Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы стр. 15-37
1.1. Клинические особенности гипертрофической кардиомиопатии стр. 15-22
1.2. Генетические аспекты гипертрофической кардиомиопатии стр. 22-37
Глава 2. Материалы и методы стр. 37-51
2.1. Характеристика обследованных больных стр. 37-38
2 1.1 Методы и методики стр. 38-43
2.2. Молекулярно-биологические методы
2.3.1. Исследование гена тяжелой цепи сердечного бета-миозина стр. 43-48
2.3.2. Иследование полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента стр. 48-49
2.3.3. Исследование полиморфизма гена рецепторов 1-го типа к ангиотензину II стр. 49-50
2.4 Методика обработки полученных данных стр. 50-51
Глава 3. Результаты проведенных исследований
3.1. Оценка динамики развития клинических проявлений стр. 51-54
3.2 Эхокардиографические показатели сердца стр. 54-56
3.3 Диастолические нарушения миокарда ЛЖ и уровень градиента выходного отдела левого желудочка у больных с ГКМП стр. 56-60
3.4 Течение заболевания, летальность стр. 60-62
3.5 Результаты исследования полиморфизмов гена ангиотензин-превращающего фермента и гена рецепторов 1-го типа к ангиотензину II стр. 62-66
3.6 Исследование гена тяжелой цепи бета-миозина стр. 66-70
3.7 Результаты клинико-генетических сопоставлений стр. 71-75
3.8 Клинические наблюдения стр. 76-87
Глава 4. Заключение стр. 88-97
Выводы стр. 98-99
Практические рекомендации стр. 99
Список литературы стр. 100-114
- Клинические особенности гипертрофической кардиомиопатии
- Исследование гена тяжелой цепи сердечного бета-миозина
- Оценка динамики развития клинических проявлений
Введение к работе
Проблема первичных, или идиопатических поражений миокарда является относительно новой. Исследования, посвященные кардиомиопатиям, стали регулярно публиковаться с конца 50-х годов после статей W.Bridgen и J.Goodwin (10, 45, 47, 49). Однако описания первых случаев гипертрофической обструктивной кардиомиопатии появились ещё во второй половине прошлого века. В 1907 году Schmincke одним из первых описал 2 случая значительной гипертрофии миокарда левого желудочка у женщин без сопутствующей патологии, приводящей к гипертрофии миокарда.
После публикаций W. Bridgen в 1957 году заболевание стало трактоваться, как идиопатический гипертрофический субаортальный стеноз.
Гипертрофическая кардиомиопатия, относится к разряду редких болезней (16, 33, 38, 45, 47). Частота этой патологии по литературным данным составляет 1:500 или 0,2% (4, 58, 103, 110), что выше по сравнению с представленными ранее статистическими данными (33, 45, 47, 52). Это можно объяснить улучшением возможностей диагностики этого заболевания связанным с внедрением двухмерной ЭХОКГ с допплеровским исследованием и трехмерной ЭХОКГ, ядерно-магнитного резонанса, а также методик интервенционной кардиологии — вентрикулографии, коронарографии (1, 2, 4, 8, 12, 29, 34, 35, 39, 42, 49, 54, 65, 71, 95, 105-108, 113,115, 116, 119,121,123, 127, 135, 137, 142, 148, 149).
Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) характеризуется гипертрофией левого и/или правого желудочков, в большинстве случаев затрагивающей межжелудочковую перегородку. При ГКМП поражаются лица преимущественно молодого возраста, высок риск внезапной смерти, заболевание имеет отличные от других особенности внутрисердечной гемодинамики с нарушением, прежде всего, диастолической функции левого желудочка. Для ГКМП характерно формирование в ряде случаев градиента
5 давления ВОЛЖ, что во многом обусловливает формирование клинического симптомокомплекса при данной патологии. Специфичным для ГКМП является усиление контрактильности и учащение сердечного ритма с укорочением периода диастолического наполнения, что усугубляет обструкцию выводного отдела, усиливает митральную регургитацию, повышает потребность миокарда в кислороде и ухудшает диастолическую функцию (3, 13,15, 53, 135, 152).
Годовая летальность, по данным крупных центров составляет 3-5%, при этом внезапная смерть, вследствие нарушений ритма составляет 10% случаев (90, 99). Прогноз ГКМП, в большинстве случаев благоприятный, 5-летняя выживаемость составляет 82-98%, 10-летняя - 64-89% (O.Azzano et al, 1995; C.Cannan et al, 1995), однако прогноз благоприятен при апикальной форме заболевания, длительном бессимптомном течении, при неотягощенном семейном анамнезе (14).
За последние два десятилетия в литературе накопилось значительное количество работ, посвященных диагностике, клинике и лечению гипертрофичекой кардиомиопатии (4, 9, 10, 16, 33, 45-47, 62-64, 74, 78, 84, 86, 87, 90), вопросам генетики и морфологии этого заболевания (27, 31, 45, 47, 58,67,88,89,96,98, ПО, 114,123, 134, 136, 140, 146, 151).
На сегодняшний день доказано, что ГКМП - генетическое заболевание, обусловленное мутациями в генах, кодирующих белки, входящие в состав саркомеров кардиомиоцитов (24). Известны 10 генов, мутации в которых вызывают ГКМП. (таблица 1). К ним относятся тяжелая цепь бета-миозина, тропонины I и Т, эссенциальная и регуляторная легкие цепи бета-миозина, альфа-тропомиозин и миозин-связывающий белок С. Идентифицировано уже около 200 мутаций в этих генах (24; Seidman С.Е., 1998; Maron B.J. 2002).
ГКМП более чем в 60 % случаев является наследственной - «семейная ГКМП» (99) и имеет аутосомно-доминантный тип наследования, а вызвавшая его мутация передаётся из поколения в поколение. Остальная часть представлена спорадическими формами ГКМП (11), также имеющими генетическую природу, но обусловленные мутациями, возникающими de novo в половых клетках родителей.
В настоящее время мало работ, посвященных сравнительной характеристике семейных и спорадических форм ГКМП, включая клинические данные и данные генетических методов исследования.
Хотя за рубежом накоплена большая информация о генетических причинах развития ГКМП (Jaaskelainen P. et.al., 1998; Moolman-Smook J.C. et.al., 1999; Vosberg H.P., 1998; Domal-Kwiatkovwska D. et.al., 2000; Goncalves L.M. et.al., 2000; Ywang D.S. et.al., 1996), в нашей стране такие исследования лишь начинают развиваться и генетическая структура ГКМП у российского населения охарактеризована крайне мало.
Поскольку ГКМП относится к наследственным заболеваниям с генетической гетерогенностью (т.е. вызванным дефектами в различных генах), как и все подобные заболевания, она имеет популяционную специфику распределения генетических аномалий. Спектр различных мутаций, отвечающих за развитие болезни, отличается в каждой популяции, причем число специфических для популяции мутаций ограничено и составляет лишь часть от всех обнаруженных в мире мутаций данного гена (Fung D.C. et.al., 1999). Это определяет актуальность изучения спектра мутаций в каждой популяции и ограничивает использование диагностических наборов, созданных на основании исследования мутаций в других популяциях.
Помимо поиска мутаций, характерных для данной популяции, вожным в диагностике ГКМП и определении прогноза заболевания является исследование полиморфизма генов-модификаторов. Известно, что повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний может быть связан с полиморфизмом некоторых генов, представляющим собой генетическую изменчивость локуса в определенной популяции. Установлено, что такими генами-модификторами, влияющими на развитие гипертрофии миокарда левого желудочка при артериальной гипертонии различного генеза, являются
7 все гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), прежде всего ген ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). DD генотип этого гена связан с высокой активностью АПФ в плазме крови (72). Многочисленные исследования показали, что DD генотип связан с риском развития гипертрофии миокарда, инфаркта миокарда (56), спазма коронарных сосудов (117). Напротив, II генотип связан с повышенной выносливостью при физических нагрузках, при этом генотипе уровень АПФ в сыворотке примерно в два раза меньше, чем при DD генотипе (150). Сообщалось о том, что DD генотип при ГКМП связан с высокой частотой внезапной смерти (Marian A.J.,et.al.l993). Другим геном РААС, влияющим на развитие гипертрофии миокарда ЛЖ является ген рецепторов 1 типа к ангиотензину II. Полиморфизм гена рецепторов 1 типа к ангиотензину II (AGTR1) характеризуется тремя генотипами АА, АС и СС. Ряд авторов указывают на достоверное увеличение частоты аллеля С у больных гипертонической болезнью по сравнению со здоровыми лицами (Fan Н. et al., 1998; Wang W.Y. et al., 1997), однако другие авторы не находят подтверждение этому (Нефедова Ю.Б. с соавт., 1999; Benetos A. et al., 1997). При исследовании московской популяции была показана связь генотипа СС с развитием артериальной гипертензии и гипертрофии миокарда ЛЖ (Носиков В.В. с соавт., 1999; Чистяков Д.А., Кобалава Ж.Д., 2000). Найдена достоверная корреляция между СС генотипом этого гена и массой миокарда ЛЖ, а также толщиной МЖП у больных с ГКМП (Osterop А.Р. et al., 1998). Однако в японской популяции у больных с ГКМП таких закономерностей не наблюдалось (88). Следует отметить, что при одновременном носительстве DD генотипа гена АПФ и СС генотипа гена AGTR1 отмечались максимальные значения КСР и КДР ЛЖ, а также достоверное увеличение толщины задней стенки ЛЖ, ММЛЖ и индекса ММЛЖ при обследовании молодых мужчин (17-36 лет) с артериальной гипертензией 1-ой степени (5).
Не изучено, как сочетание полиморфизмов генов АПФ и AGTR1 с различными мутациями в генах белков сердечных саркомеров может влиять на течение и прогноз ГКМП.
Разработанные и внедренные в практику в последние годы молекулярные методы диагностики, основанные на анализе последовательности ДНК (ДНК-диагностика), открывают новые возможности изучения наследственных заболеваний, так как позволяют точно установить генетический дефект у больных и их родственников, провести пренатальную диагностику на самых ранних стадиях развития плода, что дает возможность решать вопрос о прерывании беременности, в случаях когда плод унаследовал мутантный аллель (В.Н.Горбунова, В.С.Баранов, 1997). ДНК-диагностика позволяет поставить диагноз еще до появления клинической симптоматики у больного (досимптоматическая диагностика), выработать рациональную тактику лечения и начать его (упреждающая терапия), что является важным фактором профилактики наследственных заболеваний. Преимуществом молекулярной диагностики является ее универсальность, возможность использования любых ДНК - содержащих клеток и тканей - венозная или капиллярная кровь, соскоб со слизистой оболочки щеки и др. (11,98, 125).
Все молекулярные методы обнаружения мутаций разделяются на две большие группы согласно целям их проведения: детекция известных мутаций и скрининг, т.е. поиск всех, с том числе неизвестных, мутаций. Первый подход в настоящее время неприемлим для российской популяции, т.к. неизвестны встречающиеся в популяции мутации.
Скорейшее введение в клиническую практику методов генетического анализа, позволяющих своевременно диагностировать наследственные заболевания является важной задачей современной медицины. Однако, для проведения полной и объективной диагностики ГКМП необходимо идентифицировать изменения во всех генах, мутации в которых могут вызвать это заболевание. Для этого необходимо решить следующие вопросы (Priori S.G. et.al., 1999): создать базу данных генетических дефектов,
9 участвующих в развитии ГКМП, позволяющую определить степень риска, связанную с генотипом; обеспечить доступность методов ДНК-диагностики в клинической практике; дать оценку эффективности использования данных методов в клинике.
Первоочередным сегодня представляется формирование базы данных генетических дефектов (мутаций, полиморфизмов), являющихся причиной развития ГКМП в российской популяции. Анализ накопленной информации о типах мутаций и полиморфизмов, встречающихся в России, позволит создать высокопроизводительные, простые и применимые в клинической практике, недорогие методы скрининга мутаций и повысить эффективность диагностики ГКМП.
Развитие и внедрение в клинику методов генодиагностики наследственных заболеваний является необходимой предпосылкой для создания новых подходов к их лечению. Наряду с симптоматическим и патогенетическим лечением станет реальным применение этиотропного лечения, а именно, генотерапии, т.е. коррекции не следствий, а причин данных состояний.
Несмотря на наличие большого объема информации о гипертрофической кардиомиопатии, в литературе отсутствуют данные о многостороннем длительном динамическом наблюдении больных с семейным вариантом ГКМП. Нет сравнительной характеристики течения спорадических и семейных форм заболевания, характеристики динамики развития симптомов заболевания, их взаимоотношения между собой. Мало работ, посвященных анализу связи клинико-функциональных особенностей данного заболевания с генетическими изменениями, особенно в российской популяции, практически не охарактеризован спектр специфических для российской популяции мутаций, что представляет большой интерес и обусловливает целесообразность и необходимость дальнейших комплексных исследований этого заболевания.
10 Цель исследования: Оптимизация диагностического поиска гипертрофической кардиомиопатии путем клинико-генетических параллелей у больных с семейными и спорадическими формами заболевания.
Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:
Провести сравнительный анализ клинических проявлений заболевания и динамики их развития при семейных и спорадических формах ГКМП.
Оценить тяжесть течения заболевания, летальность и ее структуру при семейных и спорадических формах ГКМП.
Сопоставить эхокардиографические параметры (толщину и массу миокарда левого желудочка, степень гипертрофии миокарда ЛЖ, морфометрический тип и тип гипертрофии) у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП и оценить вклад градиента давления ВОЛЖ и диастолической дисфункции миокарда левого желудочка в тяжесть течения заболевания.
Проанализировать распределение генотипов гена АПФ и гена рецепторов 1 типа к ангиотензину II (AGTR1) у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП и выявить их связь с выраженностью степени гипертрофии миокарда ЛЖ и тяжестью течения заболевания.
Осуществить поиск мутаций в гене тяжелой цепи сердечного бета-миозина у больных ГКМП и охарактеризовать фенотипические проявления найденных мутаций.
Научная новизна:
1. Впервые проведено комплексное сравнительное клинико-инструментальное и генетическое исследование у больных с семейными и спорадическими формами гипертрофической кардиомиопатии.
Проведён сравнительный анализ анамнестических и эхокардиографических данных у больных с семейными и спорадическими формами гипертрофической кардиомиопатии и выявлено более раннее проявление клинических симптомов, более тяжелое течение заболевания и достоверно более высокая летальность у больных с семейными формами гипертрофической кардиомиопатии.
Проведено сопоставление генотипов гена АПФ и гена рецепторов 1 типа к ангиотензину II (AGTR1) у больных с семейными и спорадическими формами гипертрофической кардиомиопатии.
Проанализирована выраженность гипертрофии миокарда левого желудочка и характер течения заболевания при разных генотипах генов АПФ и AGTR1 у больных с семейными и спорадическими формами гипертрофической кардиомиопатии.
Показана разнотипность фенотипического проявления некоторых мутаций в структуре гена тяжелой цепи сердечного бета-миозина у больных ГКМП в российской популяции.
Выявлено три новые, ранее не описанные мутации в гене тяжелой цепи сердечного бета-миозина в российской популяции, охарактеризованы фенотипические проявления этих мутаций.
Показано, что семейный характер ГКМП и тип мутации могут иметь прогностическое значение, что свидетельствует о необходимости проведения не только клинико-эхокардиографических, но и генетических методов исследования.
Практическая значимость работы:
1. Полученные данные о манифестации и динамике развития основных клинических проявлений при семейных и спорадических формах ГКМП демонстрируют важность тщательного сбора анамнеза у больных ГКМП с целью выявления семейных форм заболевания.
Показатели внутрисердечной гемодинамики (ММЛЖ, ПЖО, ИОМ, градиент давления ВОЛЖ, Тмжп, Тзс), влияющие на формирование клинической картины при гипертрофической кардиомиопатии, различаются при семейных и спорадических формах заболевания. Эти показатели позволяют рекомендовать оценку состояния диастолической функции, градиента давления ВОЛЖ в покое, при подборе медикаментозной терапии и контроле ее эффективности у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП.
Новые мутации в гене тяжелой цепи сердечного бета-миозина, выявленные в работе, рекомендуется включить в реестр мутаций для генной диагностики ГКМП в российской популяции.
По результатам выполненной работы обоснована необходимость длительного, активного наблюдения за пациентами с ГКМП (включая латентные варианты течения) с созданием банка данных о них, включая банк ДНК, и важность проведения ДНК диагностики данного заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
Динамика развития основных клинических проявлений заболевания у больных семейными и спорадическими формами ГКМП.
Тяжесть течения заболевания, летальность и структура летальности у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП.
Значимость эхокардиографических параметров сердца (толщины и массы миокарда левого желудочка, степени гипертрофии миокарда ЛЖ, морфометрического типа и типа гипертрофии) у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП.
Корреляция тяжести течения заболевания со степенью диастолических нарушений и уровнем градиента ВОЛЖ у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП.
Полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента и гена рецепторов 1 типа к ангиотензину II у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП, зависимость степени гипертрофии миокарда ЛЖ и тяжести течения заболевания в зависимости от генотипов гена АПФ и гена рецепторов 1 типа к ангиотензину II.
Мутации в гене тяжелой цепи сердечного бета-миозина и их фенотипические проявления у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП в российской популяции.
Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии №1 лечебного факультета на базе клиники Госпитальной терапии им. А.А.Остроумова Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова и в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ и СРРФ.
Материалы работы доложены (устные доклады) на VI и VII ежегодных научных сессиях НЦССХ им. А.Н.Бакулева, на VIII и IX Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов НЦССХ им. А.Н.Бакулева, II и III Международных конференциях «Лечение гипертрофических кардиомиопатий» НЦССХ им. А.Н.Бакулева, на Конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ Санкт-Петербург, 2003 г. Тезисы всех выступлений опубликованы в печати.
По материалам проводимой работы опубликованы три статьи в Сборниках научных трудов кафедры госпитальной терапии №1 лечебного факультета и клиники Госпитальной терапии им. А.А.Остроумова ММА им. И.М.Сеченова «Актуальные вопросы внутренней медицины и педагогики» за 2000, 2002 и 2003гг. Также по материалам работы опубликованы статьи в журналах «Сердечная недостаточность», №6, 2003г и «Врач», №12, 2003г.
Представляемая работа, согласно основным требованиям, оформлена в печатном варианте на 114 страницах, иллюстрирована 13 таблицами, 8
14 рисунками и 4 диаграммами и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, включая собственные клинические наблюдения, заключение, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 154 источника.
Апробация диссертации проведена 23.09.2003 г. на совместном заседании кафедры госпитальной терапии №1 лечебного факультета, курса клинической фармакологии и фармакотерапии факультета послевузовского профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и лаборатории Молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ и СР РФ.
Благодарности.
Хотелось бы выразить искреннюю благодарность всем, кто принял участие в реализации этой работы и выразить особую признательность людям, без которых проведение этого исследования было бы невозможным:
Научному руководителю академику РАМН, профессору, зав. кафедрой госпитальной терапии лечебного факультета, директору Клиники госпитальной терапии им. А.А.Остроумова ММА им. И.М.Сеченова Любови Ильиничне Ольбинской за предоставленную возможность реализовать эту работу.
Научному руководителю, ведущему научному сотруднику Лаборатории молекулярной эндокринологии РКНПК МЗ и СР РФ, доктору медицинских наук Елене Викторовне Парфёновой за предоставленную возможность реализовать экспериментальную часть работы, неизменную готовность помочь и поделиться научными знаниями и опытом, моральную поддержку и доброту.
Кандидату медицинских наук Вере Юрьевне Каплуновой за неоценимую помощь в создании этой работы, моральную поддержку, доброту, дружбу, мудрость и терпение.
Кандидату медицинских наук, ведущему научному сотруднику лаборатории молекулярной кардиологии ИЭК РКНПК МЗ и СР РФ, кандидату биологических наук Дмитрию Викторовичу Стамбольскому за огромную помощь в осуществлении молекулярно-биологического исследования и мудрые советы.
Лаборанту-исследователю, студентке ФФМ МГУ им. М.В.Ломоносова Родиной Марии Юрьевне за осуществление молекулярно-биологического исследования, чувство юмора и искреннюю дружбу.
Профессору, доктору медицинских наук Морозовой Татьяне Евгеньевне за рецензирование моей работы.
Кандидату медицинских наук, ведущему научному сотруднику Постнову Антону Ювенальевичу за рецензирование работы и помощь в осуществлении экспериментальной части работы.
Отдельное СПАСИБО директору НЦССХ им. А.Н Бакулева академику РАМН, профессору, доктору медицинских наук Лео Антоновичу Бокерия за предоставленную возможность работать в институте, моральную поддержку.
Клинические особенности гипертрофической кардиомиопатии
Начало изучения кардиомиопатии можно отнести к 1891г., когда L. КгеЫ предложил обозначать заболевания сердечной мышцы, сопровождающиеся недостаточностью кровообращения и не связанные с предшествующей инфекцией, сепсисом и каким - либо системным процессом «идиопатическими». В 1902г немецкий патолог A.Shminke описал заболевание в статье «О левостороннем мышечном стенозе конуса». В 1958г R.Teare применил термин «асимметричная гипертрофия сердца» (24). Термин "кардиомиопатия" был предложен W.Bridgen в 1957 году, согласно его
Экспертами ВОЗ к кардиомиопатиям были отнесены заболевания неизвестной или неясной этиологии, возникающие чаще в молодом возрасте, проявляющиеся прогрессирующей застойной сердечной недостаточностью, кардиомегалией, аритмическим и тромбоэмболическим синдромом (16), а по классификации Ассоциации американских кардиологов 1995г понятие "кардиомиопатии" обозначает группу заболеваний миокарда неизвестной или неясной этиологии сопровождающихся его дисфункцией (128). В нашей стране еще в середине 30-х годов проблема некоронарогенных и неревматических поражений миокарда разрабатывалась Г.Ф.Лангом, который предложил термин "дистрофия миокарда", имея ввиду поражения эндокринной, токсической, анемической и другой этиологии, а затем внимание врачей к проблеме кардиомиопатии привлек М.И.Теодори (45).
В 1972 Goodwin предложил классификацию, выделяющую три классические формы кардиомиопатии: дилатационную, рестриктивную и гипертрофическую. Современная классификация включает также аритмогенную правожелудочковую дисплазию/кардиомиопатию, специфические и неклассифицируемые кардиомиопатии. Термин «специфические кардиомиопатии» используется для описания заболеваний мышцы сердца, которые ассоциируются со специфическими сердечными или системными заболеваниями. Ранее они определялись как специфические заболевания сердечной мышцы. К ним относятся ишемическая, вальвулярная, гипертензивная, воспалительная, метаболическая, токсическая, миопатическая, аллергическая, послеродовая и некоторые другие кардиомиопатии. К неклассифицируемым кардиомиопатиям относят такие редкие состояния, как фиброэластоз, систолическая дисфункция с минимальной дилатацией и митохондриальная патология. Итак, в настоящее время кардиомиопатии классифицируются в основном по патофизиологическим аспектам или, если это возможно, по этиологическим и патогенетическим факторам (11). Однако данный подход к классификации кардиомиопатии вызывает споры.
Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) характеризуется симметричной или асимметричной гипертрофией миокарда левого и/или правого желудочка с вовлечением межжелудочковой перегородки при отсутствии других причин, способных ее вызвать (артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, пороки, специфические заболевания сердца) (44, 128, 141). Кроме морфологических признаков имеется и характерный гистологический - нарушение нормальной пространственной ориентации кардиомиоцитов, которые в норме расположены параллельно друг другу. Кардиомиоциты утрачивают параллельную ориентацию и располагаются хаотично, образуя «завитки» (dissaray). Ядра кардиомиоцитов уродливой формы, часто окружены светлой зоной, так называемый перинуклеарный нимб (гало), присутствует фиброзная ткань (40, 93).
Первые патологоанатомические описания данного заболевания относятся к началу прошлого столетия (Schmincke, 1907г.), а первые подробные клинические описания болезни сделаны R. Brok и другими авторами в 50-х годах (Teare D, 1958; Morrow А.С., Braunwald Е., 1959).
Исследование гена тяжелой цепи сердечного бета-миозина
Скрининг больных на наличие генетических дефектов в 3-23 экзонах гена тяжелой цепи р-миозина (Р-МНС) включал следующие этапы:
1. Забор венозной крови у исследуемых больных;
2. Выделение геномной ДНК из крови;
3. ПЦР-амплификация 3-23 экзонов гена Р-МНС с праймерами;
4. Анализ полиморфизма конформаций одноцепочечной ДНК (Single Strand Conformation polymorphizm - SSCP);
5. Секвенирование ДНК при подозрении на наличие генетического дефекта в структуре гена.
Забор крови. Кровь брали из вены в объёме 3-5 мл осуществляли по стандартной методике. Кровь помещали в пробирки с предварительно добавленным ЭДТА в качестве антикоагулянта (1 объем раствора 0,1 М Na2-ЭДТА, рН 8,0 (20С) +10 объемов крови). Кровь хранили при -20 С .
Выделение геномной ДНК. В 1,5 мл-пробирку (Eppendorf) добавляли 700 мкл размороженной крови и 700 мкл ТЕ-буфера (ЮмМ Трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА), перемешивали на вортексе и осаживали клетки центрифугированием 2 мин при 12000-14000 об/мин. Удаляли 700 мкл супернатанта. Клеточный осадок ресуспендировали на вортексе, добавляли 1мл ТЕ-буфера и повторяли осаждение клеток центрифугированием, как и ранее. Удаляли весь супернатант. Проделывали это дважды или трижды, пока супернатант не становился почти бесцветным. К клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К1 (ЮмМ Трис-С1, рН 7,4, ЮмМ ЭДТА, 150 мМ NaCl), после этого добавляли SDS до конечной концентрации 0,5%, 100 мкг/мл протеиназы К). Фермент добавляли из сток-раствора (20 мг/мл в воде, хранить при -20С) непосредственно перед выделением.
Ресуспендировали пипетированием, стараясь не создавать пены, после чего инкубировали 3 часа при 50С, перемешивая на вортексе каждые 15-30 минут. Добавляли равный объем (400 мкл) смеси фенол :хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), трясли на вортексе и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая на вортексе. Разделяли фазы центрифугированием 2 мин при 12000-14000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, добавляли туда же 400 мкл хлороформа, трясли на вортексе и разделяли фазы центрифугированием 1 мин при 12000-14000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, измеряли объем и добавляли 1/10 объема ЮМ ацетата Na , рН 5,2 и 2,5 объема 96% этанола, оставляли на 20 мин при -20С, после чего осаждали ДНК центрифугированием в течение 10 мин при 12000-14000 об/мин при 4С-25С и удаляли супернатант. К осадку добавляли 1 мл 70% этанола, аккуратно перемешивали, центрифугировали 2 мин на максимальных оборотах микрофуги, супернатант удаляли, а осадок высушивали на воздухе при комнатной температуре до исчезновения видимых следов этанола (примерно 20-30 мин).Осадок растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера (ЮмМ Трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА) при 37С в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Измеряли концентрации ДНК флуоресцентным методом с красителем Hoehst. (см. ниже) Добавляли ТЕ-буфер до концентрации ДНК 200 нг\мкл. Переносили половину в другую пробирку и добавляли 2,5 объема этанола. Хранили на -20С.
Эхокардиографические показатели сердца у больных с семейными и спорадическими формами ГКМП.
Для оценки динамики клинической картины заболевания, больные были разделены на больных с обструктивными и необструктивными формами ГКМП. В первой группе выявлено 81% больных с обструктивной формой заболевания, с необструктивной 19%, во второй группе - 67% обструктивных и 33% необструктивных форм. Таким образом, было установлено более выраженное преобладание обструктивных форм болезни в группе с семейными вариантами ГКМП и достоверное преобладание больных с необструктивными формами в группе со спорадическими вариантами ГКМП (р 0,05).
Среди больных с семейной ГКМП, страдающих обструктивной формой заболевания, было 15 (56%) больных с базальной обструкцией, 6 (22%) - со среднежелудочковой обструкцией и 6 (22%) - с сочетанием среднежелудочковой и базальной обструкций. В группе со спорадической ГКМП - 18 (64%) больных с базальной обструкцией, 5 (18%) - со среднежелудочковой и 5 (18%) - с сочетанием среднежелудочковой и базальной обструкций.
Анализ данных ЭХОКГ позволил выявить, что в группе с семейными формами ГКМП преобладали больные с тотальной гипертрофией межжелудочковой перегородки (68%), выявлено 28% больных с гипертрофией верхней трети МЖП, 4% больных с симметричной гипертрофией и отсутствовали больные с верхушечным вариантом ГКМП. В группе со спорадической формой ГКМП также преобладали больные с тотальной гипертрофией межжелудочковой перегородки - 53%, хотя их доля была меньше, чем при семейных формах, в 25% случаев отмечалась гипертрофия верхней трети МЖП, симметричная гипертрофия отмечалась в 14% и верхушечная в 4% случаев (таблица 6).
![Значение показателей комплексного клинико-функционального обследования в оценке возможности возникновения и особенностей течения пароксизмальной формы фибрилляции предсердий [Электронный ресурс]](/i/i/4713/192895.png "Значение показателей комплексного клинико-функционального обследования в оценке возможности возникновения и особенностей течения пароксизмальной формы фибрилляции предсердий [Электронный ресурс] Дедов Дмитрий Васильевич")
