях поражения под капсулой печени встречались отдельные группы гепатоцитов с морфологическими признаками необратимых повреждений: пикноз или отсутствие ядер, полное просветление цитоплазмы, разрывы клеточных оболочек (рис. 21). Клетки Купфера у черных мышей встречались нечасто. Они - мелкие, располагаются преимущественно в местах впадения синусоидных капилляров в центральные вены. Очертания их неправильные, цитоплазма оксифильная с плотными включениями, ядра крупные, кругло-овальные.
Клетки Купфера у желтых мышей по морфологии не отличались от таковых контрольной группы, но встречались значительно реже (табл. 11). Они располагались преимущественно вокруг устьев синусоидных капилляров, иногда образуя крупные скопления вокруг центральных вен (рис. 22).
Качественные и количественные характеристики гепатоцитов у черных мышей соответствовали классическим представлениям о внутриклеточной организации печеночных клеток у мышей (Шкурупий В.А., 1989). Признаков острых или хронических, диффузных или локальных изменений в них найдено не было, поэтому мы принимаем их структуру за условный контроль для желтых особей.
Скопление макрофагов вблизи центральной вены, стеатоз и стеа-тонекроз гепатоцитов у желтой мыши. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. 750. Ультраструктура гепатоцитов у черных и желтых мышей имела существенные различия. Размеры клеток у желтых мышей были достоверно больше, хотя диаметры ядер не различались. У желтых мышей наблюдалось большое разнообразие гепатоцитов по степени изменения их ультраструктуры. Некоторые клетки сохраняли общую архитектонику, но в цитоплазме имелись многочисленные мелкие капли жира (рис. 23). В других гепатоцитах жировые включения имели тенденцию к слиянию и образованию крупных капель без признаков растворения содержимого (рис. 24). Жир обнаруживался также во вторичных лизосомах. Общее содержание его достигало 60% площади среза клетки и придавало им вид "жирового склада".
Ультраструктура гепатоцитов характеризовалась большим разнообразием. В некоторых гепатоцитах эндоплазматическая сеть, гладкая и шероховатая, отдельными мелкими комплексами располагалась между многочисленными включениями вместе с редкими митохондриями. Другие клетки выглядели электронно-светлыми, "запустевшими" как за счет жировых включений, так и, особенно, за счет участков цитоплазмы, заполненных пылевидной зернистостью. При более глубоком анализе удалось сделать вывод, что зернистость и тонкофибриллярные структуры представляют определенную (остаточную) форму гликогена. При этом типичные гранулы гликогена в некоторых клетках отсутствовали (рис. 25). Митохондрии имели обычное нормальное ультраструктурное строение: ровный контур, четкие мембраны и умеренной плотности матрикс. Относительный объем митохондрий у мышей с ожирением уменьшался почти в 2 раза. Комплексы Гольджи встречались часто, имели удлиненные, местами расширенные цистерны и рядом расположенные пузырьки. Изменений со стороны пероксисом не найдено. Отдельные клетки имели признаки атрофии органоидов белкового синтеза, сохраняя лишь митохондрии, мелкие лизосомы и остатки гликогена (рис. 26).
Гепатоцит с выраженной атрофией органоидов у желтой мыши. У в. 12500. Морфологические особенности строения ядер у обеих разновидностей мышей свидетельствовали об их активном функционировании: высокое содержание активного хроматина, крупные и рыхлые ядрышки, большое количество ядерных пор (табл. 10). Однако, у жирных мышей в кариоплазме, как правило, располагались жировые включения (рис. 27). Количество капель жира варьировало в разных ядрах от 1 до 4. Морфология этих капель не отличалась от таковой в цитоплазме клеток. Иногда они сливались в одну большую каплю, занимающую до 25% площади среза ядра. В ядрах гепатоцитов у черных мышей жировые включения встречались исключительно редко и в очень малых количествах.
Таким образом, гепатоциты у желтых мышей имели все признаки активно функционирующих клеток, но функции их извращены. В них синтезируется и накапливается огромное количество нейтрального жира за счет угнетения синтеза и накопления углеводов. При одинаковом пищевом рационе у черных мышей углеводный и жировой обмены в печени, по-видимому, сбалансированы, а у желтых мышей преобладает синтез липи-дов из экзогенных углеводов.
Качественные и количественные характеристики макрофагов печени выявили их существенные различия у черных и желтых мышей. У последних их количество было достоверно меньше, а размеры несущественно крупнее. Кроме того, они бедны отростками и вакуолями по сравнению с таковыми у черных мышей. В цитоплазме было очень мало лизосомальных структур, но содержалось много шероховатой сети и гликогена. В отличие от черных мышей, у желтых в цитоплазме макрофагов часто обнаруживались жировые включения в виде капель средних размеров типичного строения. Они располагались как лизосомах, так и свободно в цитоплазме (рис. 28, табл. 11).
Сравнительная характеристика ультраструктуры клеток Купфера у черных и желтых мышей
Кроме чисто количественных различий между двумя формами ожирения, выявлены и качественные различия функционирования макрофагов. У желтых мышей через час после введения коллоидного золота треть захваченных частиц располагаются свободно в цитоплазме без отграничивающих мембран. Возможно, что это связано с недостаточностью лизосо-мального аппарата в этих клетках. Имеются сведения, что при ожирении страдают и другие резидентные клетки системы мононуклеарных фагоцитов (альвеолярные или перитонеальные). Показано, что при избытке триг-лицеридов в крови многие элементы системы мононуклеарных фагоцитов приобретают морфологические черты молодых адипоцитов (Правоторов Г.В., Новиков В.Д., 1996; Шкурупий В.А. с соавт., 1999). Возможно, эти изменения подтверждают системный уровень повреждения при ожирении.
Таким образом, морфо-функциональное исследование гепатоцитов и макрофагов показало, что ожирение сопровождается выраженными изменениями со стороны и паренхиматозных и макрофагальных клеток. По существу изменения одноименных клеток печени при любом ожирении од-нонаправлены, но разные по этиологии формы накладывают свой отпечаток на состояние этих клеток. Если абстрагироваться от качественных различий, то можно заметить, что изменения одноименных количественных показателей при генетическом ожирении, как правило, в несколько раз больше, чем при алиментарном.
Анализ полученных биохимических, морфологических и функциональных данных выявил определенный параллелизм в характере и степени изменений гепатоцитов и клеток Купфера при ожирении. Показано, что при разных формах ожирения макрофаги захватывают и накапливают в цитоплазме излишки липидов, при этом их функциональная активность снижается. Более легкой форме стеатоза в гепатоцитах (алиментарное ожирение у крыс) соответствует умеренное снижение показателей активности макрофагальной системы. Более тяжелое повреждение гепатоцитов (генетически обусловленное ожирение у мышей) сопровождается значительным угнетением клеток Купфера. Снижаются не только их количество, площадь поверхности и объем лизосомального аппарата, но качество взаимодействия мембран с лигандом - частицами коллоидного золота. Все это приводит к снижению захвата, медленному поглощению и нетипичному распределению частиц в макрофагах.
Эти данные находят косвенное подтверждение в работах Л.Е. Панина с соавт. (1994, 1998, 1999), в которых постулируется роль макрофагов в регуляции биосинтеза белка в гепатоцитах. Авторы показали, что в норме ЛПВП захватываются клетками Купфера, образуют в них активные комплексы с глюкокортикоидами, которые поступают в гепатоциты, активируют геном и синтез белка (Усынин И.Ф. с соавт., 1995). Ими показано, что активация системы мононуклеарных фагоцитов у крыс in vivo сопровождается усилением биосинтеза белка во многих органах и тканях, в том числе и в печени (Панин Л.Е. с соавт., 1994). Блокада клеток Купфера хлористым гадолинием снижает скорость поглощения ЛП и биосинтез белка в гепатоцитах (Усынин И.Ф., Харьковский А.В., 1998). У крыс в модели алиментарного ожирения снижается относительное содержание плазменных ЛПВП, понижается активность клеток Купфера, уменьшается объем активного хроматина в ядрах и синтетических структур в цитоплазме гепа-тоцитов и снижается синтез белков. В условиях избыточного поступления в гепатоциты липидов и пониженном уровне синтеза белков создается относительная недостаточность липолитических ферментов, а также снижается выведение продуктов метаболизма из клеток, что приводит к накоплению их в цитоплазме, а в дальнейшем к стеатозу. Относительную ферментную недостаточность в гепатоцитах А.А. Покровский (1978) рассматривал как одну из причин стойкого накопления нейтральных жиров в печени. В этих условиях нарушается и синтез белков "на экспорт", в частности альбуминов. Гипоальбуминемия вообще служит показателем функциональной недостаточности печени (Подымова С.Д., 1994).
Качественно иная картина сопровождает генетически обусловленное ожирение у мышей: на фоне выраженной гиперлипидемии и повышения концентрации ЛПНП развивается резкое угнетение клеток Купфера, нарушение липидного и углеводного обменов в гепатоцитах при сохранении в последних уровня синтеза белков. В данном случае мы имеем дело с нарушением, которое развивалось параллельно с развитием организма. Взрослые животные уже имеют глубокие необратимые метаболические повреждения, в том числе поврежденную печень. Это могло отразиться на функциональной связи макрофагов и активацией биосинтеза белка в гепатоцитах. Возможно это связано с влиянием белка Агути на геном гепато-цитов. Уже установлено, что белок Агути влияет на углеводно-жировой обмен и гипоталямо-гипофизарно-надпочечниковую систему (ГГНС), гормоны которой принимают непосредственное участие в регуляции обменых реакций. На диких грызунах показано, что носители рецессивного мутантного аллеля в гомозиготном состоянии отличаются от носителей аллеля дикого типа по некоторым параметрам функционирования ГГНС и по уровню нейромедиаторов в центральной нервной системе. Так, водяные полевки (Arrvicola terrestris) разных агути генотипов различаются по уровню кортикостерона в крови в покое (Бажан Н.М., Иванова Л.Н., 1989) и по реакции ГГНС на стресс (Герлинская Л.А., 1987; Бажан Н.М., Иванова Л.М., 1989). На водяных полевках (Arrvicola terrestris) и оленьих хомячках (Peromyscus maniculatus) было показано плейотропное влияние мутации неагути в гомозиготе на содержание катехоламинов в мозге (Hayssen et al., 1994), агрессивное поведение (Hayssen, 1997) и чувствительность репродуктивной функции к стрессорному воздействию (Hayssen, 1998; Bazhan et al., 1999).
Полученные данные позволяют заключить, что существует тесная функциональная связь паренхимы печени и ее макрофагальной системы. Создается впечатление, что именно макрофаги первыми принимают на себя жировую перегрузку и определяют в дальнейшем развитие стеатоза печени. В работах И.Ф. Усынина с соавт.(1995), Л.Е. Панина с соавт. (1998) показано, что, при перфузии изолированной печени разными классами липопротеинов клетки печеночного синусоида поглощают все классы липопротеинов. Однако при перфузии печени даже в течение 60 минут меченые липопротеины обнаруживаются в большом количестве только в макрофагах и не найдено метки в гепатоцитах. Проведенные нами опыты с введением в портальную вену меченных коллоидным золотом липопротеинов показывают, что макрофаги в огромном количестве захватывают липопротеины очень низкой и низкой плотности. При этом через 1 час после введения также не найдено метки в гепатоцитах (Панин Л.Е. с соавт., 2000). Эти данные свидетельствуют о том, что именно макрофаги первыми взаимодействуют с липопротеинами и при избыточном их количестве первыми изменяются. Не исключено, что макрофаги регулируют жировой обмен в гепатоцитах. Для подтверждения этого необходимы дальнейшие исследования механизмов взаимосвязи гепатоцитов и клеток Купфера. Полученные данные необходимо учитывать при попытках коррекции метаболических нарушений, связанных с ожирением, с учетом различий в их этиологии.
