Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных 14
1.1. Этиология хронического гастрита 14
1.2. Н. pylori-ассоциированный гастрит 16
1.2.1. Исторические этапы изучения Н. pylori 17
1.2.2 Факторы патогенности Helicobacter pylori 18
1.2.3. Иммунные нарушения при Н. pylori-ассоциированном гастрите 24
1.2.4. Диагностика инфекции Н. pylori 27
1.2.5. Лечение Н. pylori-ассоциированного гастрита 33
1.2.6. Фармакокинетическое и фармакодинамическое обоснование изменения режима дозирования препаратов в схемах эрадикации 36
1.2.7. Пробиотики в схемах эрадикации Н. pylori 46
1.3. Эндорфинная система желудка 49
1.4. Итерфероновая система человека 51
1.5. HLA-система человека 54
Резюме 59
Глава 2. Материал и методы исследования 60
2.1. Клинический раздел 63
2.2. Молекулярное типирование HLА-генов II класса 63
2.3. Эндоскопический раздел 65
2.4. Морфологический раздел 65
2.5. Диагностика Н. pylori-статуса пациента 66
2.5.1. Быстрый уреазный тест 66
2.5.2. 13С-уреазный дыхательный тест 67
2.5.3. Гистологическая диагностика Н. pylori 68
2.5.4. ГЩР с гастробиоптатами 68
2.5.5. Серологическая диагностика 70
2.6. Оценка отдельных параметров иммунного статуса пациентов 71
2.7. Методика исследования микрофлоры кишечника 72
2.8. Примененные лечебные подходы 74
2.9. Фармакоэкономическое обоснование режимов эрадикации 84
3.0. Методы статистической обработки результатов исследования 93
Глава 3. Собственные данные 95
3.1. Характеристика групп больных 95
3.2. Иммуногенетическое обследование пациентов 97
3.3. Иммунологическое обследование больных 110
3.4. Распределение генотипов Н. pylory в различных группах больных 111
3.5. Результаты серологического исследования 116
3.6. Результаты гистологического исследования гастробиоптатов 119
3.7. Результаты оценки уреазной активности Н. pylori 126
3.8. Результаты исследования уровня секреторного IgA в слизистой оболочке желудка 129
3.9. Результаты, бактериологического исследования полостной микрофлоры
кишки 134
3.10. Оценка эффективности эрадикационных схем 140
3.10.1. Первый этап исследования 139
3.10.2. Второй этап исследования 167
3.10.3 Третий этап исследования 171
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 182
Выводы 220
Практические рекомендации 221
Список литературы 223
- Этиология хронического гастрита
- Факторы патогенности Helicobacter pylori
- Молекулярное типирование HLА-генов II класса
- Характеристика групп больных
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хронические Н. pylori-ассоциированные гастриты имеют наибольший удельный вес среди всех хронических заболеваний гастродуоденальной зоны [5, 38, 149]. Значимость проблемы подчеркивает присуждение Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2005 г. за открытие бактерии Н. pylori и ее роли при гастрите и язвенной болезни В. J.Marshall и R.J.Warren.
Большой интерес к хроническим Н. pylori-ассоциированным гастритам обусловлен не только повсеместным и широким распространением хеликобактерной инфекции, но и высоким онкогенным потенциалом некоторых вариантов данного страдания [3, 162].
В настоящее время доказана этиологическая роль хеликобактера в развитии хронического Н. pylori-ассоциированного гастрита [4, 225, 321]. Однако существует диссоциация между частотой инфицированности данным микроорганизмом и количеством больных хроническим гастритом [46, 117, 118]. Возможность колонизации микроорганизмом слизистой оболочки желудка без развития воспалительного процесса создает предпосылки к поиску новых факторов вирулентности Н. pylori и колонизационной резистентности индивидуума [19, 70]. Многообразие проявлений хеликобактерной инфекции позволяет рассматривать Н. pylori-ассоциированный гастрит как результат взаимодействия организма хозяина (фенотип, генотип, состояние общего и местного иммунитета) и микроорганизма (факторы патогенности и вирулентности, инфицирующая доза) [20, 63, 69, 98, 291, 307].
Установлено, что эрадикация Н. pylori является ведущим фактором предупреждения рецидива заболевания [8, 21, 109]. Для эрадикации микроорганизма при Н. pylori-ассоциированных заболеваниях применяются комплексные схемы, включающие как минимум два антибактериальных
препарата в сочетании с ингибиторами протонного насоса [1, 23, 27, 221]. Однако даже при таком подходе частота элиминации возбудителя из слизистой оболочки желудка не достигает 80% [177]. В этой связи, актуальным становится поиск новых путей повышения эффективности стандартной эрадикационной терапии.
В последние годы сформировалось представление о целесообразности использования в комплексе лечебных мер препаратов, меняющих иммунную реактивность, микробиоценоз и нейроэндокринную регуляцию больного. Однако до настоящего времени клинические исследования в этом направлении единичны [9, 58, 87, 95, 116, 212, 243].
Желудочно-кишечный тракт представляет собой единую систему, в которой все звенья взаимосвязаны. В этой связи важным является изучение взаимного влияния патологии желудка и кишечника и возможности использования пробиотических препаратов с целью повышения иммунной реактивности макроорганизма' и местного иммунитета слизистой оболочки желудка [2, 44, 90, 130, 255].
Таким образом, широкая распространённость Н. pylori-ассоциированного гастрита, недостаточная эффективность стандартных эрадикационных схем, участие иммунных, нейрогормональных и микробиотических нарушений в генезе заболевания и отсутствие исследований посвященных коррекции этих сдвигов, послужили основанием для проведения данного исследования с целью создания теоретической и практической базы для разработки новых терапевтических подходов к лечению Н. pylori-ассоциированных гастритов.
Цель исследования и задачи исследования
Целью работы явилось изучение патогенетических особенностей хронических Н. pylori-ассоциированных гастритов и возможностей влияния на
их течение лекарственных средств, воздействующих на иммунную реактивность.
Для реализации этой цели были сформулированы следующие задачи:
Оценить состояние иммунной системы, локальные иммуноморфологические характеристики больных с Н. pylori-ассоциированными хроническими гастритами.
Выявить особенности HLA-DRB1 статуса больных Н. pylori-ассоциированными хроническими гастритами.
Оценить вклад факторов патогенности Н. pylori в реализацию варианта течения хеликобактерного поражения.
Оценить частоту достижения эрадикации при использовании стандартных схем терапии при Н. pylori-ассоциированных заболеваниях.
Изучить влияние индуктора интерферона неовира, синтетического аналога лейцинэнкефалина даларгина и синбиотика ламинолакта на частоту достижения эрадикации при Н. pylori-ассоциированных хронических гастритах.
Оценить влияние монотерапии ламинолактом на течение хронического гастрита и язвенной болезни.
Разработать и внедрить в клиническую практику рекомендации по ступенчатому дифференцированному подходу к выбору режимов эрадикации Н. pylori.
Научная новизна
Научная новизна исследования заключается в разработке способов воздействия на течение хронического воспаления в слизистой оболочке j желудка при Н. pylori-ассоциированном гастрите. С использованием системного подхода к оценке клинических и иммуногенетических особенностей больных с хроническим Н. pylori-ассоциированным гастритом осуществлено сопоставление эффективности применения стандартных
эрадикационных подходов и оригинальных комплексных методик с подключением индуктора интерферона неовира, синтетического аналога лейцинэнкефалина даларгина и синбиотика ламинолакта. Установлено, что неовир в комплексе со стандартной схемой лечения достоверно увеличивает эффективность эрадикационной терапии. В то же время подключение даларгина, существенно не влияя на частоту достижения эрадикации, повышает клиническую эффективность лечения и способствует стабилизации процессов подавления Н. pylori. Показана возможность достижения эрадикации микроорганизма из слизистой оболочки желудка при монотерапии ламинолактом. Установлена высокая частота инфицирования как минимум двумя штаммами микроорганизма.
Определены иммуногенетические характеристики пациентов и генотипические особенности Н. pylori, влияющие на частоту достижения эрадикации микроорганизма. Проанализировано состояние местного гуморального иммунитета (уровень секреторного IgA) у пациентов с Н. pylori-ассоциированным гастритом и влияние эрадикации Н. pylori на уровень slgA.
Показана низкая частота реинфицирования после достижения эрадикации.
По результатам исследования получен патент на изобретение способа, лечения хронического Н. pylori-ассоциированного гастрита препаратом ламинолакт, зарегистрированным в Государственном реестре изобретений РФ 27.02.2005 г.
Практическая значимость работы
Выявлены иммуногенетические предрасполагающие и защитные факторы в отношении развития данного заболевания, показано их влияние на эффективность стандартных лечебных подходов. Обоснована целесообразность HLA-DRBl-типирования пациентов с хроническим Н. pylori-ассоциированным гастритом и типирования генома Н. pylori для определения объема дальнейшего
терапевтического воздействия. Показана низкая эффективность стандартной семидневной трехкомпонентной схемы эрадикации Н. pylori и повышение эффективности терапии путем интенсификации или включения в комплексную схему лечения иммуномодулирующего препарата неовир, что имеет как клиническое, так и экономическое значение, так как удается вызвать стойкую клинико-эндоскопическую ремиссию гастрита у большего числа пациентов. Предложена оптимальная эрадикационная терапия первой линии с точки зрения затраты-эффективность, заключающаяся в сочетании стандартной схемы лечения с ламинолактом, установлена возможность достижения у ряда больных эрадикации при монотерапии ламинолактом. Разработан алгоритм выбора схемы эрадикации Н. pylori.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Иммуногенетические характеристики жителей Санкт-Петербурга в виде носительства определенных HLA-DRB1 специфичностей предрасполагают к ; развитию Н. pylori-ассоциированного гастрита и влияют на эффективность эрадикационнои терапии.
Генотипические особенности микроорганизма Ы. pylori (cagA+ и cagH+) оказывают влияние на течение хеликобактерного поражения и эффективность эрадикационнои терапии.
Стандартная семидневная трехкомпонентная схема не может быть рекомендована для лечения жителей Санкт-Петербурга при Н. pylori-ассоциированном гастрите в силу ее недостаточной эффективности.
В качестве терапии первой линии фармакоэкономически оправдано сочетание стандартной трехкомпонентной эрадикационнои схемы с ламинолактом. Монотерапия ламинолактом хронического Н. pylori-ассоциированного гастрита может быть рекомендована при наличии противопоказаний к антибиотикам.
12 Апробация работы
Основные положения работы доложены на Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2004—2007), Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2001—2005), X сессии российской группы по изучению Н. pylori (Омск, 2004), III Конференции гастроэнтерологов Южного федерального округа (Ростов-на-Дону, 2004). Результаты исследования представлены на Российской конференции с международным участием «СПб-Гастро» (Санкт-Петербург, 2002; 2005; 2008), VII Международной конференции MAKMAX/ESCMID (Москва, 2005), конгрессе терапевтов Северо-Западного региона (Санкт-Петербург, 2005), Первой Северо-Западной конференции «Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2005), конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2006, 2008).
По теме диссертации опубликована 71 работа, наиболее значительные из них представлены в автореферате, в том числе 25 статей, из которых 8 опубликованы в журналах по перечню ВАК России, 3 учебно-методических работы, получен патент Российской Федерации на изобретение.
Внедрение в практику
Полученные результаты используются в практической работе Санкт-Петербургской ГУЗ «Городская больница №26», больницы №33 г. Колпино, диагностическом консультативном центре №85, в учебном процессе кафедр терапии и клинической фармакологии, гастроэнтерологии ГОУ ДПО СПбМАПО.
13 Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста, включает введение, четыре главы, выводы, практические рекомендации, список литературы из 343 источников (95 — отечественных и 248 — зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 47 рисунками и 44 таблицами.
Этиология хронического гастрита
Анализ литературных данных позволяет прийти к выводу о том, что общепринятого определения хроничекого гастрита в настоящее время нет. Наиболее распространённой точкой зрения является представление, в соответствии с которым «хронический гастрит» — клинико-морфологическое понятие. Хроническое воспаление желудка подтверждается только результатами морфологического исследования слизистой оболочки [7, 43, 133]. Еще в руководстве В. С. Morson и I. М. P. Dawson, опубликованном в 1979 году указывалось, что до_ биопсии клиницист не вправе диагностировать хронический гастрит и может применять лишь синдромологическое обозначение «неязвенная диспепсия» [239, 272].
Термин «хронический гастрит», если переводить его буквально, обозначает хроническое воспаление желудка. Однако клинико-морфологически речь идёт только о слизистой оболочке, где развиваются процессы воспаления, дистрофии и нарушения клеточного обновления, степень выраженности которых определяет морфогенез и клиническую картину заболевания [134, 287, 301].
Гастрит является широко распространённым заболеванием [264, 266]. Первые эпидемиологические исследования этого заболевания в популяции с использованием биопсийного материала проводились в 1968 году. Согласно исследованию, хронический гастрит был обнаружен у 53% всех обследованных, из них в 29% случаев обнаруживалась атрофия слизистой [300].
В настоящее время показатели распространённости хронического гастрита в целом остаются прежними, однако, согласно современным представлениям об этиопатогенезе данного заболевания, выделены новые типы гастрита, показан их удельный вес в структуре заболевания [5, 149, 168, 169, 234].
В России и других странах СНГ, по данным официальной статистики, ежегодно регистрируется более 1 млн. случаев заболеваний хроническими гастритами и язвенной болезнью [81].
Проблемы этиопатогенеза хронического гастрита в течение десятилетий обсуждались в многочисленных исследованиях. Делались попытки установления ведущей роли таких факторов внешней среды как особенности пищевого поведения и рациона, употребление кофе, алкоголя, курения [5, 16, 128, 150].
Поворотным моментом в понимании проблемы хронических гастритов слало открытие Helicobacter pylori в 1983 году австралийскими учеными B.J. Marshall и J.R. Warren [226]. Согласно современным представлениям, нашедшим отражение в Сиднейской классификации гастритов, наиболее часто встречаются аутоиммунный, химический и хеликобактерный гастриты [271].
Аутоиммунный хронический гастрит (тип А) является достаточно редким $ заболеванием. Он встречается в 9% случаев всех атрофических форм гастритов, обнаруженных в европейской популяции преимущественно в двух возрастных группах: людей пожилых и детей [144, 150, 152]. Сочетанные формы, то есть хронический гастрит А + В имеет более высокий удельный вес - 12%. Половых различий распространённости этого типа гастрита обнаружено не было.
Химически обусловленный хронический гастрит (тип С) имеет ряд эпидемиологических особенностей. Наиболее частой причиной развития данного типа гастрита — резекция желудка и поэтому распространённость его коррелирует с частотой операции в том или ином регионе и видом резекции. В среднем реактивный рефлюкс-гастрит возникает у 35% оперированных больных [5].
Хеликобактер пилори-ассоциированный хронический гастрит (тип В или бактериальный) доминирует над другими типами гастрита (до 85%). В настоящее время этиологическая роль Н. pylori при хроническом гастрите доказана и общепризнанна [54, 159, 160]. Наиболее убедительные данные были получены в ходе экспериментов по самозаражению волонтеров чистой культурой Н. pylori.
Эпидемиологические данные по распространенности этого типа гастрита отражают не частоту поражения слизистой оболочки, а частоту выявления инфекционного агента Н. pylori [31, 72]. По мнению ряда авторов, практически эпидемиология этой инфекции и является эпидемиологией хронического Н. pylori-ассоциированного гастрита [23, 78, 297].
Публикации последних лет, как российских, так и зарубежных гастроэнтерологов, генетиков, микробиологов, сфокусированы на проблеме оценки факторов вирулентности и патогенности Н. pylori [94, 101, 119, 127, 155, 194]. После открытия хеликобактера, целый ряд ученых скептически относились к необходимости элиминировать микроорганизм из слизистой оболочки желудка. Доводы строились на подтверждении факта колонизации желудка без развития инфекции [117, 267, 270]. Накопленный за последние десятилетия научный и практический опыт лечения Н. pylori-инфицированных пациентов, позволил очертить круг страданий, при которых элиминация микроорганизма из желудка приводит к изменению течения патологического процесса, а в ряде случаев — к излечению [221].
Н. pylori относится к числу грамотрицательных бактерий. Под микроскопом клетки имеют вид подвижных спиральных, изогнутых или прямых палочек, диаметром 0,5-1,0 мкм и длиной 2,5-5,0 мкм, с закругленными концами. Движение клеток быстрое и стремительное за счет жгутиков с чехлами, расположенных на одном из полюсов. Микроорганизм является микроаэрофилом [48, 148, 154, 156]. Этот факт существенно затрудняет работу с чистой культурой хеликобактера.
Значимым фактом является способность Н. pylori трансформироваться из спиралевидной формы в кокковидную [24, 236, 265, 319]. Нельзя исключить, что данный механизм способствует снижению эффективности антимикробных препаратов при проведении эрадикации микроорганизма [206]. Существуют различия в экспрессии генов вирулентности у различных форм. Кокковидные формы Н. pylori полностью перестают синтезировать белки с высокой молекулярной массой и, скорее всего, этим можно объяснить их низкую иммуногенность [114, 283, 233].
Факторы патогенности Helicobacter pylori
Публикации последних лет, как российских, так и зарубежных гастроэнтерологов, генетиков, микробиологов, сфокусированы на проблеме оценки факторов вирулентности и патогенности Н. pylori [94, 101, 119, 127, 155, 194]. После открытия хеликобактера, целый ряд ученых скептически относились к необходимости элиминировать микроорганизм из слизистой оболочки желудка. Доводы строились на подтверждении факта колонизации желудка без развития инфекции [117, 267, 270]. Накопленный за последние десятилетия научный и практический опыт лечения Н. pylori-инфицированных пациентов, позволил очертить круг страданий, при которых элиминация микроорганизма из желудка приводит к изменению течения патологического процесса, а в ряде случаев — к излечению [221].
Н. pylori относится к числу грамотрицательных бактерий. Под микроскопом клетки имеют вид подвижных спиральных, изогнутых или прямых палочек, диаметром 0,5-1,0 мкм и длиной 2,5-5,0 мкм, с закругленными концами. Движение клеток быстрое и стремительное за счет жгутиков с чехлами, расположенных на одном из полюсов. Микроорганизм является микроаэрофилом [48, 148, 154, 156]. Этот факт существенно затрудняет работу с чистой культурой хеликобактера.
Значимым фактом является способность Н. pylori трансформироваться из спиралевидной формы в кокковидную [24, 236, 265, 319]. Нельзя исключить, что данный механизм способствует снижению эффективности антимикробных препаратов при проведении эрадикации микроорганизма [206]. Существуют различия в экспрессии генов вирулентности у различных форм. Кокковидные формы Н. pylori полностью перестают синтезировать белки с высокой молекулярной массой и, скорее всего, этим можно объяснить их низкую иммуногенность [114, 283, 233].
Бактерии в слизистой оболочке желудка описывали еще в прошлом веке, однако впервые научно обосновать связь микроорганизмов с развитием воспаления слизистой удалось австралийским ученым. Исторические этапы развития представлений о микроорганизме Н. pylori представлены в табл. 1 [29,141,221,227].
Н. pylori относится к числу патогенных бактерий, хотя, по мнению М. J. В laser, в зависимости от обстоятельств он может вести себя как комменсал.
Важным фактором колонизации Н. pylori является подвижность, связанная с наличием мощных жгутиков, которые позволяют ему легко перемещаться в такой вязкой среде, как слизь. Основу жгутиков составляют два белка FlaA и FlaB, кодируемых генами flaA и flaB, экспрессию которых регулирует особый регуляторный белок FIbA.
Микроб способен выживать в кислой среде желудка благодаря способности продуцировать уреазу. Уреаза расщепляет мочевину до аммиака, нейтрализующего ионы водорода. При этом уреаза Н. pylori действует как токсин, повреждая эпителий ионами аммония. Уреаза является многомерным никельсодержащим белком. Уреазный генетический кластер кодирует структурные субъеденицы (ureB, ureA, ureC, urel, ureE, ureF, ureG, ureH), на выявлении которых основыны методы ПЦР диагностики хеликобактера [237].
Вслед за инвазией существенным этапом на пути развития большинства инфекционных заболеваний является адгезия бактерий к клеткам и элементам соединительной ткани. У Н. pylori выявлено несколько адгезинов, определяющих выбор хозяина и взаимодействующих с эпителиальными клетками. Из их числа лучше всего изучены белки Bab (blood-group associated binding adhesin), гемагглютинин с молекулярной массой 3 кДа, имеющий высокое сродство к нейрамиллактозе и обозначаемый как NLBH (neuramil lactose binding haemagglutinin). В качестве рецепторов адгезины используют остатки сиаловых кислот (как, например, NLBH), сульфогруппы гликопротеинов, гликолипиды, фосфолипиды и остатки фукозы Льюис-подобных антигенов (как Bab). Показана способность микроба прилипать к белкам соединительной ткани, в частности к коллагену, ламинину и ветронектину [175].
Помимо уреазы и адгезинов, к числу факторов, предохраняющих Н. pylori от действия защитных сил организма и химиотерапевтических средств относится способность микроба к инвазии эпителиальных клеток. Предполагается, что вхождение Н. pylori в эпителиальные клетки индуцируется самим микробом. Косвенным подтверждением этого являются данные о способности Н. pylori при контакте с эпителием индуцировать продукт гена iceA, который относят к классу рестриктаз [313].
Кроме того, Н. pylori обладает способностью вырабатывать токсины. Наиболее изученным является цитотоксин A (VacA), вызывающий вакуолизацию клеток эпителия путем образования пор в цитоплазматической мембране. Способностью к образованию белка VacA обладают примерно 50% штаммов, тем не менее, vacA ген найден у всех штаммов [107, 143, 202]. Бактериальная клетка синтезирует VacA-цитотоксин в виде предшественника массой 140кДа, который в процессе секреции преобразуется в полипептид массой 88 кДа [229, 334]. С-концевой фрагмент белка-предшественника массой 50 кДа остается связанным с бактериальной клеткой, секретировавшийся же полипептид расщепляется еще на два фрагмента, которые прочно связаны между собой. Одна из субъединиц связывается с рецептором на клетке-мишени (B-binding subunit) и обуславливает адгезию, а другая обладает функциональной активностью (A-active subunit). Под действием низких значений рН димеры токсина на мембране эукариотической клетки образуют гексомеры, которые и формируют ионселективные каналы, описанные X.Wang и соавторами в 2000 году [320]. Нарушение ионного баланса внутри эукариотических клеток приводит к образованию в них вакуолей, что и дало название токсину. К важным функциям VacA можно отнести пассивный селективный транспорт мочевины через эпителиоциты желудка. Другим важным свойством VacA является его способность модифицировать цитоскелет эпителиоцитов. Полагают, что этот эффект обусловлен прямым связыванием цитотоксина с протеином VIP54 — структурной единицей микрофиламентов. Возникающие изменения цитоскелета клетки значительно уменьшают ее подвижность, а это приводит к замедлению заживления микродефектов эпителия, которое осуществляется за счет миграции соседних эпителиоцитов.
Вследствие мозаичной структуры соответствующего оперона, vacA может существовать в виде следующих аллелей: sla, sib, sic, s2, ml, m2a, m2b. Комбинация si a/ml аллелей ассоциируется с самой высокой цитотоксическои активностью [308, 314, 315, 334]. Штаммы с генотипом s2 продуцируют неактивный токсин.
Молекулярное типирование HLА-генов II класса
Молекулярное типирование HLA генов II класса проводилось в два этапа: выделение геномной ДНК и реакция амплификации с набором сиквенс-специфичных праймеров. HLA-типирование проводилось на базе Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.
Геномную ДНК для исследования выделяли из мононуклеарных клеток стабилизированной EDTA периферической крови (замороженной при -20С) согласно инструкции по применению набора реагентов для выделения ДНК («НПФ ДНК-Технология», Москва).
Определение аллелей HLA-DRB1 гена проводили методом ПЦР с помощью реагентов «НПФ ДНК-Технология» (Москва). Отличительной особенностью примененного PCR-mSSP (polimerase-chain reaction sequence specific primers mixed) метода (Алексеев Л.П. и соавторы, 1997) является использование во время одной амплификации нескольких пар праймеров, образующих в ходе ПЦР продукты различной длины. Это позволило амплифицировать одновременно различные аллельные варианты исследуемого гена и идентифицировать их по соотношению ПЦР-продукта со стандартным маркером длин ДНК.
Эндоскопическое обследование пациентов включало фиброэзофагогастроскопию с использованием эндоскопов фирмы «Olympus», Япония. При фиброэзофагогастроскопии оценивалось состояние слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Обращалось внимание на как выраженность воспалительных изменений (гиперемия, отек), их распространенность (антральный гастрит, гастродуоденит, пангастрит, дуоденит), наличие эрозий и язв. Для диагностики Н. pylori и гистологического исследования выполнялся забор биоптатов слизистой оболочки желудка из различных отделов: тело желудка (2 биоптата), антральный отдел желудка (3 биоптата), луковица двенадцатиперстной кишки (1 биоптат).
Эндоскопически пациенты обследовались до лечения, через 6 недель. По клиническим показаниям, ФГДС выполнялась через 6-12 месяцев после окончания основного курса терапии.
Гастробиоптаты из антрального отдела и нижней трети тела желудка, полученные при фиброгастроскопии, помещались в пробирки с 96% этанолом, где фиксировались в течение 24 часов. Далее осуществлялась стандартная обработка материала с последующим приготовлением парафиновых срезов. Срезы окрашивались гематоксилином-эозином.
Следуя визуально-аналоговой шкале, оценивались наличие и степень инфильтрации нейтрофильными гранулоцитами, лимфоцитами и плазматическими клетками, выраженность атрофии, метаплазии. Проводилось определение концентрации IgA в биоптатах методом блоттинга. В качестве контроля использовали коммерческий сывороточный IgA человека в концентрации 1мг/мл и его двукратное разведение. По 3 мкл каждого разведения наносили на нитроцеллюлозную мембрану в один контрольный ряд.
К образцам биоптатов добавляли по 200 мкл физиологического раствора, ресуспендировали и наносили на эту же мембрану по 3 мкл. Мембрану с нанесенными образцами биоптатов помещали в раствор «блотто» на 30 минут при встряхивании при комнатной температуре. Затем мембрану помещали в раствор «блотто», содержащий меченную антисыворотку против IgA и выдерживали 30 минут. Мембрану отмывали 10 минут раствором блотто и 3 раза по 5 минут раствором PBS. Отмытую мембрану подсушивали на воздухе и помещали в раствор субстрата для щелочной фосфатазы (Х-фосфат, NBT) для окрашивания.
Для оценки инфицирования Н. pylori использовался одновременно комплекс диагностических методик. Сочетание инвазивных (быстрый уреазный тест, гистологический метод, ПЦР-диагностики) и неинвазивных ( С дыхательный тест, определение антител к хеликобактеру) методов диагностики позволили избежать ложных результатов как вначале лечения, так и после курса эрадикации.
Для работы использовался уреазный тест. Метод, как показано на рис.1, основан на выявлении уреазнои активность Н. pylori.
При гидролизе мочевины под действием уреазы происходит накопление иона аммония и увеличение рН среды, что фиксируется с помощью индикатора, изменяющего окрашивание раствора фенол-рот. Фенол-рот изменяет желтую окраску на малиновую при рН выше 6,8. Биоптаты помещали в раствор, содержащий мочевину по изменению цвета раствора судили о наличии или отсутствии в образце слизистой желудка Н. pylori, обладающих уреазнои активностью.
Характеристика групп больных
Как отмечалось в главе материал и методы, в исследование было включено 393 пациента с диспепсическими жалобами и верифицированным Н. pylori-ассоциированным хроническим гастритом. У 170 обследованных пациентов не выявлено (за время наблюдения и анамнестически) сопутствующего язвенного поражения желудочно-кишечного тракта. Эти пациенты расценивались как больные с «изолированным» хеликобактерным гастритом. Язвенной болезнью с поражением двенадцатиперстной кишки на фоне хронического Н. pylori-ассоциированного хронического гастрита страдал 151 пациент. У 72 пациентов, хронический хеликобактерный гастрит сочетался с неспецифическим язвенным колитом. Несмотря на нозологические различия, всех пациентов объединял факт инфицированности Н. pylori и наличие клинико-морфологических признаков хронического гастрита.
Группы больных различались по возрасту и длительности заболевания. Пациенты, страдающие язвенной болезнью и НЯК были достоверно старше (44,47±2,8 лет и 47,38±3,08 лет соответственно) чем группа пациентов без язвенного поражения желудочно-кишечного тракта (р 0,0001). Это свидетельствует о том, что гастритом, как фоновым заболеванием, пациенты начинают страдать раньше. Тем не менее, анамнез заболевания язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки был короче (табл. 14).
Как правило, все пациенты указывали на наличие диспепсических явлений еще в детском возрасте, состояли на учете у гастроэнтеролога. Часть пациентов отмечала цикличный характер заболевания, усиление симптоматики на фоне психоэмоциональных нагрузок. Пациенты, страдающие язвенной болезнью и НЯК, отмечали четкую сезонность в самочувствии, зачастую связанную не столько с обострением основного заболевания, сколько с обострением «фонового» гастрита. Характер жалоб в момент обострения хронического гастрита не зависел от сопутствующей патологии. Как показано на рис. 13., в клинической картине преобладали жалобы на боль, возникающую в момент приема пищи или сразу после еды (315 человек, 80,2% больных), изжогу (289 больных, 73,5%), отрыжку «кислым» (291 пациент, 74%), чувство наполненности и распирания в эпигастрии (298 больных, 75,8%), тошноту (157 человек, 39,9%).
Среди описываемых жалоб не удалось выявить специфичные типично «гастритические». Это, вероятно, объясняется отсутствием ноцицептивных рецепторов непосредственно в слизистой оболочке желудка и возникновение висцеральной боли при раздражении ноцицепторов мышечного слоя верхних отделов желудочно-кишечного тракта.
Таким образом, клиническая картина складывалась из симптомокомплекса (чувство наполненности и распирания в эпигастральной области, отрыжка, изжога, тошнота), обусловленного дискинезией желудка и двенадцатиперстной кишки, возникающих на фоне воспаления. Оценить частоту встречаемости сопутствующей гастроэзофагеальной рефлюксной болезни не представлялось возможным в силу особенности дизайна данной работы. Частая жалоба на изжогу в период обострения гастрита также отражала сопутствующие нарушения моторики.
Генетические особенности организма играют решающую роль в реализации многих болезней. При колонизации слизистой оболочки желудка микробной флорой, HLA класс генов главного комплекса гистосовместимости определяет развитие специфического иммунного распознавания и ответа на чужеродный антиген. Сцепленность Н. pylori инфекции с экспрессией молекул HLA неоднократно подтверждалась. Для каждой изучаемой популяции (японцы, мексиканцы, итальянцы и другие) описаны свои аллельные сочетания, предрасполагающие к развитию хеликобактерной инфекции. В условиях циркулирования в популяции идентичных штаммов Н. pylori, представляется важным выявить влияние иммуногенетических особенностей индивидуума на вариант развития хеликобактерного страдания.
Для оценки иммуногенетических особенностей пациентов проводилось типирование HLA II класса, так как именно молекулы II класса имеют детерминирующее значение в развитии хронических инфекционных заболеваний, а DR-антигены играют наиболее существенную роль в регуляции процессов взаимодействия микроорганизмов с макроорганизмом, презентации генов хеликобактера иммунокомпетентным клеткам для формирования иммунного ответа на чужеродные антигены. Для оценки частоты встречаемости различных аллельных сочетаний при хеликобактерной инфекции, проведено HLA-DRB1 типирование 176 пациентов, страдающих Н. pylori-ассоциированным гастритом. Из них у 77 больных диагностирован изолированный хеликобактерный гастрит, у 59 пациентов гастрит сочетался с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и у 40 пациентов — с НЯК. Распределение аллелей данного локуса для пациентов трех групп представлено в табл. 15. Полученные данные сравнивались с результатами обследования 346 здоровых неродственных жителей Северо-Западного региона России, прошедшими обследование в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии.
Достоверность различий оценивалась по критерию % . При статистической обработке данных рассчитывался показатель относительного риска (RR) развития заболевания у лиц, имеющих данный HLA фактор по сравнению с теми, у кого его нет. Кроме того, вычислялась этиологическая фракция (EF), показывающая ту часть больных, у которых заболевание связано с наличием данной HLA специфичности или протективная фракция (PF) показывающая ту часть больных, у которых заболевание не развивается при выявлении данной HLA специфичности.
![Особенности диагностики и терапии язвенной болезни с локализацией язвы в луковице двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori и описторхозом [Электронный ресурс]](/i/i/4442/201941.png "Особенности диагностики и терапии язвенной болезни с локализацией язвы в луковице двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori и описторхозом [Электронный ресурс] Ворох Марина Петровна")
