Введение к работе
Актуальность проблемы
Поиск немедикаментозных методов защиты организма приобретает все большее ачение, являясь важной проблемой теоретической и практической медицины. В следние годы экспериментально показано, что а результате адаптации организма к рессорным и другим повреждающим воздействиям происходят изменения не лько на уровне целого организма [Меерсон, Пшенникова, 1988], изолированных танов и тканей, но и на уровне внутриклеточных мембранных структур [Сазонтова, '98]. Одновременно интенсивно развивается изучение отдельных ізкомолекулярньїх компонентов цитоплазмы клеток и их роли в повреждении и щите клетки. Однако, до сих пор практически отсутствуют данные о механизме 'йствия растворимых цитоплазматических факторов (РЦФ) в мембрано-абилизирующем эффекте адаптации. До настоящего времени не известны способы даже сама возможность репарации нарушенных функций на уровне утриклеточных структур при стрессорных повреждениях.
Известно, что острое стрессорное воздействие различной природы приводит к рушениям функционирования сердечно-сосудистой системы, снижению ектрической стабильности сердца, нарушению метаболизма в кардиомиоцитах, и в нечном итоге к развитию ишемической болезни, кардиопатий, аритмий и т.д. еерсон, 1986]. В последнее десятилетие показано, что стресс-индуцированное вреждение на внутриклеточном уровне проявляется в значительном снижении эфективности функционирования мембранных ион-транспортирующих систем -),К-АТФазы плазматической мембраны, Са-АТФазы саркоплазматического тикулума (СР), Са-АТФазы плазматической мембраны и митохондрий [Arkhipenko al., 1985; Сазонтова Т.Г. и др., 1989; Parnham, Lunec, 1986; Zaidi et a!.. 1995]. При ом наряду со снижением устойчивости ферментов к действию эндогенных вреждающих факторов, значительно уменьшается также и скорость акционирования этих важнейших систем ферментов поддержания клеточного иного баланса. Степень ингибирования достигает 30-50%, что в отсутствии мпенсации приводит к снижению порога выживаемости. Такое существенное дение активности ферментов, наблюдаемое in vitro в изолированных мембранных эакциях, вызывает закономерный вопрос о совместимости этого явления с інаруженньїм поддержанием некоторых физиологических функций после стресса, от вопрос особенно актуален при изучении Са-транспортирующей системы СР юкарда, ответственной за поддержание Са-гомеостаза в клетке и реализацию кла сокращение-расслабление. Действительно, показано, что даже длительный юционально-болевой стресс в течение 4-х или 6 часов [Белкина и др., 1983] не ізьівает достоверного изменения сократительной функции сердца - развиваемое вление и частота сердечных сокращений остаются на контрольном уровне.
Следовательно, в стрессированном сердце резкое падение активности эрментов ионного транспорта должно быть хотя бы частично скомпенсировано, обы поддерживать физиологические функции на прежнем уровне. Поскольку при трых воздействиях компенсация не может быть осуществлена за счет быстрого іссированного синтеза новых молекул ферментов ионного транспорта, можно лагать, что восстановление функции поврежденных при стрессе мембранно-язанных ферментов происходит за счет различных РЦФ, которые, как показано в
2 последнее время, быстро накапливаются в клетке при стрессе, ишемии, теплово шоке, индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Mulvagh et al. 1987; Graven і al., 1993; Melia et al., 1994; Nanji et al., 1995; Plumier et al., 1996; Bhattacharyya, Sei 1998]. Однако, данные о влиянии на мембранные системы клетки различнь низкомолекулярных соединений разрозненны и зачастую противоречивы, что связан с тем, что роль РЦФ практически не рассматривается в целом, а выделяются изучаются лишь отдельные цитоплазматические компоненты. Поэтому оцем суммарного эффекта РЦФ может являться актуальным информативным тестом.
Еще меньше данных о роли РЦФ при адаптации к различным факторам ереді При этом нужно учитывать, что адаптационные изменения в значительной степей реализуются на уровне самих мембран и связанных с ними ферментов - происході смена изозимного состава, изменяется чувствительность к субстратам и регулятора и т.д. Однако, так же, как и в ситуации со стрессорными повреждениями, вопрос соотношении вклада в адаптационное изменение работы фермента процессо происходящих на уровне самого мембранно-связанного белка и участия мембранной адаптационной защите других факторов клетки, в частности, РЦ< остается открытым. Кроме того, не ясна возможность существования не толы прямого, но и перекрестного адаптационного защитного эффекта на внутриклеточне уровне, и его модулирования с помощью экзогенно добавленнь мембранопротекторов.
В связи с этим цель работы заключалась в том, чтобы оценить прямой перекрестный эффекты цитоплазматических факторов, накопленных в миокарде скелетных мышцах при остром стрессе и адаптации к нему, а также протекторне действие природного термостабилизатора (а-кристаллина), на активность резистентность Са-транспортирующей системы СР.
В рамках этой цели решались следующие экспериментальные задачи:
1^ Оценить повреждающий эффект острого стресса и протекторное действі адаптации к стрессу на активность Са-насоса СР миокарда и скелетных мышц и е резистентность к повреждающим факторам - термоденатурации, автолизу, индукці ПОЛ и др.
-
Провести моделирование стрессорного повреждения Са-насоса С скелетных мышц in vitro с помощью частичного окисления мембран и автолиза присутствии и отсутствии высоких концентраций Са2*.
-
Исследовать действие РЦФ на стресс-индуцированные и адаптационнь изменения активности и конформационной стабильности Са-насоса СР, выяви тканеспецифичность проявления эффектов РЦФ в сердце и скелетных мыш Сравнить эффекты стресса и адаптации к нему на Са-насос СР, при определении е активности в гомогенатах сердца и скелетных мышц или в мембранных препарат СР из этих тканей.
-
Оценить перекрестные эффекты РЦФ, а именно: стрессорных РЦФ і мембраны СР миокарда и скелетных мышц от контрольных и адаптированні животных, а также адаптационных РЦФ на контрольные и стресс-поврежденж мембраны СР этих тканей.
-
Исследовать протекторное действие а-кристаллина на мембранную систеї Са-транспорта СР миокарда и скелетных мышц (в гомогенатах и мембранні препаратах) при стрессе и адаптации к нему. Оценить возможность усилені протекторного действия а-кристаллина с помощью РЦФ. Выяснить возможное
/щєствования репарационного эффекта а-кристаллина в отношении Са-насоса Р, поврежденного в результате стрессорного воздействия.
Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые на нутриклеточном уровне продемонстрировано участие комплекса цитозольных змпонентов в защитном эффекте на систему транспорта Са2* в СР миокарда энтрольных, стрессорных и адаптированных животных. Этот протекторный эффект азличается по степени выраженности в зависимости от состояния организма in vivo: эм значительнее исходно поврежден транспорт Са2<", тем больше защитный эффект итозольных факторов. Максимален он при стрессе, т.е. в ситуации, при которой эрмоустойчивость Са-насоса СР минимальна и наименее выражен этот эффект при цаптации к стрессу (т.е. при максимальной термоустойчивости). Сопоставление іункционирования Са-транспортирующей системы СР, активность которой змерялась в гомогенате и в микросомальных препаратах СР в присутствии итоплазматических компонентов, показало аналогичные результаты.
Впервые продемонстрирована тканеспецифичность эффектов РЦФ в скелетных ышцах и миокарде. Показано, что РЦФ в сердце прежде всего увеличивают зрморезистентность мембранно-связанных ферментов, в то время как в скелетных ышцах не изменяя термостабильность Са-насоса СР, РЦФ значительно повышают эрвоначальную активность фермента. Несмотря на выраженную :анеспецифичность проявления протекторного эффекта растворимых компонентов в эрдце, и в скелетной мышце стресс-индуцированные нарушения работы ембранных ферментов компенсируются в обеих тканях и поддерживается высокая рфективность их функционирования.
Впервые продемонстрирована возможность наличия перекрестных защитных рфектов адаптации на внутриклеточном уровне в отличие от существования только эямых эффектов стрессорных цитоплазматических компонентов, которые (азывают защитное действие строго специфично только в отношении стресс-эврежденных Са-насоса миокарда и скелетных мышц и не имеют выраженного эйствия в контроле и при адаптации к стрессу. Цитозольные компоненты от каптированных животных как в сердце, так и скелетных мышцах, напротив, Зладают ярко выраженным перекрестным протекторным эффектом во всех группах, эзависимо от состояния организма.
Впервые показан защитный эффект а-кристаллина, повышающего активность и інформационную стабильность Са-транспортирующей системы СР как скелетных ышц, так и миокарда, при этом его эффект проявляется только при наличии острых звреждающих воздействий, а именно при стрессе у контрольных или у оптированных животных. Обнаружена тканеспецифичность действия а-іисталлина. В мембранных препаратах скелетных мышц а-кристаллин повышает шько начальную активность Са-насоса СР, причем для проявления своего действия і не требует присутствия дополнительных активаторов. В сердце защитный эффект кристаллина релизуется только при наличии РЦФ, накопленных при стрессе.
Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней впервые изучен )ямой и перекрестный эффект цитозольных компонентов сердца и скелетных мышц ' стрессированных и адаптированных животных на функционирование мембранно-іязанного Са-насоса СР. Показана универсальность действия РЦФ, защищающих эмбраны СР от свободно-радикальных, автолитических и тепловых повреждений.
ч
Обнаружен репарационный эффект а- кристаллина, восстанавливающе
активность Са-насоса СР после повреждающего стрессорного воздействия.
Практическое значение работы состоит в том, что в ней на основе изучен; мембранопротекторного действия РЦФ сердца и скелетных мышц показаі возможность использования цитоплазматических компонентов для повышен! эффективности защитного действия адаптации к факторам среды. Применені одного из РЦФ - неспецифического термостабилизатора а-кристаллина может бы эффективно при комплексной профилактике стрессорных повреждений, включающі адаптационные воздействия различной природы для снижения «цены» адаптации для проявления максимального защитного эффекта от последующих повреждений.
Положения, выносимые на защиту,
-
Цитоплазматические компоненты оказывают протекторный эффект і активность Са-насоса СР скелетных мышц и терморезистентность этого фермента миокарде, причем степень выраженности защиты тем больше, чем значительна повреждена система транспорта Са2* в СР.
-
Стрессорные цитоплазматические компоненты оказывают защитное дєйстві строго специфично только в отношении стресс-поврежденных мембранно-связаннь ферментов, а цитозольные компоненты от адаптированных животных имеют ярі выраженный перекрестный протекторный эффект, независимо от состояв организма.
-
а-кристаллин в сердце и скелетной мышце оказывает протекторное репарационное действие на систему транспорта Са2* в СР при острых повреждающі воздействиях, при этом в миокарде его эффекты проявляются только при наличі-дополнительных цитоплазматических активаторов, т.е в гомогенатах или пр совместном действии РЦФ и а-кристаллина.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсужден на Первом региональном совещании по медицинским наукам «Роль свободнь радикалов в здоровом состоянии и при болезнях» (Иерусалим, Израиль, 1998 Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождени И.П.Павлова (С.-Петербург, 1999), Всероссийской научной конференции «Свободны радикалы и болезни человека» (Смоленск, 1999), Международной конференции п гипоксии (Москва, 1999).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов методов, 3 глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов выводов. Список литературы содержит 229 источников. Диссертация иллюстрирован 25 рисунками.
