Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1.
МОНОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ
ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ) 13
Гепатотропные вирусы и клеточный иммунитет 13
Роль иммунной системы в осуществлении противовирусной защиты 17
Значение отдельных субпопуляций мононуклеарных клеток в осуществлении противовирусного ответа 22
Функциональная метаболическая активность мононуклеарных клеток в реализации противовирусного иммунитета 27
Современные противовирусные препараты и особенности противовирусного иммунитета 31
Возможности прогнозирования успеха противовирусной терапии
на современном этапе 36
ГЛАВА 2.
КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ 39
ГЛАВА 3.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 56
Клиническое исследование 56
Препараты, использованные для фармакологических нагрузок
in vivo 57
Пункционная биопсия печени 58
Определение относительного и абсолютного числа отдельных видов лейкоцитов периферической крови 58
Цитохимическое исследование: методы определения ферментов и биологически активных веществ в мононуклеарных клетках периферической крови 59
Выделение чистых культур мононуклеарных клеток и их стандартизация 61
Определение субпопуляционного состава мононуклеарных клеток периферической крови при помощи моноклональных антител ...' 62
ГЛАВА 4.
СОСТОЯНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ
ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ
(СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ) 65
4.1. Субпопуляционный состав мононуклеарных клеток при
хронических вирусных заболеваниях печени 65
Экспрессия основных CD-антигенов мононуклеарами периферической крови 65
Функциональная активность мононуклеарных клеток периферической крови у больных хроническими вирусными заболеваниями печени 75
Влияние интерферона-а in vivo на субпопуляционный состав и функциональную метаболическую мононуклеарных клеток периферической крови у больных хроническими вирусными заболеваниями печени 81
Влияние интерферона-а на общее количество лейкоцитов периферической крови у больных хроническими вирусными заболеваниями печени 81
Влияние интерферона-а на субпопуляционный
состав лимфоцитов периферической крови больных хроническими
вирусными гепатитами 82
4.1.3.3. Влияние интерферона-а на метаболическую активность
4
мононуклеарных клеток периферической крови больных
хроническими вирусными гепатитами 83
Динамика субпопуляционного состава и метаболической активности мононуклеарных клеток периферической крови у больных хроническим вирусным гепатитом 84
Определение субпопуляционного состава и функциональной метаболической активности мононуклеарных клеток периферической крови после первого введения препаратов интерферона-а, как метод прогнозирования эффективности ПВТ у больных хроническим вирусным гепатитом 107
4.1.5.1. Влияние однократного введения ИФН-а на общее количество
лейкоцитов периферической крови и возможности прогнозирования
с помощью этих изменений результатов ПВТ 107
4.1.5.2. Дифференцированное влияние однократного введения
интерферона-а на экспрессию CD-антигенов мононуклеарными
клетками периферической крови и возможность прогнозирования
вирусологического ответа 109
4.1.5.3. Дифференцированное влияние первого введения интерферона-а
на функциональную метаболическую активность мононуклеарных
клеток периферической крови и возможность прогнозирования
результатов противовирусной терапии ПО
ОБСУЖДЕНИЕ 113
ВЫВОДЫ 128
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 130
БИБЛИОГРАФИЯ 131
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
CD - рецепторы - кластерные детерминанты НВ V - вирус гепатита В HCV - вирус гепатита С HDV - вирус гепатита D
HLA - главный комплекс гистосовместимости Ig - иммуноглобулин
NK - естественные (натуральные) клетки-киллеры Th - Т-лимфоциты-хелперы TNF-a - фактор некроза опухоли-а АлАТ - аланиновая аминотрансфераза Гл - гликоген
ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИГА - индекс гистологической активности ИЛ - интерлейкин ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон К - коэффициент
КВО - конечный вирусологический ответ или вирусологический ответ по окончании терапии
КИО - коэффициент иммунного ответа КФ - кислая фосфатаза Л - лимфоциты М - моноциты
МВС - мезенхимально-воспалительныи синдром ME - международная единица МКА - моноклональные антитела МНК - мононуклеарные клетки Мф - макрофаги
ОКЛ - общее количество лейкоцитов
ПВТ - противовирусная терапия
ПегИФН-а - пегилированный интерферон-а
ПМЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РВО - ранний вирусологический ответ
РНК - рибонуклеиновая кислота
СЦП - средний цитохимический показатель
УВО - устойчивый вирусологический ответ
ФИТЦ - флюоресцеин-изотиоцианат
ХВГ - хронический вирусный гепатит
ХВЗП - хронические вирусные заболевания печени
ХГ - хронический вирусный гепатит
ХГ В - хронический вирусный гепатит В
ХГ С - хронический вирусный гепатит С
ХГ D - хронический вирусный гепатит D
ХГ-mixt - хронический вирусный гепатит со смешанным инфицированием
ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы
ЦП - цирроз печени
ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время хронические вирусные заболевания печени являются одной из актуальных проблем медицины. Это связано как с особенностями самого заболевания, характеризующегося высоким риском заражения и различными путями передачи, широким распространением среди трудоспособного населения, прогредиентным течением и, нередко, неблагоприятным прогнозом для больного, так и с недостаточной эффективностью современных методов противовирусной терапии [25, 47, 50, 59, 160, 194]. По данным Европейской ассоциации по изучению печени, вирус гепатита С является причиной 70% случаев хронического вирусного гепатита, 40% - цирроза печени и 60% - печёночно-клеточного рака в мире. Вирусом гепатита С инфицировано более 170 миллионов человек [30, 39, 120]. Серологические маркёры перенесённой HBV-инфекции имеют место примерно у 30% населения земного шара, а 350 миллионов людей являются хроническими носителями HBV, в Российской Федерации насчитывается более 5 миллионов носителей HBV. По данным ВОЗ, ежегодно регистрируется примерно 50 миллионов человек, заболевших гепатитом В. На долю молодого возраста приходится 90% от общего числа больных ХВЗП. Каждый год более 1 миллиона человек умирает от хронических заболеваний печени, включая цирроз и гепатоцеллюлярную карциному [2, 34, 127, 153].
Иммунная система обеспечивает индивидуальность и целостность организма. При формировании хронической инфекции персистирующие вирусы гепатита для обеспечения собственного выживания используют пути, позволяющие им избежать защитных реакций иммунной системы, способны изменять соотношение между ростовым и апоптозным потенциалом иммунокомпетентных клеток [14, 31, 35, 132]. Развитие недостаточного иммунного ответа на вирусные антигены может быть одним из основных факторов, способствующих вирусной персистенции. Кроме того, инфицированные мононуклеарные клетки представляют собой дополнительный резервуар инфекции, что также способствует дли-
8 тельной персистенции вирусов в организме [25, 69]. Нарушения клеточного звена иммунитета в этом контексте относятся к числу патогенетически значимых в условиях вирусного поражения. При этом субпопуляционный состав мононук-лерных клеток (Т- и В- лимфоцитов и моноцитов, NK-клеток) периферической крови и их функциональная активность у больных с патологией печени изучены недостаточно.
Значительная распространённость хронических вирусных заболеваний печени, высокий риск хронизации процесса, опасность развития ГИК, а также высокая скорость репродукции и уникальная генетическая гетерогенность вирусов гепатита обусловливают необходимость максимально ранней противовирусной терапии, разработки рациональных подходов к лечению этой патологии с использованием наиболее эффективных схем ПВТ. В то же время остаются малоизученными вопросы влияния разных схем противовирусной терапии на субпопуляционный состав МНК периферической крови и возможность использования показателей субпопуляций мононуклеаров как предикторов эффективности ПВТ.
Определение особенностей функционирования мононуклеарных клеток периферической крови и изменения их субпопуляционного состава и метаболической активности на фоне разных схем противовирусной терапии при заболеваниях печени представляет несомненный теоретический и практический интерес, так как, с одной стороны, позволит уточнить некоторые механизмы нарушения клеточного звена иммунитета у больных с хронической вирусной патологией печени, а, с другой, обогатит арсенал практических врачей новыми критериями тяжести патологического процесса, способами патогенетической терапии.
Цель исследования
Определение клинико-диагностического значения субпопуляционного состава и функциональной метаболической активности мононуклеарных клеток
9 периферической крови при хронических вирусных заболеваниях печени и обоснование возможностей фармакологической коррекции выявленных нарушений.
Задачи исследования:
Изучить субпопуляционный состав мононуклеарных клеток периферической крови больных с хроническими заболеваниями печени различной этиологии до лечения, через 3 и 6 месяцев противовирусной терапии.
Определить содержание гликогена и активность кислой фосфатазы в мононуклеарных клетках периферической крови больных с хроническими заболеваниями печени до лечения, через 3 и 6 месяцев противовирусной терапии.
Установить особенности изменения субпопуляционного состава мононуклеарных клеток, содержания в них гликогена и активности кислой фосфатазы на фоне первого введения препарата интерферона-а у больных с учётом вида патологии печени и результатов противовирусной терапии хронических вирусных гепатитов.
Изучить динамику субпопуляционного состава мононуклеарных клеток, содержания гликогена и активности кислой фосфатазы при хронических вирусных гепатитах на фоне разных схем противовирусной терапии.
Разработать прогностические критерии эффективности противовирусной терапии хронических вирусных гепатитов на основе данных об изменении субпопуляций мононуклеарных клеток, содержания в них гликогена и активности кислой фосфатазы на фоне первого введения интерферона-а.
Научная новизна работы
Впервые на большом клиническом материале при хронических заболеваниях печени проведено комплексное изучение количественного и качественного состава мононуклеарных клеток периферической крови, содержания в них гликогена и активности кислой фосфатазы. Установлено снижение CD4+, CD 16+ и
10 CD25+ клеток, повышение CD8+ и CD95+ МНК на фоне изменения функциональной метаболической активности мононуклеаров — снижение содержания гликогена и повышение активности кислой фосфатазы — у больных ХГ и ЦП. Показаны более низкие уровни CD4+, CD 16+, CD25+-icneTOK и высокие показатели экспрессии CD95+ МНК при ЦП с классом С по Child-Pugh по сравнению с классами А и В. Представлена зависимость отдельных субпопуляций МНК и их функциональная активность от выраженности основных клинико-биохимических синдромов, этиологии заболевания. Впервые показано снижение уровня CD4+, CD16+ и CD25+ МНК, повышение экспрессии CD8+ и CD95+ -антигенов на фоне низкого содержания Гл и высокой активности КФ у больных с репликативной фазой HBV по сравнению с пациентами без репликации вируса. Впервые получены данные об изменении субпопуляционного состава и функциональной метаболической активности МНК периферической крови больных хроническими вирусными гепатитами на фоне первой инъекции ИФН-а. На основании данных по первому введению ИФН-а впервые разработаны прогностические критерии эффективности ПВТ у больных ХГ С и ХГ В в зависимости от изменения соотношения CD4+/CD8+. Показано, что снижение гликогена более, чем в 2 раза и возрастание активности КФ на фоне первого введения ИФН-а является предиктором вирусологического ответа при ХГ В и ХГ С. Впервые показано, что при позитивном ответе на ПВТ происходит значительная положительная динамика субпопуляционного состава и функциональной активности МНК. Установлено стимулирующее влияние ИФН-а на показатели экспрессии CD4+, CD 16+, CD25+ -антигенов и уровень гликогена в МНК и снижение экспрессии CD8+, CD95+ клетками с одновременным уменьшением активности КФ в мононуклеарах периферической крови при ХГ С. У больных хроническим гепатитом С установлено повышение уровня экспрессии CD4+, CD 16+, CD25+ и снижение CD8+, CD95+ -маркёров при содружественном увеличении содержания Гл и уменьшении активности КФ только у респондеров при монотерапии ИФН-а, при комбинации ИФН-а с рибавирином и у всех пациентов при комбинированной схеме ПВТ пегилированным ИФН-а в сочетании с рибавирином.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
снижение экспрессии CD4+, CD 16+, CD25+ -антигенов и повышение CD8+ и CD95+ -антигенов мононуклеарными клетками периферической крови у больных ХГ и ЦП;
уменьшение содержания гликогена и повышение активности кислой фосфатазы в мононуклеарньгх клетках периферической крови у больных ХГиЦП;
зависимость изменения субпопуляционного состава и метаболической активности мононуклеарных клеток от наличия или отсутствия репликации вируса гепатита В, а также от тяжести класса цирроза печени по Child-Pugh;
прогностически значимые изменения CD4+ и CD8+ лимфоцитов, уровня гликогена и активности кислой фосфатазы в мононуклеарных клетках периферической крови у больных ХГ на фоне первой инъекции интерфе-рона-а;
эффективность иммуномодулирующего влияния комбинированной терапии ИФН-а короткого действия или пегилированным ИФН-агь с рибави-рином у больных ХГ С, а также терапии ламивудином у больных ХГ В, по сравнению с монотерапией ИФН-а, реализуемая через изменение субпопуляционного состава и функциональной метаболической активности МНК периферической крови.
Научно-практическая значимость работы
Установленный факт взаимосвязи отдельных субпопуляций мононуклеарньгх клеток, содержания гликогена и активности кислой фосфатазы в МНК периферической крови с этиологической структурой и основными клинико-биохимическими синдромами хронического вирусного гепатита и цирроза печени может быть использован для целей диагностики, дифференциального диагноза и оценки тяжести заболевания печени у больных хроническим вирусным
12 гепатитом. Динамика субпопуляционного состава и метаболической активности мононуклеарных клеток периферической крови на фоне первого введения ин-терферона-а может позволять определить прогностические критерии эффективности противовирусного лечения. Сравнительная оценка динамики субпопуляционного состава МНК, содержания гликогена и активности кислой фосфатазы в мононуклеарах периферической крови при использовании разных схем противовирусной терапии служит дополнительным критерием определения наиболее эффективных видов лечения больных хроническими вирусными гепатитами В и С.
Практическое использование полученных результатов
Результаты исследования используются в практике работы гастроэнтерологических отделений ГУЗ «Краевой клинический центр специализированных видов медицинской помощи» и МУЗ «Городская клиническая больница №2» города Ставрополя. Основные положения диссертации используются в лекциях и на практических занятиях на кафедрах внутренних болезней №1 с курсом поликлинической терапии, внутренних болезней №2, пропедевтики внутренних болезней ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития».
Материалы диссертации изложены в 13 печатных работах, доложены на
VIII, IX, X, XI, XII итоговых научных конференциях молодых учёных и студентов (Ставрополь, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004); итоговой конференции по результатам конкурса на лучшую научную работу студентов 1999 года по разделу «Медицинские науки» ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 2000); VII,
IX Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 2002, 2003, 2004); VI, VIII Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2000, 2002). Апробация работы проведена на совместном заседании кафедр внутренних болезней №1 с курсом поликлинической терапии и пропедевтики внутренних болезней ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
