Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности иммунного надзора организма при злокачественных новообразованиях (обзор литературы) 13
1.1. Клеточное звено иммунитета при злокачественных новообразованиях 13
1.2. Роль цитокинов в патогенезе злокачественных новообразований 24
1.3. Взаимосвязь хронического воспаления с развитием злокачественных новообразований 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1 Материалы исследования 35
2.2 Методы исследования 36
2.2.1 Количественное определение популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови 36
2.2.2 Определение реакции мононуклеарных клеток на фетальные протеины in vitro 37
2.2.3 Патогистологическая характеристика операционного материала больных 38
2.2.4 Определение в сыворотке крови и в супернатантах цельной крови содержания цитокинов: IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IFN-a, IFN-y, TNF-a, определение в сыворотке крови уровней антител к TNF-a, IFN-a, IFN-y, к фетальным протеинам и рецепторного антагониста IL-1 41
Глава 3. Результаты исследования 43
3.1 Фенотип мононуклеарных клеток и их ответ на фетальные протеины у больных со злокачественными новообразованиями 43
3.2 Содержание цитокинов и уровень антител к TNF-a у больных с онкологической патологией 56
3.3 Показатели реакции мононуклеарных клеток на фетальные протеины, уровни цитокинов и антител к противовоспалительным цитокинам при дисплазиях бронхиального эпителия у больных туберкулезом легких 63
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 71
Выводы 77
Практические рекомендации 79
Литература 80
- Клеточное звено иммунитета при злокачественных новообразованиях
- Патогистологическая характеристика операционного материала больных
- Фенотип мононуклеарных клеток и их ответ на фетальные протеины у больных со злокачественными новообразованиями
- Содержание цитокинов и уровень антител к TNF-a у больных с онкологической патологией
Введение к работе
Актуальность темы. К моменту установления диагноза злокачественного
новообразования опухоль обычно находится в тесном взаимодействии с
иммунной системой. Нередко опухоль растет достаточно медленно, не вызывая
деструкции окружающих ее нормальных тканей, и по этой причине она может
не обнаруживаться иммунокомпетентными клетками (Manapara М., Sykes М.,
2004). В дальнейшем, в геноме опухолевой клетки происходят изменения,
обусловливающие быстрый инвазивный рост опухоли. По мере увеличения
опухоли в размере и прорастания ее в окружающие ткани, в дополнение к
неспецифическим защитным механизмам, активизируются реакции
адаптивного иммунитета, опосредованные дендритными клетками (Riboldi Е. et
al., 2005; Noonan D. et al., 2007). Эти клетки поглощают частички опухоли и
погибших тканей и переносят их в дренирующие лимфатические сосуды, где
презентируют Т-лимфоцитам. Развитие у больных раком
опухолеспецифического клеточного и гуморального иммунитета означает, что опухоль, как чужеродный агент, может обнаруживаться иммунной системой (Hadden I.W., 1999; Smith М., 2007). Утрата опухолевыми клетками экспрессии различных ОАА или молекул главного комплекса гистосовместимости свидетельствует о том, что иммунная система пытается элиминировать опухоль и, тем не менее, опухоли удается "ускользнуть" от иммунного надзора, поскольку ее прогрессивный рост продолжается (Maeurer М. et al, 1996; Seliger В., Maeuer М., Ferrone S., 2000; Garsia-Lora A., Algarra I., Garrido F., 2003; Algarra I. et al., 2004). Этот процесс, позволяющий видоизменить опухоль и препятствующий ее полной регрессии, получил название опухолевой иммуномодификации (Dunn G.P. et al., 2002).
Существуют различные механизмы воздействия опухоли на иммунную систему; соответственно, описаны и различные функциональные дефекты в работе эффекторных механизмов иммунитета, возникающие при онкологических заболеваниях. Так, у больных раком нарушается созревание и деятельность дендритных клеток (Ishida Т. et al., 1998; Almond В., Resser J.R.,
Lindman В., 2000; Shurin G.V., 2001; Gabrilovich D., 2004; Satthapom S., Robins A., Vassana S.W., 2004; Gerner M., Casey K., Mascher M., 2008). Кроме того, замедляется активация или ингибируется развитие опухолереактивных эффекторных Т-лимфоцитов (Finke J. et al., 1999). Указанные эффекты могут быть опосредованы следующими медиаторами: IL-10, IL-6, простогландином Е2, трансформирующим фактором роста р, васкулярным эндотелиальным фактором роста и другими цитокинами, которые вырабатываются опухолевыми клетками (Garcia-Hernandez MX. et al., 2002; Lin СМ., Wang F.H., Lee P.K., 2002; Skinnider B.F., Mak T.W., 2002; Spaner D.E., 2004; Naldini et al., 2006), иными, пока не установленными растворимыми факторами (Friberg М. et al., 2002), или поверхностными молекулами, экспрессируемыми опухолевыми клетками (Iwai Y., 2002).
Подавление адаптивного противоопухолевого иммунитета также может быть вызвано и недостаточной активацией врожденных иммунных реакций. Показано, что стимуляция макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов ОАА при наличии опухоли индуцирует так называемый окислительный взрыв, хотя и носящий неспецифический характер, результатом которого деятельность Т-лимфоцитов резко угнетается (Schmielau J., 2001). Становление противоопухолевого иммунитета тормозится также на фоне активации NK-клеток, которая приводит к массивному выбросу IL-13, относящегося к противовоспалительным цитокинам (Ahlers J.D., 2002; Chaouat G., 2005; Hanna J. et al., 2006; Chaouat G., Ledee-Bataille N., Dubanchet S., 2007).
В настоящее время трактовка опухолевой прогрессии, как следствие
иммунодефицита, представляется упрощенной. Если при генерализации
онкозаболевания дисфункция иммунитета действительно имеет место, то на
ранней стадии развития опухолевого процесса, иммунная система организма-
хозяина сохраняет свою компетентность. Иммунная система больного со
злокачественными новообразованиями достаточно длительное время
подвергается экспозиции ОАА, которые не представляют собой какого-либо
нового класса антигенов, а появляются вследствие нарушения
7 дифференцировки ткани и возврата ее к эмбриональному фенотипу (Tsao Y.P., 1996; Wade М., 2000; Wells S.J., 2000; Laman Н., 2001; Абелев Г.И., 2003; Лихтенштейн А.В., 2003).
ОАА представляют собой гликопротеиды, которые синтезируются опухолевыми клетками и обычно присутствуют в крови у здоровых лиц в малых концентрациях. При наличии хронических заболеваний соответствующих органов и, особенно, при опухолевых процессах они продуцируются в значительном количестве, что приводит к отличию опухолевых клеток по антигенному составу от нормальных клеток. В связи с этим возникает вопрос: отвечает ли иммунная система на антигены опухоли и если отвечает, то почему этот ответ недостаточно эффективен для полной элиминации опухоли (Vitale Marco, 1998; Копнин Б.П., 2000; Gudmundsdottir J., 2000; Тюряева И.И., 2008).
Возможно, изменение антигенных свойств мембран опухолевых клеток приводит к усилению злокачественности и является одним из факторов прогрессии опухоли, сопровождающимся появлением специфических детерминант ОАА, которые защищают ее от эффекторных клеточных факторов (феномен блокирования) (Ройт А., 2000; Balkwill F., Mantovani А., 2001).
Исследования показали, что иммунная система не только не отторгает растущую опухоль, но и способствует опухолевой прогрессии (Столярова В.М., Иванова Г. Г., Аутеншлюс А. И., 2000, Поповская Т.Н., 2001). Раковые клетки в процессе своего развития приобретают ряд признаков, характерных в норме для клеток иммунной системы: способность к избирательной миграции в ткани, адгезивность и инвазивность (Копнин Б.П., 2000). На трансформированных клетках экспрессируются рецепторы, свойственные клеткам иммунной системы. Взаимодействие между опухолью и иммунной системой не всегда носит антагонистический характер. Злокачественная опухоль не является для организма-хозяина полностью генетически чужеродным образованием. Более того, своеобразное "родство" между злокачественными клетками и клетками иммунной системы обнаруживается и на генетическом уровне. Развитие
8 иммунной системы контролируется в значительной степени теми же генами, которые при определенных условиях вызывают опухолевый рост (Головизнин М.В., 2001). Поэтому иммунный ответ на опухолевые антигены зависит от сложных кооперативных взаимодействий антигенпрезентирующих клеток, различных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-супрессоров) и от свойств самой опухоли (Аутеншлюс А.И., 2003, Аутеншлюс А.И., 2007; Almond Bond, 2000; Baxevanis Constantin N., 2000; Lee T.V., 2000; Satthaporn Sukchai, 2004; Gerner M., Casey K., Mascher M., 2008).
Таким образом, оценка функциональной активности мононуклеарных клеток
и ее сопряженности с опухолевой прогрессией и предраковыми состояниями,
является актуальным, т.к. даст возможность понять особенности
взаимоотношения организма-опухоленосителя и злокачественного
новообразования, в том числе и на ранних этапах его развития.
Цель работы: изучить фенотип и функциональную активность мононуклеарных клеток по их способности реагировать на опухолеассоциированные антигены и продуцировать медиаторы воспаления у больных раком молочной железы, раком легкого и с дисплазией бронхиального эпителия.
Задачи исследования:
1.Определить содержание в периферической крови популяций и субпопуляций мононуклеарных клеток, изучить их реакцию in vitro на опухолеассоциированные антигены у больных раком легкого, раком молочной железы, с локальной формой мастопатии и у больных туберкулезом легких при наличии у них дисплазии бронхиального эпителия.
Определить в сыворотке крови и в супернатантах цельной крови содержание цитокинов: IL-1(3, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IFN-a, IFN-y, TNF-a, определить в сыворотке крови уровни антител к TNF-a, IFN-a, IFN-y, к опухолеассоциированным антигенам и рецепторного антагониста IL-1.
Изучить взаимосвязь между фенотипом мононуклеарных клеток, их функциональной активностью и патогистологическими параметрами
9 операционного материала у больных раком молочной железы, с локальными формами мастопатии, раком легкого и с дисплазией бронхиального эпителия.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые показано, что у больных инфильтративным протоковым раком молочной железы снижено относительное содержание CD3 - , CD4- и CD8-лимфоцитов, повышено относительное содержание CD71 - лимфоцитов по сравнению со здоровыми женщинами, а также повышено относительное содержание CD71 -, CD25 - и CD38 - лимфоцитов, по сравнению с женщинами с локализованными формами мастопатии. При бронхогенном раке легкого относительное содержание CD71-лимфоцитов повышено по сравнению со здоровыми лицами. Впервые показана зависимость между активацией иммунной системы и тяжестью опухолевой прогрессии, о чем свидетельствует обратная корреляционная связь у больных бронхогенным раком легкого и инфильтративным протоковым раком молочной железы между содержанием клеток с маркерами активации CD25 -, CD71 - и CD95 - и митозами, патологическими митозами, степенью злокачественности и относительным содержанием низко дифференцированных клеток в опухоли.
Впервые при злокачественных новообразованиях эпителиального происхождения и при дисплазии бронхиального эпителия II и III степени обнаружено повышение относительного содержания клеток с фенотипом CD8+ после инкубации их с опухолеассоциированными антигенами. Показатели реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены при бронхогенном раке легкого находятся в обратной корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах, митозами и патологическими митозами, и в прямой - с относительным содержанием высокодифференцированных клеток в опухоли, а при инфильтративном протоковом раке молочной железы - в обратной корреляционной связи только с патологическими митозами, относительным содержанием низко- и умереннодифференцированных клеток в опухоли и так же, как и при
10 бронхогенном раке легкого, в прямой корреляционной связи с относительным содержанием высокодифференцированных клеток.
Впервые показано, что у больных инфильтративным протоковым раком молочной железы по сравнению с больными с локализованными формами мастопатии повышено содержание IL-2, а содержание IL-4 повышено только по сравнению со здоровыми. У больных бронхогенным раком легкого снижено содержание IL-2 и повышено содержание IL-4 по сравнению со здоровыми. Содержание IL-ip в сыворотке крови больных с онкологической патологией превосходило таковое у здоровых лиц, и не зависело от нозологической формы заболевания.
Впервые обнаружены антитела к TNF-a при онкологической патологии и при дисплазии бронхиального эпителия, в последнем случае обнаружены также антитела к INF-y, к опухолеассоциированным антигенам и более высокий индекс влияния опухолеассоциированных антигенов на продукцию клетками крови IL-2 и IL-6.
Впервые показано, что при повышении относительного содержания клеток с фенотипом CD8+ после инкубации их с опухолеассоциированными антигенами у больных с дисплазией бронхиального эпителия II и III степени противовоспалительный эффект достигается за счет повышенных уровней рецепторного антагониста IL-1 и антител к провоспалительным цитокинам.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Полученные при выполнении диссертационного исследования данные о характере корреляционных связей между фенотипом мононуклеарных клеток, их функциональной активностью и патогистологическими параметрами операционного материала больных дают возможность с достаточной степенью точности выделить, еще до операции, среди больных со злокачественными новообразованиями группы с тем или иным вариантом дифференцировки, сопряженной с тяжестью опухолевой прогрессии и выбрать оптимальную тактику лечения больных. Реакцию мононуклеарных клеток на
11 опухолеассоциированные антигены можно использовать для скрининга больных с локализованными формами мастопатии и туберкулезом легких, не подвергавшихся оперативному лечению и на основе показателей реакции формировать группы риска по развитию рака среди больных. Результаты изучения фенотипа мононуклеарных клеток и продуцируемых ими медиаторов воспаления и факторов гуморального иммунитета могут явиться базой для создания новых средств и технологий, препятствующих возникновению клеточной атипии.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА
ЗАЩИТУ
Повышение относительного содержания мононуклеарных клеток с фенотипом CD8 на 15% и более, по сравнению с контролем, после их инкубации с опухолеассоциированными антигенами, свойственное больным бронхогенным раком легкого, инфильтративным протоковым раком молочной железы с высоким вариантом дифференцировки и более низкой степенью злокачественности опухоли и больным туберкулезом с дисплазией бронхиального эпителия II и III степени свидетельствует о потенциальной способности мононуклеаров реагировать на контакт с опухолеассоциированными антигенами экспрессией маркеров CD8 фенотипа.
У больных бронхогенным раком легкого и инфильтративным протоковым раком молочной железы в сыворотке крови повышены уровни провоспалительных цитокинов IL-ip и TNF-a и аутоантител к TNF-a, последние свидетельствуют о способности организма-хозяина продуцировать фактор, блокирующий действие этого медиатора на опухоль и на прилегающие к ней ткани и этим самым защищающий их от некроза. При дисплазии бронхиального эпителия II и III степени противовоспалительный эффект достигается за счет повышенных уровней рецепторного антагониста IL-1 и аутоантител к TNF-a и IFN-y, что
12 подтверждает наличие иного, в отличие от механизма действия противовоспалительных цитокинов, механизма регуляции активности медиаторов воспаления.
3. II и III степень дисплазии бронхиального эпителия характеризуются высоким индексом влияния опухолеассоциированных антигенов на продукцию клетками IL-2 и IL-6 и образованием антител к опухолеассоциированным антигенам, что свидетельствует о реализации противоопухолевых функций мононуклеарами и о наличии факторов, сопряженных с опухолевой прогрессией.
МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ДОЛОЖЕНЫ И ОБСУЖДЕНЫ НА:
XIII научно-практической конференции врачей, 23-24 апреля 2003 года в г. Новосибирске
13 национальном конгрессе по болезням органов дыхания, 10-Иноября 2003 года в г. Санкт-Петербурге
VII международном конгрессе по пластической, реконструктивной хирургии и онкологии IAPSO, 20-30 ноября 2004 года в г. Москве.
Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 110-летию со дня рождения проф. Ю.А. Ратнера, 20-22 апреля 2005 года в г. Казани.
Всероссийском научном симпозиуме с международным участием. Цитокины, Стволовая клетка, Иммунитет, 19-21 июля 2005 года в г. Новосибирске.
Семинаре ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН «Оценка клеточных и гуморальных факторов гомеостаза при опухолях эпителиального происхождения и хроническом воспалительном процессе в легких» 21 мая 2008 года.
7. На научной конференции с международным участием «Дни
иммунологии в Сибири - 2008» Томск 16-19 сентября 2008 года.
Клеточное звено иммунитета при злокачественных новообразованиях
Процесс онкогенеза можно представить следующим образом: в результате воздействия физических факторов, химических агентов, эмоционального стресса, гормонального дисбаланса, а также инфекционных агентов, в клетке происходят изменения, приводящие к перенапряжению в окислительно-антиокислительной и других биохимических системах, изменению уровня перекисного окисления липидов и поверхностной архитектоники (Il yasova D., Schwartz G., 2005; Moore L.E., Wilson R.T., Gampleman S.L., 2005). За этим следует дискоординация подачи и приема местных, регионарных и отдаленных сигналов. Возникшие биохимические и структурные нарушения включают либо адаптивные механизмы клетки, приводящие к нормализации ее жизнедеятельности, либо программу гибели по апоптическому пути. Однако, при избыточном влиянии одного или нескольких мутагенов, приводящих к срыву адаптивных механизмов, в клетке могут происходить нарушения нормальных процессов, протекающих в ее генетическом аппарате. Имеются убедительные данные о том, что при повышенном уровне химических канцерогенов и облучении происходят прямые поломки в геноме, т.е. точечные мутации, генные делеции и хромосомные перестройки, нарушающие нормальную функцию генов и кодируемых ими белков (Daroui P. et al., 2004; Bensaad К. et al., 2006). Трансформация клеток с последующим формированием опухолевого фенотипа возникает в результате изменений структурных компонентов генома клетки (Татосян А.Г., 2004). К этим компонентам относят протоонкогены, гены-супрессоры и мутаторные гены. Концепция онкогенов и опухолевых супрессоров позволила объединить все направления исследований канцерогенеза. Выявленные ранее канцерогенные факторы - химические, физические, вирусные и наследственные - в конечном итоге приводят к изменению протоонкогенов, генов-супрессоров и их функций. Например, мутации опухолевого супрессорного гена р53 значительно увеличивают частоту появления в популяции делящихся клеток с генетическими изменениями, с чем, прежде всего, и связывают онкогенный потенциал аномалий р53. Кроме того, мутации р53 могут приводить к подавлению р53-зависимого апоптоза, что повышает жизнеспособность опухолевых клеток при попадании их в кровоток, а также могут стимулировать неоагиогенез. Терминальные мутации р53 приводят к врожденной предрасположенности к различным новообразованиям, в первую очередь саркомам, раку молочной железы, лимфолейкозам.
Канцерогенез представляет собой процесс накопления мутаций и других генетичеких и эпигенетических изменений, приводящих вначале к приобретению таких свойств клетки, которые предопределяют ее способность образовывать злокачественную опухоль, а затем в силу высокой генетической изменчивости и селекции, происходящей под давлением со стороны организма, к возникновению и отбору все более и более автономных и агрессивных субклонов (Тюряеева И.И., 2008). В итоге, описываемые выше события инициируют процессы, приводящие к появлению трансформированных клеток, вначале с признаками гиперплазии, затем дисплазии различной степени выраженности, переходящие в рак in situ (Копнин Б.П., 2000; Якубовская Р.И., 2000). Следовательно, можно предположить, что злокачественные новообразования являются формой патологии, которая сопровождается принципиальными искажениями механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток. Определяющее свойство злокачественного новообразования - сохранять направление и уровень дифференцировки клеток-предшественниц, является, скорее всего, общебиологическим феноменом, а не следствием иммунной недостаточности (Абелев Г.И., 2000; Абелев Г.И., 2003). Наиболее яркой демонстрацией этого качества клеток опухолевого клона служит репертуар ОАА, большинство из которых представлены дифференцировочными антигенами соответствующей нормальной ткани (Лихтенштейн А.В., Потапова Г.И., 2003). Спектр антигенов злокачественной клетки (за исключением неоантигенов соматических мутаций и специфических антигенов клеток меланомы) отражает как бы "застывшую" стадию дифференцировки нормальных клеток. Во многом, с антигенной невыразительностью злокачественного новообразования связана неэффективность действия иммунной системы по отношению к опухоли (Антонов ВТ., Козлов В.К., 2004; Van Der Bruggen P., 2002). Есть все основания полагать, что опухолевые клетки со сниженной экспрессией или утратой части дифференцировочных антигенов обладают селективным преимуществом в результате повышенной способности к прогрессу и ускользанию от иммунного надзора организма (Maeurer М. et al., 1996; Seliger В., Maeuer М., Ferrone S., 2000; Garsia-Lora A., Algarra I., Garrido F., 2003). Таким образом, экспрессия дифференцировочных генов в опухолевых клетках, выражающаяся в наличии определенных дифференцировочных антигенов, является следствием: 1) определенных генетических нарушений, приводящих к трансформации клетки; 2) эпигеномных изменений, вызванных нарушениями связи с ее микроокружением (Тюряеева И.И., 2008; Zhong L. et al., 2008). У больных с онкологическими заболеваниями обнаружены дисфункции клеточного звена иммунной системы, заключающиеся в следующем: 1) в нарушении антигенпредставляющей функции МНК; 2) в уменьшении пролиферации ИКК и экспрессии аир субъединиц рецептора IL-2; 3) в нарушении баланса "проопухолевых", "противоопухолевых" и "регуляторных" цитокинов (Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2000; Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М., 2002; Молчанов О.Е. и др., 2001; Молчанов О.Е., Карелин М.И., Жаринов Г.М., 2002). То есть, при опухолевом росте происходит снижение уровня иммунологического надзора и нарушение функции распознавания трансформированных клеток. Это означает, что нарушение, скорее всего, вызвано неэффективным межклеточным взаимодействием, изменением нормальной взаимосвязи между субпопуляциями лимфоцитов (Олейник Е.К. и др., 2001; Олейник Е.К. и др., 2007; Zhong L. et al., 2008). Формирование гуморального иммунного ответа в организме при злокачественном новообразовании доказано многочисленными данными о выявлении в крови циркулирующих антител к ОАА (Stockert Е. et al., 1998; Smith М., 2007). Антитела к антигенным детерминантам плазматической мембраны клеток неоплазм могут выполнять двоякую функцию: быть цитолитическими или стимулировать рост опухолей (Jager Е. et al., 1999; Balkwill F., Mantovani A., 2001). Это зависит от природы антител, числа специфических антигенных детерминант на клеточной мембране, физических и химических свойств мембран клеток. Цитолитические антитела обладают способностью разрушать опухолевые клетки. Обработанные антителами клетки опухоли подвергаются фагоцитозу (Atanackovic D. et al., 2004). В тех случаях, если противоопухолевые антитела связываются с антигенными детерминантами, фактически защищая опухолевую клетку от цитотоксического воздействия клеток-киллеров, то они тем самым, стимулируют ее дальнейший рост. Специфические противоопухолевые антитела относятся к иммуноглобулинам классов G и М (Smorodin Е.Р. et al., 1997). Полагают, что именно с ними связано появление блокирующих свойств сыворотки, хотя имеются данные о том, что и IgA тоже могут блокировать иммунные реакции. О существовании блокирующих или усиливающих рост опухоли антител судят на основании косвенных доказательств. Так, абсорбция антител и сыворотки аутологичными опухолевыми клетками усиливает проявление клеточно-опосредованных реакций лимфоцитов в ее присутствии, а добавление противоопухолевой антисыворотки может стимулировать рост опухоли (Balkwill F., Mantovani А., 2001; Atanackovic D. etal., 2004).
Патогистологическая характеристика операционного материала больных
Объектом исследования служила периферическая кровь 301 человека, из них 93 больных РЛ, 77 больных ТЛ, 71 больная РМЖ, 60 женщин с ЛФМ и 57 здоровых лиц, не имеющих в анамнезе указаний на онкологические заболевания. Центральная форма РЛ диагностирована у 61(66%), а периферическая - у 32(34%) пациентов. По результатам патогистологического изучения резецированного материала плоскоклеточный рак легкого диагностирован у 56 (60%) человек, аденокарцинома - у 37 (40%) больных. У пациенток с РМЖ по гистологическому строению был выявлен инфильтративный протоковый рак.
Женщины с локальной формой мастопатии были взяты в качестве группы сравнения для женщин с РМЖ, так как ЛФМ представляет собой доброкачественную опухоль молочной железы, которую удаляют, так как на ее фоне может развиваться РМЖ (Струков А.И., Серов В.В., 1985). Кроме того, формирование группы с ЛФМ было связано с тем, что наша работа проводилась слепым методом, мы не знали заранее диагноз болезни и поэтому попадали в исследование больные с ЛФМ.
Больные туберкулезом легких также были взяты в качестве группы сравнения. Эту группу составили больные без дисплазии и с дисплазией бронхиального эпителия, при последней, особенно ее тяжелой степени, возрастает опасность малигнизации (Струков А.И. и др., 1990). По результатам клинико-рентгенологического и патогистологического исследований были диагностированы следующие формы ТЛ: туберкулема у 41 (53,2%), инфильтративная - у 20 (26%) и фиброзно-кавернозная - у 16 (20,8%) больных.
Изучение фенотипа МНК и их функциональной активности у больных со злокачественными новообразованиями проводили до химио-, лучевой терапии и до операции, в том числе и при отсутствии какой-либо предоперационной терапии. Все исследования проводились слепым методом. Обследовали больных, находящихся на лечении в торакальном отделении, в III онкологическом отделении Городской клинической больницы №1 и Городской специализированной туберкулезной больницы №1 г. Новосибирска. Количественное определение популяций и субпопуляций лимфоцитов осуществляли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серии ИКО, произведенных НПЦ «Медбиоспектр» (г. Москва) согласно прилагаемым рекомендациям. В работе использованы: ИКО 90(CD3+)- маркеры зрелых Т- лимфоцитов, ИКО 86(CD4+)- маркеры Т- хелперов/индукторов, ИК031(СВ8+)-маркеры Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов, ИКО 180(CD20+)- маркеры В - лимфоцитов, ИКО 116(CD16+)- маркеры натуральных киллеров, HKO160(CD95+)- маркеры клеток, имеющих FAS- антиген, HKO105(CD25+)- маркеры клеток, имеющих рецептор к ИЛ-2, HK092(CD71+)- маркеры клеток, имеющих рецептор к трансферрину, HKO20(CD38+)- маркеры активированных Т - и В- клеток. Последние четыре маркера являются маркерами активированных МНК. Кровь из вены забирали в центрифужную пробирку, содержащую 25 ЕД гепарина на 1 мл крови, и тщательно перемешивали так, чтобы не образовывались сгустки. Мононуклеарные клетки выделяли в градиенте плотности фиколл-верографин (плотность 1.077 г/мл) центрифугированием при 400 g в течение 40-45 минут. Собранные из интерфазы мононуклеары дважды отмывали раствором Хенкса. Затем к клеточному осадку добавляли 350 мкл среды 199 или RPMI-1640 и тщательно ресуспендировали. Полученную клеточную взвесь разливали в пластиковые пробирки по 50 мкл, после чего вносили по 20 мкл рабочего раствора моноклональных антител и инкубировали 30 минут при комнатной температуре, затем проводили отмывку. Далее вносили 20 мкл фрагментов антител к иммуноглобулинам мыши, меченых ФИТЦ, и продолжали инкубацию еще 30 минут. По окончании инкубации клетки дважды отмывали раствором Хенкса. Из каждой пробирки брали 10 мкл клеточного осадка, помещали на предметное стекло и покрывали покровным стеклом. Подсчет клеток производили с нефлюоресцирующей масляной иммерсией на микроскопе ЛЮМАМ И-3 при объективе 90х, окуляре 5х. Определяли также ИРИ = CD4/CD8.
В венозной крови, в которой определяли относительное содержание МНК, подсчитывали абсолютное количество лимфоцитов и формулу крови, затем вычисляли абсолютное количество лимфоцитов и на этой основе определяли абсолютное количество популяций и субпопуляций МНК.
Фенотип мононуклеарных клеток и их ответ на фетальные протеины у больных со злокачественными новообразованиями
При сопоставлении данных с патогистологическими параметрами было обнаружено, что при количестве низкодифференцированных клеток в опухоли 30% и менее положительные по ИРИ реакции (снижение ИРИ на 10% и более после инкубации клеток с ФП) наблюдались у 23 человек (74%), а при более высоком содержании низкодифференцированных клеток в опухоли - у 13 больных (42%), т.е. достоверно реже (р = 0,02 по критерию Фишера).
Кроме числа низкодифференцированных клеток учитывали также степень злокачественности опухоли. Достоверные отличия были получены при сравнении относительного содержания МНК с фенотипом CD8 и ИРИ после инкубации МНК с ФП и без него в зависимости от степени злокачественности. Так, при III степени злокачественности относительное содержание CD8+ -лимфоцитов было достоверно ниже, чем при I-II степенях (17,38 ± 1,27 и 21,15 ± 1,02 соответственно, р 0,05). После инкубации МНК с ФП отмечалось статистически значимое повышение относительного содержания CD8+ - клеток у больных как с III, так и с 1-Й степенями злокачественности (25,19 ±2,01 и 26,48 ± 1,23 соответственно, р 0,001).
У больных с III степенью злокачественности ПРИ при инкубации МНК без ФП был достоверно выше (р 0,01), чем при I-II степенях (1,93 ± 0,18 и 1,49 ± 0,08 соответственно). После инкубации клеток с ФП произошло достоверное снижение ИРИ у больных с III степенью злокачественности опухоли (р = 0,0005) и, менее выраженное у больных с I-II степенями злокачественности (1,13 ± 0,08 и 1,33 ± 0,09 соответственно, р = 0,043).
В зависимости от наличия или отсутствия метастазов не было выявлено различий в частоте встречаемости положительных реакций на ФП по ИРИ и по клеткам с фенотипом CD8.
Следует отметить, что в ряде случаев интерпретация патогистологических данных, в частности, оценка варианта дифференцировки и степени злокачественности опухоли осложнялась проведенной ранее химио - и/или лучевой терапии. Поэтому было проведено сопоставление показателей реакции МНК на ФП с данными цитологического исследования, а также с данными патогистологического исследования операционного материала больных, не получавших лечения до операции.
При сравнении характера реагирования МНК на ФП и, соответственно, значений ИРИ с данными цитологического исследования было установлено, что только при высокодифференцированном варианте отмечалась позитивная реакция на ФП (ИРИ снижался с 1,65 ± 0.12 до 1,21 ± 0.09, р 0,001).
В общей группе больных оказалось 15 женщин с РМЖ, не получавших лучевую и химиотерапию до операции. Так же, как и указывалось выше, в тех случаях, когда число низкодифференцированных клеток в опухоли не превышало 30%, реакция на ФП отмечалась у 10 человек из 13, а при более высоком содержании низкодифференцированных клеток в опухоли в обоих случаях реакции не было. Кроме того, оказалось, что достоверное повышение числа МНК с фенотипом CD8 и снижение ИРИ после инкубации с ФП в среднем по группе происходило при I-II степенях злокачественности, при III степени подобной реакции не наблюдалось.
Таким образом, было установлено, что показатели реакции МНК на фетальные протеины у больных РМЖ, также как и у больных РЛ в значительной степени сопряжены с патогистологическими параметрами опухоли, в частности, с вариантом дифференцировки и степенью её злокачественности. Сравнение данных цитологического исследования в общей группе больных РМЖ и патогистологических данных в подгруппе не получавших лечение до операции с реакцией на ФП позволило подтвердить тот факт, что при более высокой степени дифференцировки и меньшей степени злокачественности опухоли значительно чаще наблюдалась реакция МНК на ФП.
Данные по относительному и абсолютному содержанию популяций лимфоцитов у больных РМЖ в зависимости от характера реакции МНК на ФП представлены в табл. 6.
Как видно из таблицы, у больных РМЖ при позитивной реакции МНК на ФП отмечается снижение относительного и абсолютного содержания МНК с фенотипом CD8, повышение относительного содержания с фенотипом CD95 и относительного и абсолютного содержания фенотипом CD71.
Таким образом, у больных со злокачественными заболеваниями, вне зависимости от локализации процесса, прослеживается общая тенденция по снижению относительного содержания популяций и субпопуляций МНК и активация иммунной системы только при позитивной реакции МНК на ФП.
При сопоставлении показателей популяций и субпопуляций МНК с патогистологической картиной видно (табл.7), что корреляционные связи могут быть как прямыми, так и обратными. Достоверно обратные корреляционные связи отмечаются у больных РЛ и РМЖ между содержанием субпопуляции МНК с фенотипом CD25 и митозами, патологическими митозами, степенью злокачественности, процентным содержанием НД клеток в опухоли.
В целом же, отмечена достоверно обратная корреляционная связь между клетками с маркерами активации (CD25+, CD71+, CD95+) и показателями, отражающими степень злокачественности опухоли, и достоверно прямая корреляционная связь между выше указанными субпопуляциями МНК и процентным содержанием ВД клеток в опухоли.
Прямая корреляционная связь выявлена между содержанием В - клеток (CD20+) и митозами, степенью злокачественности, процентным содержанием НД клеток и обратная корреляционная связь между указанными выше МНК и процентным содержанием ВД клеток в опухоли.
Содержание цитокинов и уровень антител к TNF-a у больных с онкологической патологией
Перерождение нормальной клетки в опухолевую происходит в несколько этапов, включающих изменения в структуре клеток (дезорганизация цитоскелета), метаболизме (появление несвойственных протеинкиназ, усиление активности гликолитических ферментов) и регуляторных процессах (трансформирующие ростовые факторы) (Якубовская Р.И., 2000; Daroui P. et al., 2004; Il yasova D., Schwartz G.G., 2005; Moore L.E., Wilson R.T., Campleman S.I., 2005; Bensaad K. et al., 2006). При канцерогенезе происходят значительные изменения антигенных свойств, как мембран, так и внутренних белков, особенно в связи с дезорганизацией цитоскелета. Одним из характерных признаков опухолевых клеток является появление в них опухолеассоциированных антигенов, не экспрессируемых в норме и способных вызывать ответную противоопухолевую иммунную реакцию организма (Татосян А.Г., 2004; Тюряева 2008; Rohrer J. et al., 1999; Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Seliger В., Maeuer M., Ferrone S., 2000; Wade M., Allday M.I., 2000).
Возникновение в организме клона малигнизированных клеток включает гомеостатические механизмы защитно-регуляторного характера. Наряду с цитотоксическими реакциями, направленными на элиминацию опухолевых клеток, в организме появляются сывороточные блокирующие факторы и клетки-супрессоры, тормозящие иммунное отторжение опухоли (Sakaguchi S., 2001; Van Der Bruggen P., 2002).
Злокачественные клетки, как и эмбриональные, обладают развившимся в филогенезе механизмом самозащиты от реакции со стороны иммунекомпетентных клеток собственного организма. Общим для клеток, участвующих как в онкогенезе, так и в эмбриогенезе, является способность маскировать антигенные структуры на своей поверхности; вообще злокачественной клетке присущ мозаицизм, сохранившихся признаков соответствующих зрелых клеток и вновь появившихся особенностей, характерных для эмбриональных клеток (Винницкий В.Б., 1990; Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004).
Важнейшими эффекторными звеньями противоопухолевого иммунитета являются натуральные киллеры, цитотоксические Т лимфоциты, макрофаги и цитокины. Нейтрофилы, если и не являются главными клетками организма, защищающими его от роста опухоли, то, по крайней мере, они играют важную роль в противоопухолевом иммунитете (Di Carlo Е. et al., 2001; Gargett С. et al., 2001; Heryanto B. et al., 2004; Lin Y. et al., 2006; Na Y. et al., 2006). Одной из причин роста и, соответственно, не отторжения опухоли может быть снижение или исчезновение у нейтрофилов способности ингибировать ее рост. Последнее, в свою очередь, зависит от пониженной способности Т-лимфоцитов у онкологических больных продуцировать IL-2, который обладает способностью активировать нейтрофилы (Симбирцев А.С., 1998; Телетаева Г.М., 2007).
Реакция макрофагов на опухоль имеет двойственный характер (Balkwill F., Mantovani А., 2001; Pollard J., 2004). Цитотоксические макрофаги способны фагоцитировать опухолевые клетки, оказывать антителозависимое и антителонезависимое цитотоксическое действие, продуцировать активные формы кислорода и фактор некроза опухоли. Взаимодействие макрофагов с опухолевыми клетками приводит к тому, что макрофаги начинают активно секретировать ростовые факторы для опухоли (Balkwill F., 2006; Biswas S. et al., 2006), простагландин E-2, подавляющий противоопухолевые иммунные реакции, и синтезировать протеазы, способствующие разрушению матрикса опухоли, слущиванию с поверхности опухолевых клеток фибронектина, что приводит к нарушению контактного торможения роста клеток и усилению метастазирования. Опухоль обладает широким арсеналом средств воздействия на иммунокомпетентные клетки организма, стимулируя иммуносупрессивные факторы, подавляя синтез необходимых цитокинов и снижая наработку цитотоксических Т- лимфоцитов (Закеева И.П. и др., 2007; Zhong L. et al., 2008). Поэтому и иммунотерапия до сих пор находится в стадии поиска эффективных методов воздействия на опухолевый процесс. Онкогерминативная гипотеза, суть которой состоит в том, что злокачественная опухоль - это гетерогенное многоклеточное образование, развившееся в результате партеногенетического размножения иммортальнои онкогерминативной клетки и представляющее собой пародированный зародыш на стадии бластоцисты, более полно объясняет биологическую природу феномена развития злокачественных опухолей. Обнаружение общей природы бластоцисты и онкосфероида делает понятным феномен толерантности организма к развивающемуся новообразованию, так как эта толерантность филогенетически обусловлена. С позиции онкогерминативной теории становятся объяснимы данные об общности маркеров опухолей и беременности (Винницкий В.Б., 1996; Кайряк О.В., 1996; Mapara М., Sykes М., 2004).
При онкогенезе, также как и при эмбриогенезе, в крови появляются блокирующие факторы, препятствующие взаимодействию лимфоцитов с неоплазмой. Роль сывороточных блокаторов выполняют преимущественно антитела, которые, адсорбируясь на клетках опухоли, защищают ее от цитотоксического действия макрофагов и Т- лимфоцитов (Smorodin Е.Р. et al., 1997; Stockert Е. et al.,1998; Jager E. et al., 1999; Balkwill F., 2001; Atanackovic D. et al., 2004). Поэтому связывание блокирующих антител может привести к реализации цитотоксического действия на опухоль Т-лимфоцитов (Пак Н.А. и др., 1997), но только в тех случаях, когда реакция клеток на ФП приводит к повышению относительного содержания МНК с фенотипом CD8, являющегося маркером киллерных клеток (Ройт А. и др., 2000).
Как показали результаты исследования, повышение относительного содержания МНК с фенотипом CD8 после их инкубации с ФП, отмечающееся у больных раком легкого и раком молочной железы, а также при дисплазиях бронхиального эпителия II и III степеней отражало как преобладание высокодифференцированных клеток в опухоли, так и появление клеточного атипизма. Кроме того, позитивная реакция МНК на ФП сопровождалась повышенными уровнями антител к провоспалительным цитокинам и к опухолеассоциированным антигенам (Аутеншлюс А.И. и др., 1999).
Сопряженность позитивной реакции МНК на ФП с высокодифференцированным вариантом опухоли объясняется тем, что апоптоз клеток при высокодифференцированных вариантах опухолей протекает более интенсивно, чем при других вариантах дифференцировки, при этом идет высвобождение ОАА с развитием клеточного и гуморального иммунного ответа (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001)
Результаты наших исследований показали, что не только в случаях злокачественных новообразований, но и при дисплазиях гуморальные факторы выполняют протективную функцию. Одни могут блокировать антигенные детерминанты на поверхности опухолей (AT к ОАА), не позволяя антигенреактивным МНК с фенотипом CD8 осуществлять свою функциональную активность, другие - связывать провоспалительные цитокины, в том числе, TNF-a, причем повышенные уровни антител к этому цитокину, отмечающиеся при высокодифференцированных вариантах опухолей и дисплазиях, защищают опухоль и атипичные клетки от повреждающего воздействия некротизирующего фактора. И в то же время, антитела к опухолеассоциированным антигенам, препятствуя действию цитотоксических клеток и макрофагов, предотвращают слущивание с поверхности опухоли ее клеток и этим замедляют метастазирование (Струков А.И. и др., 1990; Абдурахмонов Ю.Б. и др., 2007).
