Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Значение миокардиальной цитопротекции в лечении ишемической болезни сердца 9
1.2. Роль оксида азота при сердечно-сосудистых заболеваниях 15
1.3. Клинико-патохимические аспекты обмена липидов и фосфолипидов. 21
Глава 2. Общая характеристика наблюдаемых больных, методы исследования и лечения 28
2.1. Группы наблюдения 28
2.2. Дизайн исследования 32
2.3. Специальные методы исследования 34
Глава 3. Влияние милдроната на показатели клинической эффективности и функциональных проб у больных стабильной стенокардией II и III функциональных классов
42
Глава 4. Характеристика биохимических исследований на фоне медикаментозной терапии с включением милдроната 56
4.1. Особенности генерации метаболитов оксида азота в крови больных стабильной стенокардией в зависимости от тяжести заболевания 56
4.2. Характеристика липидной компоненты мембран эритроцитов 60
4.3. Динамика фракций фосфолипидного состава эритроцитарных мембран 67
Глава 5. Обсуждение результатов исследования 79
Выводы 89
Практические рекомендации 91
Список литературы 92
- Значение миокардиальной цитопротекции в лечении ишемической болезни сердца
- Роль оксида азота при сердечно-сосудистых заболеваниях
- Специальные методы исследования
- Особенности генерации метаболитов оксида азота в крови больных стабильной стенокардией в зависимости от тяжести заболевания
Введение к работе
Актуальность проблемы
Традиционно для лечения ИБС применяют антиангинальные средства, которые уменьшают работу сердца или увеличивают коронарный кровоток. Они воздействуют на гемодинамические параметры, однако не способны повлиять на эффективность использования кислорода миокардом. Кроме того, их применение в значительной степени ограничено противопоказаниями и побочными эффектами [164].
В течение длительного времени велся поиск цитопротекторов, защищающих клетку от последствий ишемии путем влияния на звенья метаболической цепи и предотвращения негативного воздействия кислородного голодания на жизнеспособность клеток [158].
В 1988 году был создан, исследован и проверен в клинических испытаниях цитопротектор 2-го поколения - милдронат [100]. Было выявлено и подтверждено влияние милдроната на процессы окисления жирных кислот в клетках. Результаты исследований подтвердили, что милдронат приводит к ограничению потока жирных кислот через мембраны митохондрий и защищает клетку от гибели в условиях кислородного голодания. Он вызывает в клетках эффект прекондиционирования, стимулируя экспрессию ферментов, необходимых для окисления Сахаров, таким образом, помогая клеткам оптимизировать потребление кислорода для получения энергии [39]. Препарат защищает клетки и от влияния свободных радикалов вследствие индукции биосинтеза оксида азота, который является мощным вазодилататором и участвует в регуляции коронарного кровотока [108]. Однако результаты многочисленных исследований, проведенных по оценке состояния системы генерации оксида азота в условиях хронической гипоксии, порой неоднозначны и противоречивы. Этим определяется интерес к изучению метаболитов NO у больных
5 стенокардией и выявлению их взаимосвязи с основными клиническими
показателями.
Состояние структуры и функции клеточных мембран, их
липидный состав изменяются уже на ранних этапах гипоксии миокарда.
В настоящее время вполне очевиден тот факт, что важнейшую роль в
поддержании микроструктурной целостности, физико-химических
свойств, а, следовательно, и нормальной функции мембран, а также
встроенных в них биологически важных образований играют
расстройства липидного и фосфолипидного (ФЛ) состава [52]. Причем
ведущую роль в этих нарушениях отводят именно повреждениям
фосфолипидной составляющей липидной компоненты мембран.
Известно, что через ФЛ биомембран опосредуют свои повреждающие
эффекты процессы гиперактивности перекисного окисления липидов-
ПОЛ [2,28]. Отсюда и то большое значение, которое придается данному
вопросу в наших исследованиях.
Цель исследования:
Изучить влияние милдроната на физическую работоспособность, некоторые показатели метаболического статуса и эндотелий-релаксирующий фактор у больных стабильной стенокардией.
Задачи исследования:
Оценить эффективность милдроната в комплексной терапии больных со стабильной стенокардией II и III функциональных классов.
Изучить липидный и фосфолипидный состав мембран эритроцитов у больных стабильной стенокардией.
Оценить воздействие милдроната в комплексном лечении больных ИБС на показатели липидной и фосфолипидной компоненты мембран эритроцитов.
Определить уровень нитратов/нитритов в крови больных ИБС в зависимости от тяжести заболевания
Исследовать влияние милдроната на уровень конечных метаболитов оксида азота в крови больных ИБС и оценить его диагностическую значимость.
Научная новизна
Выявлено, что динамика основных параметров липидной
компоненты мембран эритроцитов при включении милдроната в состав
комплексной терапии больных стенокардией характеризовала значимое
снижение показателей коэффициента СХС/ФЛ, что свидетельствовало
об улучшении структурно-функциональных свойств мембран
эритроцитов. Установлено, что характер динамики изученных фракций фосфолипидов в мембранных структурах эритроцитов указывает на то, что под влиянием комплексного лечения наблюдается значимое снижение уровня токсической фракции ЛФТХ , обладающей мембраноцитотоксическим эффектом, а у больных стенокардией ФК II-его нормализация; имеются признаки мобилизации фосфолипидных резервов, однако полной стабилизации мембран и нормализации их состава не происходит.
Установлены особенности влияния милдроната на содержание метаболитов оксида азота в крови больных стенокардией в зависимости от их исходного уровня и клинической картины заболевания.
Показано нормализующее действие милдроната на содержание нитратов/нитритов в плазме крови больных ИБС при исходно низком его уровне, предполагая роль препарата в качестве активатора выработки эндогенного оксида азота.
7 Практическая значимость
Результаты исследований, основанные на выявленной зависимости между уровнем метаболитов NO и тяжестью течения ИБС, могут явиться основой для разработки дополнительного диагностического теста и решения вопроса о назначении препаратов — донаторов оксида азота.
Результаты клинико-биохимических исследований, проведенные на фоне комплексного лечения больных стенокардией, позволяют рекомендовать включение в ее состав миокардиального цитопротектора милдронат.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу кардиологических
отделений МУ ГКБ №13 г.Уфы, ГУЗ «Республиканский
кардиологический диспансер» г. Уфы, используются в учебном процессе кафедры кардиологии и функциональной диагностики ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию ».
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Материал изложен на 114 страницах машинописного текста и включает 14 таблиц и 23 рисунка. Указатель литературы содержит 99 отечественных и 101 зарубежных источников.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Включение милдроната в комплексную терапию больных стенокардией II и III функциональных классов позволит усилить эффект
8 антиангинальных препаратов и увеличить переносимость физических
нагрузок, не влияя на такие показатели гемодинамики, как АД и ЧСС.
В крови больных стенокардией определяется нарушение структурной организации мембран с повышением их жесткости.
Включение миокардиального цитопротектора милдронат в комплексную терапию больных стенокардией способствует улучшению липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов.
Определяется зависимость между уровнем нитратов/нитритов в плазме крови и тяжестью течения ИБС.
Применение милдроната в комплексной терапии больных стенокардией оказывает нормализующее влияние на содержание метаболитов NO в плазме крови при исходно низком его уровне.
Значение миокардиальной цитопротекции в лечении ишемической болезни сердца
Известно, что ишемия миокарда часто приводит к столь значительным метаболическим изменениям, что даже восстановление кровотока и доставки кислорода во многих случаях не позволяет сохранить функциональную активность сердца [72]. Поэтому традиционные группы антиангинальных препаратов, влияющих на гемодинамические показатели, не всегда достаточно эффективны. Их назначение зачастую ограничено наличием противопоказаний и побочных эффектов.
В последние годы значительно изменились представления о патогенезе коронарной недостаточности, являющейся наиболее частым осложнением ИБС, которая в настоящее время представляется как совокупность двух патогенных синдромов — ишемического и реперфузионного.Тяжесть и последствия этих состояний определяются преимущественно тканевыми повреждениями [ПО]. Ишемия и реперфузия вызывают метаболические реакции с повреждением миокарда [200].
В периоды ишемии реперфузии образуются свободные кислородные радикалы в митохондриях, мембранах кардиомиоцитов, эндотелиальных клетках и лейкоцитах. Они вызывают пероксидацию липидных компонентов сарколеммы, изменяя мембранную проницаемость [128]. Это способствует преходящей перегрузке кальцием, активации нежелательных эффектов.
Экспериментально была подтверждена гипотеза о том, что можно, тормозя транспорт жирных кислот и, следовательно, их окисление; адаптировать клетки сердечной мышцы и мозга к кислородной недостаточности. В течение длительного времени велся поиск веществ цитопротекторов, которые могли бы оптимизировать использование кислорода для выработки энергии в миокарде [158].
Во время ишемии уровень доставки энергетических субстратов в миокард снижен, при этом возрастает вклад гликолиза в образование АТФ. Для поддержания интенсивного гликолитического процесса используются запасы гликогена. Интенсивность гликолиза намного превышает интенсивность окислительных процессов, что приводит к накоплению лактата, протонов и развитию ацидоза [121, 148].
Из-за нехватки кислорода окисление жирных кислот происходит неполностью. В митохондриях накапливаются недоокисленные активированные формы жирных кислот. Они блокируют транспорт АТФ из митохондрий к месту ее потребления и оказывают разрушающее действие на мембраны [63] В свою очередь накопившиеся активированные формы жирных кислот блокируют Са -АТФазу саркоплазматического ретикулума (кальциевый насос); Na+, К+ АТФазу сарколеммы (натриевый и калиевый насосы), адениннуклеотидтранслоказу (АТФ-насос) [63]. Нарушение ионного равновесия выражается в накоплении натрия в клетке, что вызывает интенсивную задержку воды, приводящую к отеку клеток, который нарушает микроциркуляцию в результате сдавливания капилляров. Параллельно происходит выход ионов калия из клетки и накопление их в межклеточном пространстве вследствие нарушения функционирования натрий-калиевого насоса и открытия мембранных калиевых каналов из-за дефицита энергии [7]. В условиях ишемии ионы кальция вследствие выхода из цитоплазматического ретикулума накапливаются в цитоплазме и в митохондриях [81, 123, 178, 196].
Несмотря на то, что интенсивность гликолиза при ишемии возрастает, в результате недостатка кислорода скорость окисления глюкозы снижается [170]. Дефицит АТФ, избыток ионов кальция в сочетании с повышением продукции и увеличением содержания в кардиомиоцитах катехоламинов стимулируют "липидную триаду", включающую активацию липаз и фосфолипаз, детергентное действие неиспользованных в процессах окисления жирных кислот и активацию перекисного окисления липидов. Развитие "липидной триады" вызывает деструкцию липидного бислоя клеточных мембран [76].
В 1963 г. P.J. Randle и соавт. [188] обосновали теорию "глюкозо-жирнокислотного цикла", согласно которой окисление глюкозы и жирных кислот тесно сопряжено между собой и находится в обратной зависимости. Экспериментально установлено, что, если сердце использует только свободные жирные кислоты, то для производства того же количества АТФ, что и при окислении глюкозы, необходимо на 11% больше кислорода [72, 186]. Следовательно, при ишемии использование соединений, тормозящих окисление жирных кислот, может позволить оптимизировать выработку энергии в митохондриях за счет сдвига от окисления жирных кислот к аэробному окислению глюкозы и задержать развитие анаэробного гликолиза. Ингибирование окисления жирных кислот при ишемических состояниях уменьшает вероятность образования недоокисленных жирных кислот и перекисей, препятствует образованию свободнорадикальных форм кислорода и препятствует нарушению проницаемости мембран клеток для ионов, поддерживает образование АТФ, т.е. оказывает кардиопротективное действие при ишемии [130, 137, 154, 186, 191]. Первым цитопротектором с клинически значимой эффективностью явился триметазидин [17, 49, 85].
Через 27 лет был создан новый цитопротектор - милдронат, который обратимо ограничивает скорость биосинтеза карнитина из его предшественника - гамма-бутеробетаина (ГББ), а так как именно с помощью карнитина осуществляется транспорт длинноцепочечных
жирных кислот через мембраны митохондрий, то приток жирных кислот и, следовательно, их накопление в митохондриях уменьшается, что никак не сказывается на метаболизме короткоцепочечных жирныхкислот. В связи с этим милдронат практически не способен оказывать токсическое действие на дыхание митохондрий; так как блокирует окисление не всех жирных кислот.
Экспериментально была подтверждена гипотеза о том, что можно, тормозя транспорт жирных кислот и, следовательно, их окисление; адаптировать клетки сердечной мышцы и мозга к кислородной недостаточности. Было показано, что милдронат уже после 10 дней приема эффективно защищает ишемизированную зону миокарда от гибели как в условиях острой ишемии, так и после восстановления кровообращения, т, е. обладает цитопротективным действием в случав вызванных адреналином и норадреналином поражений миокарда [32, 38, 114,187].
Милдронат эффективен в лечении ишемических состояний: он вызывает в клетках эффект прекондиционирования, стимулируя экспрессию необходимых для окисления Сахаров ферментов и их активность, который уменьшает риск развития инфаркта в условиях ишемизации миокарда [38, 100, 141].
Японскими исследователями было установлено, что милдронат активирует два наиболее важных фермента в цикле аэробного окисления глюкозы, при этом активируется их биосинтез в кардиомиоцитах [104, 108, 115, 133,141].
Роль оксида азота при сердечно-сосудистых заболеваниях
N0 синтезируется в организме человека из аминокислоты аргинина в результате реакции, которая катализируется ферментом N0-синтазой (NOS). Выделяют 2 формы NOS: конституитивная (cNOS) -кальцийзависимая NOS, продуцирующая NO в относительно небольших количествах и индуцибельная (iNOS) - наиболее мощная кальций-независимая, которая продуцирует N0 в большем количестве, чем cNOS. NO считается самым мощным из известных эндогенных вазодилататоров [26, 30, 58, 80, 89, 90, 98, 125, 134, 135, 147 , 150, 152, 199]. Являясь липофильным свободнорадикальным газом, он легко диффундирует в гладкомышечные клетки и стимулирует в них растворимую гуанилатциклазу — важнейший внутриклеточный регуляторный белок. Это приводит к повышению в клетке уровня цГМФ, который активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу, а также Са-АТФ-азу, что приводит к выходу Са из мышечных клеток, расслаблению гладкой мускулатуры и вазодилатации [54, 57, 83, 84,142, 193, 197]. Крупные сосуды синтезируют NO меньше, чем мелкие [57, 58, 153, 171, 182]. Вследствие чего NO регулирует как системное, так и легочное сосудистое сопротивление, артериальное давление.
Известно, что NO оказывает антиатеросклеротическое действие, замедляя образование неоинтимы и утолщение стенок сосудов при гиперхолестеринемии [30, 54, 56, 57, 74, 147, 189]. Доказано, что нарушение функции эндотелия является одним из звеньев атеросклеротического процесса [56, 57, 98, 190]. Результаты исследований подтверждают, что NO является антиатеросклеротическим фактором, предотвращающим пролиферацию гладкомышечных клеток и адгезию тромбоцитов к эндотелию [71, 124, 188]. Роль N0 при ишемических повреждениях миокарда изучалась многими исследователями. Известно, что N0 обладает протективным действием на ишемизированный миокард.
Состоянию системы генерации NO в условиях хронической гипоксии посвящено множество научных работ. Результаты этих исследований порой неоднозначны и противоположны. Так, при оценке влияния гипоксии на продукцию NO разные авторы обнаруживали как увеличение [55] , так и снижение синтеза NO [59, 83], а также отсутствие каких-либо изменений [57, 58]. Причем увеличение синтеза N0 отмечалось чаще при действии кратковременных или умеренных стрессоров. Снижение же продукции NO - при длительных и повреждающих воздействиях [69, 91].
Показано, что цитокин-индуцированная фракция NO участвует в процессах роста интерстиция и фиброза, что, в свою очередь, усиливает отрицательное инотропное действие N0 на миокард и вызывает дилатацию камер сердца [71]. Оксид азота, индуцируемый цитокинами, также оказывает отрицательный хронотропный эффект на кардиомиоциты [62, 71,91, 161]. N0 тормозит агрегацию и адгезию тромбоцитов [27, 30, 54, 91]; ингибирует адгезию нейтрофилов на стенках сосудов [35, 161].
Система синтеза и высвобождения NO эндотелием обладает резервными возможностями. Поэтому первой реакцией на неадекватное повышение сосудистого тонуса становится увеличение продукции NO. Это наблюдается на ранних стадиях ИБС, артериальной гипертензии, атеросклероза, ХСН [54, 55, 58, 68, 88, 103]. Умеренная гиперпродукция N0 может оказать на ткани защитное действие. Так, вазодилатация улучшает тканевую перфузию, ускоряет ингибирование адгезии и агрегации тромбоцитов. При длительном же воздействии гипоксии кардиомиоциты экспрессируют два ranaNOS: eNOS и iNOS [69, 71, 91]. De Belder et al. измерили активность eNOS и iNOS в тканях миокарда правого желудочка больных с дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) и с клиническими признаками ХСН. Были выявлены высокая активность iNOS и низкая активность eNOS. Повреждающие факторы (ишемия, гипоксия, гемо динамическая перегрузка и др.) приводят к истощению и извращению компенсаторной способности эндотелия к вазодилатации, и эндотелий реагирует на них вазоконстрикцией и пролиферацией гладкомышечных клеток [55, 57, 68, 151, 153, 161, 163, 197].
Гиперпродукция N0 обычно обусловлена экспрессией iNOS под действием эндо- и экзотоксинов, медиаторов воспаления, провоспалительных цитокинов, активаторов свободнорадикального окисления [30, 53, 62, 66, 111, 122, 127, 167].
Доказано, что нарушение вазодилатирующей функции эндотелия у лиц с факторами риска ИБС возникает очень рано - еще до развития ангиографии- чески определяемой атеросклеротической бляшки.Ж) играет ключевую защитную роль в ишемическом повреждении миокарда, благодаря своим сосудорасширяющим свойствам [155]. Полученные результаты свидетельствовали о выраженном повышении генерации NO при нарушении как диастолической, так и систолической функции сердца у больных с сердечной недостаточностью [183]. Отмечено, что уровень метаболитов NO в сыворотке крови больных со стенокардией выше у пациентов с патологией липидного профиля и глюкозы, чем у пациентов с нормальными значениями липидного и углеводного обмена [192].
Результаты исследований показали, что физическая нагрузка у больных вызывала снижение концентрации лактата и повышение продукции N0 в крови коронарной вены [176].
Условия, при которых NO меняет свои вазопротекторные свойства на токсические, могут зависеть не только от концентрации N0 в ткани, но и от концентрации различных соединений, реагирующих с N0 [27, 30, 105]. В результате в клетках, подвергнутых действию больших количеств N0, нарушается энергетический обмен и синтез белков [27, 30, 172], увеличивается проницаемость сосудов, способствуя отеку тканей, что приводит к стойкой генерализованной вазодилатации и снижению АД [30, 31, 54, 80,129, 173]. Эти явления описаны при различных видах шока, в том числе и кардиогенного [54, 55, 57, 58, 118, 173].
Гипопродукция NO описана при гипоксии и ишемии, нарушениях углеводного обмена [30,54, 55, 57, 131, 147]. Она приводит к ускорению свертываемости крови, повышению тонуса сосудов, снижению иммунитета, способствует развитию атеросклероза, ИБС, ХСН, артериальной гипертензии и других заболеваний [30, 55, 57, 149, 151, 152, 172].
Литературные данные относительно содержания нитритов/нитратов в периферическом кровеносном русле больных ХСН также неоднозначны и противоречивы [55, 57,58, 69,71,91]. ХСН, вызывая тканевую гипоксию, приводит к активации иммунной системы и развитию воспалительной реакции [64, 91, 131, 132]. Больные с прогрессирующей ХСН имеют повышенный уровень противовоспалительных цитокинов [71, 91, 118, 180] 151],которые стимулируют образование NO в кардиомиоцитах путем индукции iNOS [69,71, 91, 159]. Эффекты N0 могут играть важную роль при поражениях сердца, характеризующихся нарушением функции диастолы. Считается доказанным улучшение диастолической функции ЛЖ под действием NO-зависимых механизмов [71, 142, 174].
Специальные методы исследования
Выбор методов исследования диктовался поставленной целью и задачами собственных исследований.
Метод определения нитратов/нитритов в крови За основу нами был взят фотометрический метод определения нитратов в биосредах организма (по методике Емченко Н.Л. и соавт., 1994г.). Нитраты определяют в виде нитритов после восстановления их губчатым кадмием. Для этой цели мы использовали стеклянную бюретку диаметром 10—12 мм, обрезанную на высоте 10 см от крана. Высота столба губчатого кадмия в бюретке составляет 7-8 см. Губчатый кадмий получают цементацией на цинковых палочках по способу, описанному для метода, взятого за основу. Фотометрическое определение нитритов проводят по реакции Грисса, используя в качестве цветообразующих реагентов сульфаниламид (белый стрептоцид) и М нафтилэтилендиаминдигдрохлорид (НЭДА). Осаждение белков проводят сульфатом цинка и феррицианидом железа, осадок центрифугируют. Этот прием позволяет получить прозрачные фильтраты и избежать существенных потерь определяемого вещества. Ход определения. В центрифужные пробирки вместимостью 10мл помещают 0,25—1.50 мл 50% раствора сульфата цинка. 0,25—1,50 мл 17% раствора феррицианида железа. 1—5 мл анализируемой пробы (пипетку для отбора крови предварительно смачивают раствором цитрата натрия). Зачем прибавляют 0,5 — 2 мл аммиачно-хлоридного буфера (рН 9,6 ±0.05) и от 1 до 8 мл дистиллированной воды (для анализа грудного молока ее нагревают до 70—80 С).
Общий объем смеси должен составлять 10 мл. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 об/мин. Параллельно проводят холостой опыт. Отбирают аликвоту центрифугата объемом 5 мл в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2,5 мл аммиачно-хлоридного буфера, 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают и пропускают через колонку с губчатым кадмием вначале холостую пробу, зачем испытуемые. Перед пропусканием каждой из проб колонку промывают последовательно 5 мл 1 н. НС1, 50 мл дистиллированной воды и 25 мл аммиачно-хлоридного буфера, разбавленного в соотношении 1:9. Элюат собирают в ту же мерную колбу, колонку промывают дистиллированной водой, не доводя объем раствора в колбе до метки примерно па 10 мл. Затем в колбу прибавляют 5 мл 0.25% раствора стрептоцида. 1 мл НС1 (1:2) и через 5 мим—I мл 0.1 % раствора I НЭДА. Раствор доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и оставляют на 10 мин. По истечении этого времени пробы фотометрируют па фотоэлектроколориметре (ФЭК-56, КФК-2 и т. п.) при длине волны 540 им (зеленый светофильтр), в кювете с длиной оптического пути 5 ем против холостой пробы. При анализе слюны, содержащей заметные количества нитритов, фотометрирование производят против контрольного раствора, который готовим аналогично испытуемым, но не пропускают через кадмиевую колонку. Содержание нитратов в «холостой» пробе в этом случае определяют путем вычитания показаний ее оптической плотности из показаний оптической плотности испытуемых проб.
Концентрацию нитратов определяют но градуировочному графику. Для его построения и мерные колбы вместимостью 50 мл вносят 0.25, 0,5, 1, 2.5 и 5 мл раствора нитрата калия с концентрацией нитрат-иона, равной 10 мкг/мл, что соответствует 0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1 мкг/мл, добавляют по 10 мл дистиллированной воды и по 5 мл аммиачно-хлоридного буфера и элюируют через кадмиевую колонку. Цветную реакцию и фотометрирование проводят, как описано выше. Оптическую плотность измеряют против пулевого раствора.
Содержание нитратов (X, мг/л) в анализируемых образцах биосред рассчитывают по формуле:
х _ С, х Ух х У2
где Сі - концентрация нитрат-ионов в фотометрируемом растворе, найденная по градуировочному графику (в мкг/мл): Vj - общий объем безбелкового экстракта (в мл); 2 - обший объем фотометрируемого раствора (в мл): Уз - объем образца, взятый для анализа (в мл); V4 -объем безбелкового экстракта, взятый для дальнейшего анализа (в мл).
Установлены метрологические характеристики методики: предел обнаружения нитратов, коэффициент вариации, характеризующий ее воспроизводимость при п=10. Правильность определения оценивали по методу добавок, одна из которых была близка к фоновому содержанию этих веществ в соответствующих биосубстратах, а вторая была вдвое большей.
Изучение липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов проводилось с помощью метода тонкослойной хроматографии. Выделение мембран эритроцитов и экстракция липидов осуществлялась из проб венозной крови, взятых у больных натощак в пробирку, содержащую в качестве антикоагулянта оксалат натрия.
Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием при 1500 обЛмин. в течение 15 минут. Плазмо-лейкоцитарный слой отделяли для последующих исследований фракций в спектре липидов (Л) и липопротеидов (ЛП), а эритроциты осторожно, во избежание механического гемолиза, трижды обмывали изотоническим раствором хлорида натрия; после чего и производилось экстракция липидов из мембран эритроцитов по классическому методу Фолча с использованием общепринятой смеси растворителей (хлороформ: метанол в соотношение :1). Полученный экстракт выпаривался с помощью вакуумного испарителя; сухой остаток ;затем растворялся в хлороформе и в дальнейшем использовался для тонкослойной хроматографии (ТСХ) и определения (качественного и количественного)спектра липидов.
Разделение липидов мембран эритроцитов осуществлялось на микротонком слое платин «Силуфол UV- 254» (ЧССР) в системе растворителей, состоящей из гексана: диэтилового эфира: ледяной уксусной кислоты в соотношении 80:20:2.
Для идентификации путем окраски липидных фракций после их разделения, пластины опрыскивались 5% раствором фосфорномолибденовой кислоты в этиловом спирте, с последующим нагреванием в термостате при 100 градусах до четкого проявления пятен. Затем проводилось денситометрия отдельных фракций липидов на аппарате фирмы «Карл-Цейс» J.R.65 (Иена ГДР). Расчет количества липидов велся по калибровочной кривой, построенной после денситографии стандартных растворов холестерола и триацилглицеринов. Изучение состава фосфолипидов эритроцитов. Исследование проводили по методике, аналогичной описанного выше определения липидов в эритроцитарных мембранах. Единственное отличие состояло в том, что в качестве системы растворителей сухого экстракта использовали систему хлороформ:метанол:вода в соотношении 65:25:4.
Особенности генерации метаболитов оксида азота в крови больных стабильной стенокардией в зависимости от тяжести заболевания
Под наблюдением находилось 100 больных стенокардией II и III ФК, в крови которых были определены метаболиты оксида азота.
При поступлении в стационар у больных стенокардией как основной группы (А), так и группы сравнения (В) определялись колебания уровня метаболитов N0 в плазме крови, соответственно от 1,3 ± 0,45 до 3,7 ± 0,7 и от 1,24 ± 0,23 до 7,5 ±1,9 мг/л. Средние значения уровня метаболитов NO в обеих группах статистически значимо не различались (р 0,05) (рис. 1). Поэтому в каждой из них были выделены 3 подгруппы больных в зависимости от исходного уровня нитритов/нитратов в плазме крови.
В первую подгруппу вошли пациенты с высоким уровнем метаболитов NO при поступлении: в группе А уровень их составил 3,7 ± 0,7, в группе В - 4,5 ± 1,9 мг/л. Таким образом, у пациентов 1 подгруппы (22%) в плазме крови определялся статистически значимо более высокий уровень метаболитов NO (р 0,05) в сравнении с контрольной группой, в третьей подгруппе (32%) - более низкий уровень в сравнении с группой контроля (р 0,01). Во второй подгруппе уровень метаболитов NO в плазме крови соответствовал контрольной группе больных (46%) При проведении сравнительного анализа уровня метаболитов NO в плазме крови больных ИБС трех подгрупп пациентов выявлено, что третьей подгруппе соответствовали больные стенокардией ФК III с наиболее низким уровнем метаболитов N0 в плазме крови. Эта группа больных имела более длительный анамнез ИБС, признаки хронической сердечной недостаточности П-Ш ФК (по NYHA), тахикардию, низкую толерантность к физической нагрузке по данным ВЭМ и теста 6-минутной ходьбы. Первую подгруппу пациентов составили больные тенокардией II и III ФК с признаками ХСН ФКІ-ІІ с наиболее высоким уровнем метаболитов N0 в плазме крови; а больные стенокардией II ФК с ХСН 0-1 составили вторую подгруппу. Причем была установлена обратная корреляционная связь между уровнем нитратов/нитритов в плазме крови и толерантностью к физической нагрузке по данным ВЭМ и теста 6-минутной ходьбы(г=-0,54, р 0,05 ) и прямая - с показателями липидного спектра крови у пациентов 1-й подгруппы (г=0,47, р 0,05) и, напротив, прямая корреляционная связь между уровнем метаболитов N0 и толерантностью к физической нагрузке (г=0,78, р 0,05) и обратная - с показателями липидного спектра крови и выраженностью ХСН у больных ИБС третьей подгруппы (г=-0,54 и г=-0,71, р 0,05).
Таким образом, сравнительный анализ показал наличие клинических различий у больных стенокардией в зависимости от уровня метаболитов NO в плазме крови. Уровень нитратов/нитритов, соответствующий контрольной группе, наблюдался у пациентов со стенокардией II ФК. При возрастании ФК стенокардии сначала произошла мобилизация компенсаторных возможностей в виде статистически значимого возрастания уровня метаболитов N0 в плазме крови. У больных же стенокардией ФКІІІ, с признаками ХСН ФКІІ-ІП, напротив, содержание нитратов/нитритов в плазме крови было значимо ниже, что, вероятно, свидетельствует об исчерпании компенсаторных резервов. После лечения наблюдалось (от р 0,05 до 0,01) увеличение содержания метаболитов NO в плазме крови у пациентов третьей подгруппы, причем у больных основной группы - их нормализация. У пациентов как 1-ой , так и 2-й подгруппы статистически значимых изменений данного показателя на фоне проводимой терапии выявлено не было (табл. 12).
Таким образом, назначение миокардиального цитопротектора милдронат в комплексную терапию больных стенокардией с исходно низким уровнем метаболитов N0 в плазме крови способствовал нормализации его уровня на фоне лечения, что коррелировало с более выраженным клиническим эффектом, регрессом признаков ХСН под влиянием проводимой терапии, что, по-видимому, отражает вазодилатирующий эффект оксида азота.
