Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 . Физиология и патофизиология эндотелия 11
1.2. Ангиотензиновые рецепторы и сигнальная трансдукция 16
1.3. Молекулы клеточной адгезии и межклеточная коммуникация 23
1.4. Эффективность этиопатогенетической терапии острого инфаркта миокарда на современном этапе 27
Глава 2. Методы исследования 37
2.1. Идентификация эндотелиальной дисфункции 41
2.1.1. Выделение нейтрофилов из периферической венозной крови 41
2.1.2. Определение активности АДФ-рибозилциклазы 42
2.1.3. Детекция CD38 нанейтрофилах периферической крови 43
2.1.4. Выделение и идентификация десквамированных эндотелиоцитов 44
2.2. Статистическая обработка результатов 45
Глава 3. Результаты собственных исследований 46
3.1. Клиническая характеристика больных на госпитальном этапе лечения 46
3.2. Экспрессия и активность СВ38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом 57
3.3. Десквамированные эндотелиоциты у больных острым инфарктом миокарда 61
3.4. Корреляционные взаимосвязи в оценке механизмов развития и прогноза эндотелиальной дисфункции 65
3.5. Проспективное наблюдение за больными острым инфарктом миокарда через 1 год после стационарного лечения 66
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 69
Выводы 80
Практические рекомендации 81
Список литературы
- Физиология и патофизиология эндотелия
- Ангиотензиновые рецепторы и сигнальная трансдукция
- Идентификация эндотелиальной дисфункции
- Клиническая характеристика больных на госпитальном этапе лечения
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из основных медико-социальных проблем Российской Федерации является низкая продолжительность жизни: мужчин - 58,9 года, а женщин- 72,4 года. Такие показатели связаны с высоким уровнем смертности, в первую очередь, от неинфекционных заболеваний. Лидирующую позицию занимают болезни системы кровообращения- 56,1%, из них летальность от ишемической болезни сердца, в том числе инфаркта миокарда, составляет 26,7 % , а 20,4% - болезни сосудов головного мозга, в том числе инсульты. В России ежегодно острое коронарное событие развивается у 3-5 человек на 1000 населения. Артериальная гипертония является ведущей причиной сердечно-сосудистых расстройств.
До сих пор остаются до конца не изученными механизмы повреждения клеток при острой ишемии миокарда. В последнее время уделяется много внимания оценке роли эндотелиальной дисфункции и апоптоза клеток (эндотелиоцитов, гладкомышечных клеток сосудов, клеток тканей ) в развитии гипертонической болезни и ее осложненных форм. Следовательно, определение маркеров эндотелиальной дисфункции может дать представление о степени повреждения органа, а также служить предпосылкой к выбору нужного метода лечения [Preston R.A. et al., 2003].
Прогрессирование эндотелиальной дисфункции, происходящее в условиях гипоксии, обусловленное изменением эластичности сосудистой стенки при гипертонической болезни и остром инфаркте миокарда, сопровождается повышением концентрации маркеров дисфункции и повреждения эндотелия. Следует отметить, что до настоящего времени не определена связь между содержанием маркеров эндотелиальной дисфункции в периферической крови и степенью тяжести состояния больных острым инфарктом миокарда на фоне гипертонической болезни.
До сих пор не установлено, что является предопределяющим фактором прогрессирования эндотелиальной дисфункции и обусловленных ею осложнений.
Важным этапом в развитии эндотелиальной дисфункции является изменение физико-химических свойств мембран клеток, за счет экспрессии рецепторов клеточной активации и адгезии, характер которой остается не изученной. Однако остается не уточненной роль неклассических молекул клеточной адгезии в формировании молекулярно-клеточных механизмов нарушения функции эндотелия.
Молекула CD38 — это бифункциональный рецептор-фермент с молекулярной массой 46 кД, участвующий в передаче внутриклеточной сигнальной информации, а так же в межклеточной коммуникации в клетках различной природы [Lee, Н.С et al., 2000]. Основным продуктом каталитической активности CD38 является циклическая АДФ-рибоза, выполняющая функцию мобилизатора кальция из внутриклеточного депо в цитозоль. Спектр экспрессии CD38 достаточно широк и включает в себя клетки крови, центральной нервной системы, поджелудочной железы, кардиомиоциты [Ferrero Е. et al., 2000; Flora A. et al., 2004; Okamoto H. et al., 2002]. Показано, что взаимодействие CD38, экспрессированного на клетках лимфоцитарно-лейкоцитарного звена, и CD31, экспрессированного на эндотелиоцитах, представляет собой один из механизмов роллинга лейкоцитов, сопровождающего физиологические и патологические события на поверхности эндотелия [Franco, L. et al., 1998]. Последние годы появились данные о роли СБ38/АДФ-рибозилциклазы в регуляции функциональной активности ряда клеток, в том числе нейтрофилов, однако данные об особенностях экспрессии и проявления активности CD38 в этих клетках при остром инфаркте миокарда отсутствуют.
До настоящего времени не установлены отличия по воздействию на уровень маркеров эндотелиальной дисфункции многих фармакологических препаратов, в том числе тромболитических препаратов, ингибиторов АПФ.
С учетом ведущей роли эндотелиальной дисфункции в развитии острого инфаркта миокарда на фоне прогрессирования гипертонической болезни, перспективным является изучение динамики содержания маркеров эндотелиальной дисфункции у больных ОИМ, а также возможность фармакологической коррекции степени дисфункции эндотелия при проведении системного тромболизиса.
Цель исследования. Изучить особенности экспрессии и активности СБ38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда при использовании тромболитических препаратов и ингибиторов АПФ для расширения патогенетического обоснования их применения.
Задачи исследования.
1. Определить характер экспрессии CD38 и активность АДФ-
рибозилциклазы в нейтрофилах периферической крови у больных острым
инфарктом миокарда на первые и четырнадцатые сутки развития заболевания.
2. Оценить вклад экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической
крови в их повреждающее действие на эндотелий у больных инфарктом
миокарда.
Оценить особенности клинического течения острого инфаркта миокарда в зависимости от уровня экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови.
Оценить эффективность фармакологической коррекции острого инфаркта миокарда в зависимости от уровня экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови.
Научная новизна.
Впервые выявлена зависимость между уровнем эндотелиальной дисфункции и характером экспрессии и активности СОЭ8/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови, что позволяет рассматривать CD38 в качестве маркера эндотелиальной дисфункции.
Впервые изучено влияние ингибитора АПФ (эналаприла малеата), и тромболитика (стрептокиназы) на уровень экспрессии и активности СВ38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда.
Впервые показана зависимость между выраженностью изменения экспрессии и активности СВ38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови и степенью тяжести больных острым инфарктом миокарда.
Практическая значимость работы.
Изменение уровня экспрессии и активности CD3 8/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов является адекватным показателем интенсивности патологического процесса (эндотелиальной дисфункции) и эффективности проводимой терапии.
Уровень экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови в первые сутки острого инфаркта миокарда коррелирует со степенью тяжести состояния пациентов на четырнадцатые сутки развития заболевания.
Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на коррекцию эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда, и значит, каждый терапевтический подход, целесообразен в своем применении.
Дано новое патогенетическое обоснование применения системного тромболизиса у больных острым инфарктом миокарда
Положения, выносимые на защиту.
В периферической крови больных острым инфарктом миокарда на первые сутки развития заболевания определяется высокое содержание клеточных маркеров эндотелиальной дисфункции. Высокие корреляционные отношения между уровнем экспрессии CD38 и десквамированными эндотелиоцитами позволяют признать их в качестве надежных маркеров дисфункции эндотелия.
Уровень экспрессии и активности СВ38/АДФ-рибозилциклазы на нейтрофилах периферической крови характеризуют степень тяжести состояния пациентов с острым инфарктом миокарда.
Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на восстановление функции эндотелия у больных острым инфарктом миокарда.
Внедрение результатов исследования.
Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, используются при чтении лекций и проведении практических занятий и семинаров у студентов ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, врачей-курсантов института последипломного образования.
Личный вклад соискателя
Диссертантом выполнено лично: определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения; составление протоколов исследований; набор экспериментального материала; самостоятельный общеклинический осмотр пациентов и забор материала для анализа; проведение иммуноцитохимических исследований с использованием фазово-
контрастной и люминесцентной микроскопии; флуориметрических исследований АДФ-рибозилциклазной активности CD38 нейтрофилов периферической крови; статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов; написание автореферата и текста диссертации.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международной научно-практической конференции по биомедицине (Украина, Херсон, 2007), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины-2008» (Санкт-Петербург, 2008), на научных семинарах НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, на заседании кафедры биохимии с курсами медицинской, фармакологической и токсикологической химии (2008), на заседании проблемной комиссии по внутренним болезням и кардиологии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ (2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работы, из них 3 в издании, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент РФ на изобретение по заявке № 2331819 от 20.08.2008 г., приоритет от 09.03.07 г. «Способ диагностики степени эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом».
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 95 страницах текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 2 фотографии, 7 рисунков, 20 таблиц. Библиографический список включает 130 источника, из которых 51 отечественных и 79 иностранных авторов.
Физиология и патофизиология эндотелия
Последние годы ознаменовались интенсивным развитием фундаментальных и клинических исследований, посвященных изучению роли сосудистого эндотелия в генезе сердечно-сосудистых заболеваний. В 1998 году, после получения Нобелевской премии в области медицины Феридом Мурадом, Робертом Фуршготом и Луисом Игнарро, была создана теоретическая основа для нового направления медицинской науки - изучение дисфункции эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и поиск способов ее эффективной коррекции.
Эндотелий - это один из самых больших «органов» человека, представленный монослоем клеток, выстилающий внутреннюю поверхность сосудов, с многочисленными регуляторными функциями. Общая масса эндотелия у человека колеблется в пределах 1600-1900 г, что составляет 1014 клеток сосудистого дерева.
Эндотелий сосудов контролирует процесс пролиферации гладкомышечных клеток, обеспечивает адекватную вазодилатацию, угнетает активацию и адгезию тромбоцитов и препятствует воспалительным процессам [Агеев Ф.Т., 2004].
Эти эффекты реализуются с участием факторов дилатации: фактор гиперплазии эндотелия, простациклин 12, монооксид азота, натрийуретический пептид С типа, адреномедуллин, и факторами констрикции: эндотелии, тромбоксан А2, простагландин F2, эндопероксиды и другие [Курбанов Р.Д. и др., 2003].
В 1980 г. Furchgott и Zawadski впервые показали, что только при наличии эндотелиальных клеток увеличение дозы ацетилхолина вызывало релаксацию сосуда, подвергшегося предварительной констрикции под влиянием норадреналина [Furchgott R.F. et al., 1980]. При отсутствии эндотелиальных клеток в ответ на ацетилхолин наблюдалась либо вазоконстрикция, либо отсутствие релаксации. Это привело к открытию эндотелийрелаксирующего фактора, который позднее был идентифицирован как NO [Davis M.R. et al., 2003]. Впоследствии было установлено, что в нормальных физиологических условиях NO служит не только мощным вазодилататором, но и тормозит процессы ремоделирования сосудистой стенки, предотвращает адгезию и агрегацию тромбоцитов, адгезию моноцитов, защищая, таким образом, сосудистую стенку от патологической перестройки с последующим развитием атеросклероза и атеротромбоза [Ignarro L.J. et al., 2002].
При недостаточности эндогенной продукции NO, нарушается адекватная эластичность сосудистой стенки в ответ на изменяющиеся параметры артериального давления, повышается активность свертывающей системы крови в результате патологической секреции эндотелиоцитами прокоагулянтных факторов в сочетании с дисбалансом по отношению к факторам фибринолиза [Инжутова А.И. и др., 2006; Белоусов Ю.Б., 2001]. Сформировавшееся нарушение эластичности сосудистой стенки приводит к уменьшению кровоснабжения органа, возникают хроническая гипоксия и окислительный стресс. Степень воздействия хронического окислительного стресса на клетки зависит от резервных возможностей самой клетки, от генетической обусловленности такого ответа.
При дефиците NO происходит не только ослабление вазодилатации, но и запускаются процессы ремоделирования сосудистой стенки, адгезии и агрегации тромбоцитов и моноцитов, т.е. инициируются процессы атеросклероза и атеротромбоза. Таким образом, дефицит NO становится проатерогенным фактором. В настоящее время эндотелиальная дисфункция рассматривается и как ранняя фаза развития атеросклероза [Schiffrin E.L. et al., 2001]. Показано, что у больных артериальной гипертонией существенно снижена продукция NO. Однако уменьшение высвобождения NO - не единственный путь, с помощью которого эндотелиальная дисфункция участвует в формировании артериальной гипертонии, она может развиться и вследствие повышенной деградации NO при нормальной его выработке в эндотелиоцитах [Lerman A. et al., 2005] а также в связи с первичным дефектом L-аргининового пути синтеза NO [Giannarelli С. et al., 2007].
Существует множество подтверждений того, что эндотелиальная дисфункция играет важную роль в развитии осложнений гипертонической болезни. Так, показано, что дисфункция эндотелия может способствовать развитию атеросклероза путем повышения агрегационных способностей моноцитов и тромбоцитов, модуляции гиперкоагуляции и нарушения окисления липопротеидов низкой плотности [Widlansky М. Е. et al., 2003].
В уникальном исследовании, проведенном в Германии, было установлено, что дисфункция эндотелия коронарных сосудов, которая оценивалась на основании прямого ацетилхолинового теста, являлась предиктором прогрессирования заболевания и развития осложнений у 147 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС). При этом прогностическая значимость эндотелиальной дисфункции коронарных сосудов не зависела от традиционных факторов риска, в том числе артериальной гипертонии [Volker Schachinger M.D. et al., 2000].
Артериальная гипертония значительно ускоряет развитие атеросклероза коронарных артерий. При гипертонической болезни происходит усиление процессов перекисного окисления липидов с образованием и накоплением в крови производных полиеновых жирных кислот, обладающих биологической активностью, а также токсичных диальдегидов. Развитие и стабилизация патологического процесса сопровождается образованием избыточного уровня катехоламинов, которые разрушаются при участии моноаминоксидазной системы с образованием диальдегидов и перекиси водорода [Паранич А.В. и др., 2000]. При этом стимулируется перекисное окисление липидов. Липиды теряют свои антиоксидантные свойства [Hemler М.Е. et al., 1979; Herbaczynska-Cedro К., Gordon-Majszak W., 1986; Salmon J.A., 1987], происходит нарушение структурной целостности липидного бислоя мембран клеток и функционирования катионных каналов, что приводит к повышению концентрации ионов Са2+ внутри клетки. Ионы Са2+ стимулируют инкорпорированные фосфолипазы, которые отщепляют от фосфолипидов жирные кислоты, в первую очередь полиненасыщенные, что приводит к повышению уровня арахидоновой и линоленовой кислот в тканях и крови больных гипертонической болезнью [Rosenthal M.D. et al., 1988]. Большое количество субстратов окисления при понижении функции антиоксидантной системы приводит к интенсификации перекисного окисления липидов, а также к образованию активных эйкозаноидов [Chock S.P., Schmauder-Chock Е.А., 1988]. Этот процесс может автокаталитически ускоряться. В результате, у больных гипертонической болезнью нарастает концентрация вазоактивных веществ, обладающих вазопрессорными эффектами; при этом и сами продукты перекисного окисления липидов, находящиеся в кровяном русле, обладают вазоконстрикторными свойствами. Кроме того, клетки эндотелия сосудов могут синтезировать тромбоцитактивирующий фактор [Rosenthal M.D. et al., 1988], который имеет метаболическое происхождение из арахидоновой кислоты, освобождающейся из фосфатидилхолина мембран под действием фосфолипазы А2. Этот процесс запускается агонистами рецепторов (гистамин, брадикинин, тромбин) и приводит к преобладанию вазоспастических реакций [Паранич А.В. и др., 2000].
Ангиотензиновые рецепторы и сигнальная трансдукция
Во многом механизмы регуляции функции эндотелия реализуются через активацию ренин-ангиотензиновой системы (РААС). [Агеев Ф.Т., 2000]. Ангиотензины - пептиды, образующиеся в организме из ангиотензиногена, представляющего собой гликопротеид, альфа2-глобулин плазмы крови, синтезирующийся в печени. Под воздействием ренина (фермент, образующийся в юкстагломерулярном аппарате почек) полипептид ангиотензиноген, не обладающий прессорной активностью, гидролизуется, образуя ангиотензин I - биологически неактивный декапептид, легко подвергающийся дальнейшим преобразованиям.
Под действием ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), образующегося в легких, ангиотензин Т превращается в октапептид -ангиотензин II, являющийся высокоактивным эндогенным прессорным соединением (рис.1). Ангиотензин II - основной эффекторный пептид РААС. Он оказывает сильное сосудосуживающее действие, повышает общее периферическое сопротивление сосудов, вызывает быстрое повышение артериального давления.
Кроме того, он стимулирует секрецию альдостерона, а в больших концентрациях-увеличивает секрецию антидиуретического гормона, приводящего к повышению реабсорбции натрия и воды и вызывающего симпатическую активацию.
Действие ангиотензина II через активацию плазменной и тканевой РАС (ренин-ангиотензиновая система). Повышенная активность тканевых РААС обусловливает долговременные эффекты ангиотензина II, которые проявляются структурно-функциональными изменениями в органах-мишенях и приводят к развитию таких патологических процессов, как гипертрофия миокарда, миофиброз, атеросклеротическое поражение сосудов мозга, поражение почек. В настоящее время показано, что у человека, помимо АПФ-зависимого пути преобразования ангиотензина І в ангиотензин II, существуют альтернативные пути- с участием химаз, катепсина G, тонина и других сериновых протеаз. Химазы, или химотрипсиноподобные протеазы, представляют собой гликопротеины с молекулярной массой около 30000. Химазы имеют высокую специфичность по отношению к ангиотензину І. В разных органах и тканях преобладает либо АПФ-зависимый, либо альтернативные пути образования ангиотензина И. Так, в ткани миокарда человека обнаружена кардиальная серинпротеаза. При этом наибольшее количество этого фермента содержится в миокарде левого желудочка, где на долю химазного пути приходится более 80%. Химазозависимое образование ангиотензина II превалирует в миокардиальном интерстиции, адвентиции и медии сосудов, тогда как АПФ-зависимое в плазме крови. Ангиотензин II может формироваться и непосредственно из ангиотензиногена путем реакций, катализируемых тканевым активатором плазминогена, тонином, катепсином G.
Ангиотензин II ведет к активации тромбоцитарного звена гемостаза и свертывающей системы, подавлению фибринолиза, а также активации и адгезии лейкоцитов. Последний фактор обеспечивает увеличение сосудистой проницаемости, продукцию хемо- и цитокинов, пептидных ростовых и антиростовых факторов, экспрессию лейкоцитарных и тромбоцитарных адгезионных молекул [Задионченко B.C. и др., 2003; Шляхто Е.В. и др., 2004; Dejana Е., 2004; Инжутова А.И., 2007]. Перечисленные изменения приводят к увеличению раневого процесса на уровне сосудистой стенки и, как следствие, атерогенезу [Агеев Ф.Т., 2000; Лутай М.И., 2002; Кириченко Л.Л. и др., 2004]. Другая важнейшая мишень ангиотензина II вследствие эндотелиальной дисфункции - гладкомышечные клетки сосудов. Взаимодействие между механическими, циркулирующими и тканевыми факторами регулирует гомеостаз гладкомышечных клеток сосудов в физиологических условиях. При артериальной гипертонии изменяется соотношение перечисленных факторов. Поэтому они могут выступать в роли как индукторов, так и ингибиторов гипертрофии и гиперплазии гладкомышечных клеток сосудов. Катехоламины, обладая трофической функцией, стимулируют гипертрофию гладкомышечных клеток сосудов [Шляхто Е.В., 2002; Моисеева О.М., 2002]. В результате эндотелиальной дисфункции, гиперплазии гладкомышечных клеток сосудов формируется стойкое снижение эластичности сосудистой стенки, что является причиной хронической ишемии органов. Тканевая гипоксия приводит к избытку свободных радикалов и продукции цитокинов, которые по механизму порочного круга еще более нарушают релаксацию периферических сосудов и способствуют формированию хронического окислительного стресса [Багмет А.Д., 2002; Беленков Ю.Н. и др., 2002].
Физиологические эффекты ангиотензина II, как и других биологически активных ангиотензинов, реализуются на клеточном уровне через специфические ангиотензиновые рецепторы (AT). К настоящему времени установлено существование нескольких подтипов ангиотензиновых рецепторов: АТЬ АТ2, AT 3 и АТ4.
У человека идентифицированы и наиболее полно изучены два подтипа мембраносвязанных, сопряженных с G-белком рецепторов ангиотензина II -подтипы AT! и АТ2. АТгрецепторы локализуются в различных органах и тканях, преимущественно в гладкой мускулатуре сосудов, сердце, печени, коре надпочечников, почках, легких, в некоторых областях мозга. При артериальной гипертензии на фоне чрезмерной активации РААС опосредуемые AT]-рецепторами эффекты ангиотензина II прямо или косвенно способствуют повышению артериального давления. Кроме того, стимуляция этих рецепторов сопровождается повреждающим действием ангиотензина II на сердечнососудистую систему, включая развитие гипертрофии миокарда, утолщение стенок артерий [Беркович, О.А. и др.,2003].
Большое количество АТ2-рецепторов обнаружено в тканях плода. В постнатальном периоде количество АТ2-рецепторов в тканях человека уменьшается. Экспериментальные исследования, в частности у мышей, у которых был заблокирован ген, кодирующий АТ2-рецепторы, позволяют предположить их участие в процессах роста и созревания, включая пролиферацию и дифференцировку клеток, развитие эмбриональных тканей, а также формирование исследовательского поведения. АТ2-рецепторы найдены в сердце, сосудах, надпочечниках, почках, некоторых областях мозга, репродуктивных органах, атрезированных фолликулах яичников, а также в ранах кожи. Показано, что количество АТ2-рецепторов может увеличиваться при повреждении тканей и сосудистой стенки, инфаркте миокарда, сердечной недостаточности [Booz G.W., 2004].
Исследования последних лет показывают, что кардиоваскулярные эффекты ангиотензина II, опосредованные АТ2-рецепторами, противоположны эффектам, обусловленным возбуждением AT і-рецепторов, и являются относительно слабо выраженными. Стимуляция АТ2-рецепторов сопровождается вазодилатацией, ингибированием клеточного роста, в том числе, подавлением пролиферации клеток (эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудистой стенки, фибробластов), торможением гипертрофии кардиомиоцитов [Berry С. et al., 2001; Johren О. et al., 2004].
Идентификация эндотелиальной дисфункции
У всех обследуемых пациентов производился забор периферической венозной крови в объеме 5 мл на первые и четырнадцатые сутки развития острого инфаркта миокарда в период госпитализации на маркеры эндотелиальной дисфункции. Дизайн исследования представлен на рис.3. Выделение нейтрофилов и микроскопирование осуществляли по следующей методике. Забор венозной крови в объеме 5 миллилитров производили толстой иглой из локтевой вены пациента в пластмассовую пробирку с ризами, содержащую 0,15 мл гепарина; затем тщательно перемешивали кровь с гепарином в пробирке. Допускалось хранение пробирки с кровью в холодильнике при +5С в течение 3-4 часов. В условиях лаборатории производили повторное ресуспензирование крови в пробирке.
Для выделения нейтрофильной фракции периферической крови использовали градиент плотности фиколл-верографин [Хейфиц Л.Б. и др., 1973]. Для этого в отдельную пластмассовую пробирку вносили 2 миллилитра фиколл-верографина (Pharmacia Chemical, Uppsala, Sweden) плотности верхнего и нижнего градиентов составляли 1,142 и 1,062 г/см , соответственно. После чего по стенке пробирки осторожно, медленно дозатором на фиколл-верографин наслаивали 5 миллилитров ресуспензированной крови и центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 минут со скоростью 2500 оборотов/мин.
После центрифугирования на границе раздела фаз пастеровской пипеткой собирали нейтрофильное кольцо в отдельную пластмассовую пробирку, а на предварительно обезжиренные два предметных стекла наносили 50мкл клеток.
В дальнейшем полученная суспензия клеток использовалась для определения активности АДФ-рибозилциклазы, а мазки клеток - для определения экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови.
Активность АДФ-рибозилциклазы фиксировалась методом флу ори метрического анализа, основанного на измерении флуоресценции продукта каталитической конверсии никотинамидгуаниндинуклеотида по стандартному протоколу. Приготовленная суспензия нейтрофилов периферической крови помещалась в две микропробирки по 500 мкл. Суспензию клеток из первой микропробирки использовали для определения белка методом Лоури [Graeff R.M. et al., 1994], а из второй - для определения АДФ-рибозилциклазной активности, путем добавления 15 мкл НГД к полученному объему белка в условиях темной комнаты. Метод основан на измерении конверсии НГД во флуоресцентный продукт — циклическую ГДФ-рибозу. Ферментативный анализ проводился с использованием спектрофлуориметра (SOLAR SM2203). Образцы суспензии клеток помещались в спектрофлоуриметр в режиме кинетики при возбуждении А,=300 нм (Ех) и эмиссии А,=410 нм (Em). Фиксировались не только максимальные и минимальные значения активности фермента, но и время в минутах, соответствующее этой активности. Единицы измерения: ед/мин/мкг белка.
Детекция CD38 на нейтрофилах осуществлялась с помощью иммуноцитохимического метода. Нейтрофилы выделялись из периферической крови по методике, описанной ранее. Процедура выполнена на препаратах нейтрофилов, нанесенных на предварительно обезжиренное предметное стекло в количестве 0,5-1,0 х106 /мл, с предварительной фиксацией в парах формалина и охлажденной смеси этанола и уксусной кислоты. Затем к клеточному мазку добавляли 15 мкл первичных антител (anti-CD38, Caltag, США) титр 1:10. Инкубировали 1 час при +37С0. После инкубации отмывали нейтрофилы PBS (150 мкл) дважды, удаляли супернатант. К осадку клеток 50 мкл вторичных FITC-меченых антител (Caltag, США) в исходном разведении 1:100 в PBS с 1% овечьей сывороткой в условиях темной комнаты. Затем инкубировали клетки минут при +37С в темноте. После инкубации отмывали клетки PBS дважды. Визуализация осуществлялась методом люминесцентной микроскопии, с помощью микроскопа «ЛЮМАМ», увеличение х 450. Расчет проводился по нескольким полям зрения на 100 нейтрофилов. В поле зрения микроскопа регистрировались нейтрофилы — сегменто- и палочкоядерные клетки округлой формы размером 10 — 15 микрометров. Потом дифференцировались следующие виды нейтрофилов: 1) CD38 - иммунопозитивные нейтрофилы со свечением клеточной мембраны; 2) CD38 - иммунонегативные нейтрофилы - интактные клетки с неизмененной плазматической мембраной.
Учитывая необходимость упрощения существующих методик выделения эндотелиоцитов в связи с временными затратами и трудностью идентификации десквамированных эндотелиоцитов, нами были внесены изменения в существующие методики Красновой Л.Г. и Dignat-George F. Изменения заключаются в том, что мы выделили десквамированные эндотелиоциты вместе нейтрофильной фракцией периферической крови, полученной на градиенте плотности фиколл-верографина по методике описанной в пункте 2.1.1. Затем к клеточному мазку добавляли 15 мкл первичных антител (anti-CD31, Caltag, США) титр 1:50. Инкубировали 1 час при +37С0. После чего, добавляли 50 мкл вторичных FITC-меченых антител (Caltag, США) в исходном разведении 1:200 в PBS с 1% овечьей сывороткой в условиях темной комнаты. Затем инкубировали клетки 30 минут при +37С0 в темноте. Для точной идентификации и подсчета слущенных эндотелиоцитов был использован метод фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии с помощью микроскопа «ЛЮМАМ», увеличение х 450. Расчет проводился по нескольким полям зрения на 100 клеток. В поле зрения микроскопа методом фазово-контрастной микроскопией регистрировались нейтрофилы и десквамированные эндотелиоциты. Затем с помощью флуоресцентной микроскопии дифференцировались следующие виды десквамированных эндотелиоцитов: 1) CD31 - иммунопозитивные ДЭ со свечением клеточной мембраны; 2) CD31 - иммунонегативные ДЭ- интактные клетки не экспрессирующие CD31. Идентификацию и подсчет десквамированных эндотелиоцитов производили из расчета на 100 клеток нейтрофильной фракции.
Клиническая характеристика больных на госпитальном этапе лечения
Исследование проведено в соответствии свыше изложенными методиками. Для выявления уровня артериального давления, на фоне которого наиболее часто развивается острый инфаркт миокарда у больных гипертонической болезнью, все пациенты были разделены на 3 подгруппы по уровню артериального давления, определенного на момент поступления в стационар: 1)1 степень (мягкая) - САД 140-159 мм рт. ст., ДАД 90-99 мм рт. ст.; 2) II степень (умеренная) - САД 160-179 мм рт. ст., ДАД 100-109 мм рт. ст.; 3) III степень (тяжелая) - САД 180 мм рт. ст., ДАД 110 мм рт. ст. Согласно этой шкале распределение больных основных групп было следующим: со II степенью повышения АД больные составили наибольшую подгруппу обследованных - 31 человек. Пациентов с I степенью повышения артериального давления было 11 человек, с III степенью повышения артериального давления - 8 человек (табл.2).
По стажу гипертонической болезни до поступления в стационар все пациенты были распределены на 3 подгруппы: 1 подгруппа — от Ігода до 5лет; 2 подгруппа - от 6 до 10 лет; 2 подгруппа - более 10 лет (табл.3).
Наибольший процент исследованных больных составили пациенты с длительностью течения гипертонической болезни от 6 до 10 лет (40%) и больные с гипертоническим анамнезом более 10 лет (50%).
В связи с тем, что наибольший процент больных острым инфарктом миокарда на фоне гипертонической болезни на момент госпитализации составили пациенты с высокими цифрами артериального давления (САД 160-179 мм рт. ст., ДАД 100-109 мм рт. ст.) были изучены амбулаторные карты больных с целью определения стадии гипертонической болезни до возникновения инфаркта миокарда. Следует отметить, что III стадия гипертонической болезни в догоспитальный период была выставлена у пациентов, ведущим диагнозом которых являлась ишемической болезни сердца: стенокардия 2 функционального класса. При этом в анамнезе были исключены сосудистые катастрофы (острое нарушение мозгового кровообращения, острый инфаркт миокарда)
Большинство обследованных пациентов (54%) принимали гипотензивные средства по потребности, то есть когда были выражены такие симптомы, как головная боль, головокружение, сердцебиение и т.п.
В клинической картине 68% больных острым инфарктом миокарда на момент госпитализации доминировала хроническая сердечная недостаточность СН ПА по классификации Василенко-Стражеско и 2 функционального класса по NYHA (табл.6).
Во всех основных группах отмечен высокий процент зависимости от психо-эмоциональных стрессов и метеочувствительности. Контроль артериального давления осуществляли более половины всех больных основных групп (табл.7).
У всех пациентов изучали наследственный анамнез, определяемый по следующим характеристикам: наличие у близких кровных родственников инсульта, инфаркта миокарда, рецидивирующего тромбофлебита, артериальной гипертонии. Отягощенный наследственный анамнез выявлен у 88% пациентов (табл.7).
Таким образом, значительная часть пациентов имели отягощенный наследственный анамнез; страдали гипертонической болезнью от 2 до 10 лет; на момент поступления в стационар имели высокие цифры артериального давления (САД 160-180 мм рт. ст., ДАД 95-100 мм рт. ст.). До госпитализации у каждого второго пациента по амбулаторным картам диагностировалась III стадия гипертонической болезни, при этом регулярную гипотензивную терапию получали 46% пациентов.
В связи с тем, что время, прошедшее от возникновения ОРЕМ до госпитализации, в значительной мере влияет на клинические, лабораторные показатели обследуемых пациентов, является основополагающим фактором в назначении тромболитиков, а исход заболевания и отсроченный прогноз также находятся в прямой зависимости от безлекарственного промежутка, все обследуемые пациенты были госпитализированы от 2 до 6 часов (М=2,8±0,7) от возникновения ОИМ.
Для подтверждения диагноза острого инфаркта миокарда, определения локализации и размеров инфарктной зоны, всем больным проводилось электрокардиографическое обследование.
