Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 . Роль цитокинов в патогенезе и саногенезе при ВЗК (обзор литературы) 11
1.1. Цитокины в регуляции иммунитета и воспаления 11
1.2. Цитокины и иммунный ответ при ВЗК 16
1.3. Интерлейкин-10 и его роль при ВЗК 20
1.4. Интерлейкин-4 и его роль при ВЗК 22
1.5. Антагонист рецептора интерлейкина-1 и его роль при ВЗК 24
1.6. Цитокины в терапии ВЗК 28
ГЛАВА 2. Клиническая характеристика больных 33
Глава 3. Методы исследования 58
3.1. Выделение чистых популяций мононуклеарных клеток, полиморфноя-дерных лейкоцитов и их стандартизация 60
3.2. Определение интерлеикинов в клеточных супернатантах методом имму-ноферментного анализа 61
3.3. Статистическая обработка результатов 64
ГЛАВА 4. Продукция цитокинов лейкоцитами периферической крови больных як и бк (собственные данные) 65
4.1. Синтез интерлейкина-10 in vitro МНК и МПЯЛ у больных ЯК 65
4.2. Синтез интерлейкина-4 in vitro МНК и ПМЯЛ у больных ЯК 72
4.3. Синтез интерлейкина-1 pa in vitro МНК и ПМЯЛ у больных ЯК 78
4.4. Синтез интерлейкина-10 in vitro МНК и ПМЯЛ у больных БК 84
4.5. Синтез интерлейкина-lpa in vitro МНК и ПМЯЛ у больных БК 90
4.6. Синтез интерлейкина-4 in vitro МНК и ПМЯЛ у больных БК 96
4.7.1. Синтез ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1ра в динамике лечения больных ЯК 102
4.7.2. Синтез ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1ра в динамике лечения больных БК 108
4.8. Возможности прогнозирования эффективности фармакотерапии ЯК и БК с учетом исходной продукции цитокинов нейтрофилами и мононуклеми 113
Обсуждение 118
Выводы 131
Практические рекомендации 133
Список литературы 134
- Цитокины в регуляции иммунитета и воспаления
- Цитокины и иммунный ответ при ВЗК
- Выделение чистых популяций мононуклеарных клеток, полиморфноя-дерных лейкоцитов и их стандартизация
- Синтез интерлейкина-10 in vitro МНК и МПЯЛ у больных ЯК
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В, настоящее время воспалительные заболевания кишечника (язвенный колит и болезнь Крона) являются одной из наиболее серьёзных проблем гастроэнтерологии, актуальность которых в значительной мере предопределена неизвестной этиологией, сложностью патогенеза, рецидивирующим характером течения, опасными для жизни осложнениями и малоэффективным лечением. [8,7]. Данная патология является одной из ведущих причин временной нетрудоспособности и инвалидизации больных, что свидетельствует о социально-экономической значимости её профилактики и лечения [45,67,68].
Итоги научных исследований последних лет укрепили убеждение исследователей в том, что возникновение и течение ЯК и БК в значительной степени обусловлено генетическими и молекулярными нарушениями регуляции клеток иммунной системы - главных эффекторов воспалительной реакции в желудочно-кишечном тракте [98,138].
Слизистая оболочка кишечника является входными воротами для многочисленных возбудителей и местом первого контакта с большим числом потенциальных антигенов (компонентов пищи, эндотоксинов, вирусов, протеогли-канов бактериальной оболочки, протеина А и др.). В условиях антигенного стресса, истытываемого лимфоидной системой кишечника (GALT), нарушается адекватная регуляция селективного иммунного ответа с последующим развитием хронических воспалительных изменений слизистых оболочек, особенно слизистой оболочки кишечника, учитывая его высокую антигенную нагрузку [122,131].
Выполненные к настоящему времени исследования раскрывают лишь отдельные стороны регуляции иммуновоспалительной реакции в слизистой оболочке кишечника при БК и ЯК. Очевидна противоречивость результатов исследований роли различных иммунологических факторов ВЗК. В то же время достигнуто согласие в том, что нарушения, выявляемые при всех формах воспаления кишечника, опосредуется медиаторами - цитокинами, вырабатываемыми многими видами клеток (главным образом, Т-лимфоцитами, макрофагами, нейтрофилами, клетками сосудистого эндотелия, эпителиальными клет-
калій) при контакте с определенными антигенами. Именно клетки макрофагаль-ной системы и составляют основной клеточный субстрат иммунного воспаления в кишечной стенке при БК и ЯК [52,63,77,224]. Стимуляция или наоборот, подавление активности различных Т-клеток (Т-хелперов 1 и 2 типов) может изменять профиль цитокинов со сдвигом в сторону преобладания синтеза пептидов с про - или противоспалительной направленностью [69,108,186,213].
Можно полагать, что состояние медиаторов иммунного ответа характеризует
важные дисметаболические процессы в стенке кишечника и, в конечном счёте,
определяет темпы развития воспалительно-деструктивных изменений, а их ин
формативность как предикторов эффективности фармакотерапии при ЯК и БК
может быть весьма высока.
Современные принципы терапии ВЗК базируются на использовании препаратов 5-АСК, глюкокортикоидов, иммуносупрессоров, которые не обладают селективными действием к цитокинам с различным механизмом действия, что, несомненно, вызывает определенные проблемы в лечении этих заболеваний.
С этих позиций изучение системы противовоспалительных цитокинов при различных клинических формах ЯК и БК представляет несомненный теоретический интерес и практический интерес. С одной стороны, это позволит уточнить механизмы хронизации иммуновоспалительного процесса в кишечной стенке, с другой - открывает перспективу для разработки дополнительных диагностических и прогностических критериев, позволяющих оптимизировать лечение ЯК и БК и повысить её эффективность.
Цель исследования.
Определение клинико-диагностического и прогностического значения синтеза ИЛ-10, ИЛ-4, и ИЛ-1ра полиморфноядерными лейкоцитами и мононуклеар-ными клетками при язвенном колите и болезни Крона.
Задачи исследования:
1. Изучить спонтанный и индуцированный митогеном синтез ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-lpa в нейтрофилах и мононуклеарных клетках периферической крови у больных ЯК и БК в фазе обострения.
2. Установить взаимосвязи между уровнем спонтанного и стимулированного
митогеном синтеза изучаемых цитокинов МНК и ПМЯЛ больных ЯК и БК - с
одной стороны, и полом, возрастом, стадией, клиническими формами, длитель
ностью течения заболевания - с другой.
Проследить динамику спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1ра МНК и ПМЯЛ в ходе лечения больных ЯК и БК в сопоставлении с его результатами.
Определить диагностическую и прогностическую информативность показателей изучаемых цитокинов МНК и ПМЯЛ при ЯК и БК.
Научная новизна исследования.
Впервые проведено комплексное изучение некоторых цитокинов с противовоспалительной направленностью (ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1ра) у больных с различными клиническими формами язвенного колита и болезни Крона. Впервые установлен факт повышения спонтанного и ЛПС-индуцированного синтеза ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1ра МНК и ПМЯЛ в период острых клинических проявлений ЯК. В фазе обострения БК при сравнительно более высоких, чем при ЯК, показателей продукции ИЛ-10 МНК и ПМЯЛ выявлена относительно низкая способность иммуноцитов крови к продукции ИЛ-4. Не установлено зависимости продукции изучаемых цитокинов лейкоцитами крови от половой принадлежности пациентов с ЯК и БК. Определено сравнительное увеличение синтеза противовоспалительных цитокинов иммуноцитами крови у пациентов с ЯК в возрасте до 40 лет. Впервые установлена зависимость спонтанного и митоген-индуцированного синтеза цитокинов МНК и ПМЯЛ от тяжести течения, распространенности, длительности и индекса клинической активности воспалительного процесса при ЯК и БК. Показано, что тотальному ЯК с высокой степенью воспалительной активности и пенетрирующей форме БК с сочетанным поражением тонкой и толстой кишки свойственна более высокая продукция ИЛ-10, ИЛ-1ра МНК и ПМЯЛ. В отличие от ЯК, при БК синтез ИЛ-4 лейкоцитами крови находился в обратной зависимости от индекса клинической активности - индекса Беста. Впервые охарактеризована динамика изучаемых цитоки-
8 нов в иммунокомпетентных клетках крови больных ЯК и БК в динамике стационарного этапа лечения и в течение 12 месяцев наблюдения за больными. Проведена оценка влияния основных групп препаратов на динамику синтеза ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1ра МНК и ПМЯЛ. Впервые показано, что клинической ремиссии ЯК свойственна нормализация показателей спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10 только МНК, тогда как продукция ИЛ-1ра, ИЛ-4 МНК и ПМЯЛ и ИЛ-10 ПМЯЛ сохранялись еще высокой. В период относительной клинической ремиссии БК спонтанный и ЛПС-индуцированный синтез ИЛ-1ра МНК нормализовались, а его продукция ПМЯЛ (спонтанная и стимулированная) оставалась повышенной. Спонтанный и ЛПС-индуцированный синтез ИЛ-4 МНК и ПМЯЛ нормализовался, а синтез ИЛ-10 МНК и ПМЯЛ сохранялся на прежнем высоком уровне.
Впервые установлено, что исходные показатели ИЛ-10 МНК при ЯК и спонтанной продукции ИЛ-4 МНК при БК могут использоваться в качестве предикторов эффективности предстоящего лечения и риска рецидива болезни.
Практическая значимость исследования.
Результаты диссертационного исследования имеют существенное значение для клиники внутренних болезней и практического здравоохранения в целом.
Комплексное исследование показателей синтеза противовоспалительных ци-токинов лейкоцитами крови дает возможность расширить имеющиеся научные представления об этиопатогенезе язвенного колита и болезни Крона.
Установленные взаимосвязи и особенности показателей синтеза изучаемых цитокинов у больных с ЯК и БК с фазой болезни, локализацией воспалительного процесса, клинической активностью, характером течения, длительностью заболевания могут использоваться в качестве дополнительных клинико-диагностических тестов рассматриваемой патологии. Охарактеризованная динамика цитокинов в лейкоцитах крови больных ЯК и БК с положительным ответом на базисное лечение через 48 недель от его начала, отражает ограниченные возможности стандартной фармакотерапии в плане коррекции метаболических расстройств, что создает предпосылки для рецидива заболевания.
9 Сопоставление результатов 12-ти месячного лечения больных с исходными
показателями изучаемых цитокинов в МНК и ПМЯЛ крови позволило разработать и предложить для практического использования предикторы формирования клинической ремиссии или очередной атаки ЯК и БК с целью выработки индивидуальных программ лечения и прогнозирования её эффективности. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: повышение показателей спонтанного и ЛПС-стимулированного синтеза ИЛ-4, ИЛ-10 и ИЛ-1ра иммунокомпетентными клетками крови в фазу обострения ЯК; увеличение спонтанного и индуцированного синтеза ИЛ-10 и ИЛ-1ра МНК и ПМЯЛ и относительно низкая способность иммуноцитов крови к продукции ИЛ-4 в активную стадию БК. о зависимость синтеза цитокинов нейтрофилами и мононуклеарными клетками крови от возраста пациентов, активности воспалительного процесса, локализации, тяжести, характера и длительности течения ЯК и БК.
' наличие особенностей синтеза ИЛ-4, ИЛ-10 и ИЛ-1ра МНК и ПМЯЛ пери-
ферической крови в динамике лечения ЯК и БК и при различных его результатах.
возможность использования показателей исследуемых цитокинов в МНК и
ПМЯЛ больных ЯК и БК с целью прогнозирования результатов лечения.
Практическое использование полученных результатов.
Результаты исследования внедрены и используются в практике работы гастроэнтерологического стационара Ставропольского краевого клинического центра организации специализированных видов помощи, гастроэнтерологического и колопроктологического отделений 2-й городской клинической больницы г. Ставрополя, в учебном процессе кафедр внутренних болезней №1 с курсом-поликлинической терапии, пропедевтики внутренних болезней Ставропольской государственной медицинской академии.
Материалы диссертации излажены в 14 научных работах, в том. числе в журналах ремомендованных ВАК РФ («Российский журнал гастроэнтерологии, ге-патологии, колопроктологии» 2006, 2007гг; «Экспериментальная и клиническая
10 гастроэнтерология» 2007 г), доложены на 12-й, 13-й Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2006, 2007); на Международном Славянско-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро - 2006» и «Санкт-Петербург - Гастро - 2007» (2006, 2007); на 14-й итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Ставропольской государственной медицинской академии (Ставрополь, 2006); на 5-й и 6-й конференции гастроэнтерологов ЮФО (Ростов-на-Дону, 2006; Ессентуки, 2007); на 1-м Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2006); на 1-й Международной (10-й Всерос-сийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006); на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной колопроктологии» (Ставрополь, 2006); на Международном Фальк-симпозиуме №154 «Воспалительные заболевания кишечника - диагностические и терапевтические стратегии» (Москва, 2006); на 7-м съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2007).
Апробация работы проведена на совместном заседании кафедры, пропедевтики внутренних болезней, кафедры внутренних болезней №2 и кафедры внутренних болезней стоматологического и педиатрического факультетов Ставропольской государственной медицинской академии.
Цитокины в регуляции иммунитета и воспаления
Основной функцией иммунной системы организма является распознавание антигенов и специфическое реагирование на них. Антигены, несущие признаки чужеродной в генетическом отношении информации, при попадании в организм нарушают гомеостаз и вызывают ответную реакцию иммунной системы, направленную на нейтрализацию, инактивацию и выведение из организма чужеродного антигена [59,60,125,134,167].
Решение этой задачи возложено на специальную сложноорганизованную группу медиаторов иммунной системы.
В последние несколько лет прогресс в молекулярной иммунобиологии позволил охарактеризовать большое число гормоноподобных белковых веществ способных осуществлять взаимодействие между различными клетками и тканями [63,71]. Был выделен ряд молекулярных комплексов, обладающих медиа-торными свойствами, и составляющих коммуникативную систему организма, координирующую деятельность различных клеток и тканей, поддерживающую или восстанавливающую гомеостаз. Среди них выделяют группу молекул, роль которых заключается не просто в обеспечении взаимодействия между отдельными клетками, а, по сути дела, всей иммунной системы в целом [64,77,80], начиная от процессов пролиферации и дифференцировки и заканчивая регулировкой их функциональной активности, координацией взаимодействия имму-нокомпетентных клеток [28,29,52,224].
Эти гормоноподобные протеины названы цитокинами, или пептидными ре-гуляторными факторами [76].
Цитокины различаются по строению, биологической активности жизни, происхождению и по многим другим признакам. Однако наряду с различиями цитокины обладают рядом сходных признаков, характерных для этого класса биорегуляторных молекул [25]. Так, все цитокины - эндогенные биологически активные медиаторы - представляют собой обширную гетерогенную группу низкомолекулярных белков, полипептидов. Состоят из одной - двух, реже более, полипептидных (гомо- и гетерологических) цепей с молекулярной массой от 8 до 90 кД, в основном 15-35кД, кодируемых собственными генами. Цитокины продуцируются преимущественно лимфоцитами, моноцитами и тканевыми макрофагами, а также рядом других клеток [18,42,43,69]. При этом Т-хелперы и макрофаги, выполняющие главные роли в поддержке приобретенного и врожденного иммунитета, являются основными клетками - продуцентами цитокинов [57,177].
Одновременно с синтезом цитокинов индуцируется выработка соответствующих рецепторов, так как условием ответа клеток на действие цитокинов является наличие на клеточной поверхности достаточного количества функционирующих рецепторов [131]. Синтез рецепторов протекает более интенсивно и длительно, чем синтез соответствующих цитокинов, что обусловливает их более полную и быструю элиминацию из сосудистого русла и реализацию биологического эффекта в очаге поражения [44,49,65,74,178,229].
К системе цитокинов в настоящее время относят около 200 индивидуальных полипептидных веществ [54,185]. Все они имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик, среди которых важнейшими считаются следующие: плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, отсутствие антигенной специфичности, проведение сигнала путем взаимодействия со специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети. В связи с этим цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции функций организма, существующую наряду с нервной и гормональной регуляцией [52,54].
В последние годы выяснилось, что регуляторная роль цитокинов в организме не ограничивается только иммунным ответом и может быть разделена на четыре основных составляющих: 1. Регуляция эмбриогенеза, закладки и развития органов, в том числе органов иммунной системы. 2. Регуляция отдельных нормальных физиологических функций, например нормального кроветворения. 3. Регуляция защитных реакций организма на местном и системном уровне. 4. Ре гуляция процессов регенерации для восстановления поврежденных тканей [1,10,26,32,34,35,48,56,61,65,74,82,83,131].
К цитокинам относят интерфероны (ИФН а, Р, у), интерлейкины (1-31), факторы некроза опухоли (ФНО а, Р), колониестимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, хемокины [25,44,69,97,116,229].
Цитокины не имеют единой, четко сформулированной классификации.
В настоящее время классификация цитокинов может проводиться по их биохимическим и биологическим свойствам, а также по типам рецепторов, посредством которых цитокины осуществляют свои биологические функции. Классификация цитокинов по строению учитывает не только аминокислотную последовательность но, прежде всего третичную структуру белка, более точно отражающую эволюционное происхождение молекул [137]. Согласно одной из классификаций [54], все цитокины по биологической активности можно разделить на основные группы: 1.Противовирусная активность - ИФН 1-го типа- ИФН а,Р,5,к,оэ,т, ИЛ-28ДЛ-29 (ИФНА.). 2.Стимуляция пролиферации и дифференцировки предшественников различных типов лейкоцитов - факторы роста гемопоэтических клеток - ИЛ-3, ИЛ-7,ИЛ-11,ГМ-КСФ, Г-КСФ,М-КСФ, эритропоэтин, тромбопоэтин. З.Провоспалительное действие, активация специфического иммунитета - семейство ИЛ-1- ИЛ-1а, ИЛ-1 р, ИЛ-lpa, ИЛ-18, фактор роста фибробластов. 4.Регуляция апоптоза и межклеточного взаимодействия иммунокомпетент-ных клеток - семейство фактора некроза опухолей - ТФР,ЛТ и др. 5.Иммунорегуляторное действие - семейство ИЛ-6 - ИЛ-6,ИЛ-11, ИЛ-31, он-костатин-М, кардиотропин -1. 6.Регуляция хемотаксиса различных типов лейкоцитов - хемокины - СС, СХС, (ИЛ-8), СХзС, С. 7.Иммуносупрессивное действие - семейство интерлейкина - 10 - ИЛ-10, -19, -20, -22, -24, -26.
Цитокины и иммунный ответ при ВЗК
Иммунная система кишечника представлена лимфоидной тканью (gut associated lymphoid tissue - GALT), которая в норме обеспечивает адекватный иммунный ответ при воздействии кишечных антигенов [30,122,131]. Существенная роль в регуляции иммунного ответа и поддержании иммунологичесской толерантности GALT принадлежит Т-клеткам (CD44), которыми обильно инфильтрирована собственная пластинка СОТК [113,211].
Т-лимфоциты этой системы (в отличие иммунной системы всего организма) не все являются тимусзависимыми; значительная их часть становится зрелыми независимо от тимуса. Специфические Т-лимфоциты являются носителями клеточного иммунитета и выполняют различные регуляторные и эффекторные функции. К ним относятся выработка цитокинов, стимулирующих другие клетки организма-хозяина, а также цитолиз, ведущий к разрушению клеток организма-хозяина [2].
Различают два вида Т-лимфоцитов. С одной стороны, это внутриэпители-альные лимфоциты. Они в очень небольшой степени экспрессируют ТКР на своей поверхности и, вероятнее всего, осуществляют только первую линию иммунной защиты против АГ просвета кишечника. Другой вид Т-лимфоцитов представлен лимфоцитами собственной пластинки (ЛСП), выполняющими важнейшие регуляторные и эффекторные функции. Они в большой степени напоминают циркулирующие лимфоциты крови. Антигены расщепляются на более мелкие иммуногенные детерминанты и после их встраивания в «борозду» молекул главного комплекса гистосовместимости MHC-I или МНС-П на поверхности клеток представляют цитотоксическим.лимфоцитам и Т-хелперам [30,86,132,133].
Таким образом, Т-клетки - важный компонент механизма развития как ЯК, так и БК. Но вопрос, стилгулируются ли патогенные клетки специфичным для этого заболевания антигеном или отвечают на его воздействие, остается пока без ответа.
С целью четкого определения типов Т-клеток, участвующих в развитии воспалительного процесса при болезни Крона, был произведен анализ ТКР. В норме в слизистой оболочке кишечника как внутри эпителия, так и в собственной пластинке значительно большее количество Т-клеток с ТКРсф, чем клеток с TKPyS. При БК в активной стадии процесса возрастает число Т-клеток, за счет ТКРар и меняется соотношение внутриэпителиальных ТКРуб-позитивных клеток и ТКРу5-клеток собственной пластинки слизистой оболочки [102]. По сравнению с контрольной группой пропорция толстокишечных TCRy8- позитивных интраэпителиальных лимфоцитов и CD3- позитивных клеток уменьшается при болезни Крона и язвенном колите, но особенно в собственной пластинке слизистой оболочки подвздошной кишки при тонкокишечной форме болезни Крона, что заставляет предполагать уникальность изменений для каждого типа воспалительного заболевания кишечника.
Кроме Т- и В-клеток в ответной иммунной реакции при ВЗК участвуют другие типы иммуноцитов, включая моноциты, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы. Однако эти клетки отнесены к неспецифическим соучастникам иммунного реагирования при ВЗК [194,203]. Участие фибробластов и мышечных клеток является очевидным при БК, где их активация в большей степени ответственна за образование стриктур [128].
Адекватный антигену иммунный ответ имеет принципиальное значение для организма. При нарушении иммунного гомеостаза GALT возникает ситуация, в результате которой воздействие любого антигена (бактериального, вирусного, пищевого) на кишечную стенку инициирует неадекватный клеточный иммунный ответ, с последующей генерацией каскада провоспалительных субстанций в слизистой оболочке кишечника [126,127,129,169,218]. Показано, что активация клеток воспаления и иммунной системы макрофагами происходит с помощью гуморальных факторов, объединенных в группу цитокинов.
По мнению известного специалиста Claudio Fiocchi, кишечные цитокины в настоящее время надо рассматривать в качестве ключевого компонента в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника [67]. Дисбаланс провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при ВЗК является следствием нарушения соотношения различных клеточных популяций в СОТК (Txl, Тх2 и макрофагов) и их патологической антигенной активации [7,190,216]. Наблюдается отчетливое повышение количества лимфоцитов собственной пластинки и увеличение экспрессии провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов. При болезни Крона доминирует секреция ИЛ-12 с последующей активацией Txl лимфоцитов и избыточным синтезом ИЛ-2, ИФН-у. Последние, воздействуя на макрофаги, могут приводить к деструкции клеток. При язвенном колите отмечается снижение экспрессии ИЛ-12, что ведет к дифференцировке Тх2-лимфоцитов, которые экспрессируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 [130,157,174,198,205,228].
В опыте на различных моделях колита было показано возможное участие Т-хелперов в контроле воспалительного процесса в толстом кишечнике. На модели острого иммунного колита показано, что активированные ИЛ-2 Txl-лимфоциты мышей активно продуцировали в слизистой оболочке кишечника провоспалительные цитокины - ФНО-а и ИФН-у [104,180,192]. При этом в ткани тонкого и толстого кишечника наблюдалась массивная лимфоцитарно - мак-рофагальная инфильтрация без повреждения эпителия кишечника и язвенного поражения, что напоминало гистологическую картину при БК [153].
Выделение чистых популяций мононуклеарных клеток, полиморфноя-дерных лейкоцитов и их стандартизация
Содержание цитокинов - ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1ра супернатантах клеток в спонтанных и индуцированных ЛПС условиях определяли методом ИФА с помощью стандартных тест-систем фирмы «Цитокин» (Россия) и регистрирующего устройства - фотометра вертикального сканирования («Мультискан», Венгрия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.
Экспрессию цитокиновых рецепторов и функциональную активность, по сути отражающих физиологическую активность клетки, анализировали при помощи постановки тестов in vitro [10,49].
В качестве моделей для изучения свойств клеток крови нами использовались тесты с нагрузкой ЛПС, который применялся в концентрации (10 мкг/мл) физиологической для многих клеточных популяций, обеспечивающей регуляцию иммунного ответа сходную с таковой в макроорганизме. Критерием физиологичное нагрузки служило разнонаправленное ее действие на клетки разных образцов крови [198,205,228].
Учитывая, что для анализа были использованы клетки, выделенные из организма, т.е. помещенные принципиально в иные условия существования, вполне возможно, что их состояние отличается от реальной физиологической активности в организме. Однако для практических целей можно допустить, что активность клетки in vivo так или иначе отражает функции выделенных клеток: для решения многих задач вполне достаточно иметь подобные косвенные данные.
После выделения и стандартизации ПМЯЛ и МНК, помещенные в питательную среду RPMI-1640, инкубировали во влажной атмосфере, содержащей 5 % СО2, в течение 24 часов при 37 С. При выборе методики инкубации использовали рекомендации Djeu J. соавт. [238]. Для изучения спонтанной продукции цитокинов клетки инкубировали в условиях без добавления стимулятора. В качестве индуктора синтеза цитокинов лейкоцитами использовали липополисахарид Е. Coli («Sigma», США), являющийся структурной частью клеточной мембраны грамотрицательных миіфоорганизмов. Митоген добавлялись к инкубируемой клеточной суспензии в дозировках, создающих конечные концентрации 10 мкг/мл [82,129]. - После инкубации клетки центрифугировали, надосадочную жидкость переносили в чистые пластиковые пробирки с крышкой на 1,5 мл. Каждую из полученных таким образом фракцию надосадочной жидкости мононуклеаров и поли-морфноядерных лейкоцитов для проведения индивидуальных тестов со всеми исследуемыми интрлейкинами маркировали и хранили при температуре ниже -25С до исследования.
Принцип иммуноферментного анализа основан на феномене конкуренции определяемого (немеченого) антигена с известным количеством меченого антигена за ограниченное количество специфических антител, введенных в систему. Чем больше в исследуемой жидкости содержится определяемого вещества, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами и, следовательно, больше останется в растворе. Количество меченых антигенов или антител, вступивших в реакцию, определяют на основании изменения окраски субстрата под влиянием пероксидазы. При гетерогенном иммуноферментном анализе антиген или антитело иммобилизуется на твердой фазе. В качестве твердой фазы обычно используют пластик - лунки планшетов для иммунологических реакций. Одним из основных вариантов техники гетерогенного иммуноферментного анализа (ELISA) являются неконкурентные тесты, к которым относится метод двойных антител (сэндвич- метод).
Метод двойных антител проводится в 2 этапа. Первый этап ведет к фиксации антитела (использовали антитела к человеческому интерлейкину) на твердой фазе пластины микротитратора, для чего их инкубируют в лунках планшета из полистирола с последующей отмывкой несвязавшихся антител. Затем в лунки добавляют растворы анализируемого или стандартного антигена ИЛ, инкубируют и отмывают. На втором этапе в лунки приливают избыток меченых ферментом антител. Второе моноклинальное анти-ИЛ биотинилированное антитело добавляется вместе с сопряженной стрептоведин-пероксидазой, которая под влиянием фермента превращается в окрашенный продукт реакции.
На последнем этапе анализа проводят инкубацию от 20 до 30 минут при комнатной температуре (18-25 С) в темноте. Биотинилированное антитело связывается с комплексом антиген-антитело твердой фазы, а не связавшиеся антитела удаляются отмыванием. Количество исследуемого продукта (а значит интенсивность окраски) пропорционально количеству связавшихся с антигеном конъюга-тов антитело-фермент (пероксвдаза стрептавидина). Степень окраски раствора измеряют фотометрически при помощи специальных спектрофотометров, позволяющих измерять поглощение света в пробах непосредственно на планшетах.
Тестирование стандартов для построения калибровочной кривой и исследуемых образцов проводили в дубле. После определения средних значений оптической плотности стандартных концентраций ИЛ при 450 НМ строили калибровочную кривую на логарифмической бумаге. Для этого по оси абсцисс откладывали концентрации ИЛ в пг/мл, а по оси ординат - полученные значения оптической плотности. Для определения ИЛ в исследуемой пробе рассчитывали величину оптической плотности и по калибровочной кривой устанавливали его концентра-. цию, умножая полученное значение на кратность разведения пробы.
Синтез интерлейкина-10 in vitro МНК и МПЯЛ у больных ЯК
Язвенный колит и болезнь Крона относятся к воспалительным заболеваниям кишечника и являются одной из актуальных проблем гастроэнтерологии [5,11,40,70]. Хронический, рецидивируюпщй характер течения, наличие местных и системных осложнений, сложность профилактики и лечения, делают понятным то большое социальное значение, которое придаётся вопросам этиологии, патогенеза и профилактики обсуждаемых заболеваний.
Прогресс в изучении ЯК и БК в последние годы обусловлен развитием знаний в сфере молекулярных и генетических механизмов повреждения кишечника [119]: Несмотря на достигнутые успехи в этой области, многие аспекты патогенеза ВЗК остаются недостаточно ясными. Сохраняется нерешённой проблема адекватной регуляции клеток иммунной системы кишечника (gut associated lymphoid tissue - GALT) - главных эффекторов развития хронического воспаления: Антигенный стресс, испытываемый GALT - системой, подразумевает, с одной стороны, обеспечение толерантности по отношению к чужеродным антигенам (компонентам пищи, бактериальным антигенам и т.д.), с другой - выработку высокоселективного и высокоспецифического иммунного ответа. Указанные механизмы и их регуляция до настоящего времени не уточнены.
В литературе имеется достаточное количество сведений о нарушениях в функционировании иммунокомпетентных клеток при ЯК и БК, что обуславливает своеобразие морфологических изменений тканей в области воспаления и течение процесса по принципу порочного круга, чрезвычайно затрудняющее регенерацию поврежденных тканей и восстановление гомеостаза [19,33,41].
В настоящее время не вызывает сомнений ведущая роль иммунных нарушений в развитии воспалительной реакции. Данные литературы свидетельствуют о многочисленных, но не закономерных изменений клеточного и гуморального иммунитета. Большинство авторов отмечает дисбаланс субпопуляций Т-лимфоцитов с преимущественным снижением функции Т-супрессоров, изменение вследствие этого хелперно-супрессорного соотношения, что отражается на функции В-лимфоцитов. Установлено изменение уровней иммуноглобулинов крови и слизистой оболочке кишечника при ВЗК. Большое значение придается антинейтрофильным антителам, которые выполняют иммунорегуляторную функцию и удлиняют срок жизни иммунокомпетентных клеток, т.е. вовлечены в регуляцию апоптоза.
Важную роль в регуляции воспалительной реакции и иммунного ответа играют цитокины. Известно, что цитокины обеспечивают оптимальное развитие иммунной реакции в рамках «цитокиновой сети» [189]. Представляя в различных тканях своеобразную «микроэндокринную систему», эти белковые медиаторы формируют сеть коммуникационных сигналов между клетками иммунной системы и другими системами органов и тканей [203]. Под контролем этого класса регуляторных белков протекают все клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток. Эффекты каждого цитокина на клетки характеризуются плеотропно-стью, спектр эффектов разных медиаторов перекрывается и, в основном, конечное функциональное состояние клетки зависит от влияния нескольких цито-кинов, действующих синергично. В клиники с целью лечения ЯК и БК продолжают апробироваться некоторые цитокины, в частности, рекомбинанатный ИЛ-10, ИЛ-1ра (Арил). Доказал свою высокую клиническую эффективность в лечении ВЗК препарат инфлексимаб (Ремикейд ) - антагонист ФНО-а Использование медикаментов, влияющих на регулировку цитокиновой системы открывает перспективу целенаправленного патогенетического лечения ВЗК.
Поскольку воспалительный инфильтрат в слизистой оболочке кишечника представлен в основном иммунокомпетентными клетками (лимфоцитами, ней-трофилами, эозинофилами, макрофагами и др.) - потенциальными источниками цитокинов, необходимость изучения трансмиттеров межклеточного взаимодействия в иммуноцитах крови для уточнения их роли в пато- и саногенезе обсуждаемой патологии вполне объяснимо.
Учитывая принципиальную важность проблемы межклеточных взаимодействий при ЯК и БК, мы провели комплексное изучение показателей синтеза цитокинов лейкоцитами крови с преимущественно противовоспалительной функ 120 цией в спонтанных и митоген-индуцированных условиях при различных клинических формах заболеваний. Взаимодействие бактериального ЛПС (эндотоксина) и иммунокомпетентных клеток крови человека представляет собой модельную систему для изучения их активации и функционирования в условиях грамотрицательной бактериальной инфекции и воспаления. Полученные данные рассматривались в сопоставлении с полом, возрастом больных, клинической активностью, протяженностью поражения кишечника, характером и тяжестью заболевания. Продукция цитокинов иммуноцитами крови была изучена также в динамике лечения. Предпринята попытка использовать результаты исследования в прогнозировании возможного ответа на проводимую терапию и риска очередной атаки ЯК и БК.
Являясь одним из центральных звеньев иммунной системы человека, цито-киновая система способна реагировать практически на любые протекающие в кишечнике патологические процессы. При этом происходит активация имму-ноцитов, что в конечном итоге, согласно проведенным исследованиям, приводит к резкому повышению уровня не только про-, но и противовоспалительных ИЛ в клетках периферической крови больных ВЗК.
Нами выявлены определенные различия, касающиеся количественного уровня ШІ-4, ИЛ-10 и ИЛ-1ра синтезируемые МНК и ПМЯЛ в спонтанных и индуцированных условиях у больных различными клиническими формами и в разных стадиях язвенного колита и болезни Крона, что дает основание расценивать данный факт как дестабилизацию местного гомеостаза и потенцирование процессов воспаления в кишечной стенке.
