Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1: Активные формы кислорода (АФК). синтез, инактивация и гемосорбция (обзор литературы) 12
Супероксидный радикал (Ог"0 и его генератор (NADPH- оксидаза)... 12
Миелопероксидаза (МПО)... 17
Механизм каталитического действия МПО. 18
ОСГ- ключевой эффектор биоцидного действия МПО . 20
Индуцибельная NO-синтаза лейкоцитов 24
Лактоферрин (ЛФ) как потенциальный генератор НО*. 26
Деструктивная роль АФК лейкоцитов при воспалении 27
Молекулярные основы повреждающего действия АФК. 28
Окисление липидов в биомембранах под действием АФК лейкоцитов 29
Окислительная модификация белков под действием АФК 33
АФК как редокс-модуляторы функций клеток и компонентов гуморальных систем 36
Редокс-факторы — модуляторы клеточных функций. , 38
АФК - модификаторы гуморальных факторов воспаления 41
АФКиапоптоз 43
Участие АФК нейтрофилов в патологии. 44
Система антиоксидантной защиты организма. 46
Индукция АФК при эфферентных методах лечения. 51
CLASS ГЛАВА 2. Материалы и методы... 5 CLASS 4
2.L Общая структура работы 54
2.2. Природа гемосорбентов 54
2.3. Постановка экспериментов in vitro и учет активных форм кислорода (АФК) in vitro и in vivo 57
2.4. Гемоперфузия в экспериментах на животных 59
2.5. Гемоперфузия на фоне супероксиддисмутазы... 59
2.6. Гемоперфузия на фоне церулоплазмина.. . 61
2.7. Определение общего количества лейкоцитов крови 61
2.8 Определение ОСГ выделяемого нейтрофилами крови человека при контакте с гемосорбентами. ... 61
2.9. Определение продукция супероксид - анион радикала выделяемого нейтрофилами крови человека при контакте с гемосорбентами. 62
2.10. Рециркулирующая система для изучения связывания МПО сФН-агарозой 63
2.11. Статистическая обработка результатов 65
ГЛАВА 3. Оценка индуктивной активности сорбентов различной химической структуры в стендовых условиях . 66
3.1. Реактивность нейтрофильных лейкоцитов, выделенных на градиенте плотности 66
3.2. Реакция клеточных элементов цельной крови на контакт с сорбционными препаратами in vitro 69
3.3. Оценка индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам для гемосорбционных процедур 74
ГЛАВА 4. Способностъ сорбентов индуцировать генерацию активных форм кислорода (АФК) IN VTVO 77
4.1. Индукция АФК лейкоцитами крови морских свинок при гемоперфузии через различные сорбенты 78
4.2. Изменение динамики лейкоцитарного пула крови морских свинок в процессе гемоперфузии 81
ГЛАВА 5. Влияние антиоксидантов на пюцессы генерации активных форм кислорода при гемоперфузии IN VIVO . 88
5.1. Супероксиддисмутаза (СОД) как антиоксидантний препарат при эфферентной гемокоррекции 88
5.2. Церулоплазмин как антиоксидантный препарат при эфферентной гемокоррекции 90
ГЛАВА 6. Сорбент для удаления экстрацеллюлярнои МПО .. 97
Заключение 106
Выводы 112
Рекомендации по использованию научных выводов 113
Список литературы 114
- Супероксидный радикал (Ог"0 и его генератор (NADPH- оксидаза)...
- Постановка экспериментов in vitro и учет активных форм кислорода (АФК) in vitro и in vivo
- Индукция АФК лейкоцитами крови морских свинок при гемоперфузии через различные сорбенты
- Супероксиддисмутаза (СОД) как антиоксидантний препарат при эфферентной гемокоррекции
Введение к работе
7 трофилы одни из первых реагируют при контакте крови с гемосорбентом, запуская свои основные генераторы АФК - NADPH-оксидазу и миелоперокси-дазу (МПО). Включение при взаимодействии крови с гемоконтактными препаратами кислородзависимых биоцидных механизмов гранулоцитов с наработкой АФК может иметь как позитивные, так и негативные последствия для больного. Все зависит от общего антиоксидантного статуса, т.е. от баланса про- и антиоксидантов всех уровней. При пшерпродукции АФК лейкоцитами крови вследствие гемоконтактнои процедуры суммарный антиоксидантный статус будет сдвигаться в сторону усиления окислительных процессов. В данном случае процедуру гемоперфузии через сорбенты необходимо проводить «под прикрытием» антиоксидантов (СОД, церулоплазмин) либо использовать комбинированные гемосорбенты, составной частью которых являются препараты специфически фиксирующие макромолекулы - продуценты АФК (экстрацеллюлярная МПО) или стимуляторы АФК — продукции нейтрофиль-ными гранулоцитами. При отсутствии гиперпродукции АФК, образующиеся активные производные кислорода могут играть позитивную роль, принимая участие в редокс - регуляции клеточных функций (Янковский О.Ю-, Слепен-ков СБ., 1995; Зенков Н.К. и соавт., 2001).
Цель исследования. Показать наличие активации нейтрофилышх лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами медицинского назначения через индукцию специализированных кислородзависимых биоцидных систем, а так же предложить способ воздействия на контактную гиперпродукцию активных форм кислорода путем введения антиоксидантов во время гемоперфузии либо используя селективные гемосорбенты для удаления экстрацел-люлярных кислородмодифицирующих систем.
Задачи исследования:
Оценить влияние гемосорбентов различной химической структуры на индукцию генерации активных форм кислорода лейкоцитами крови при контакте с ними в условиях in vitro и in vivo.
Оценить влияние антиоксидантов (супероксиддисмутаза и це-
рулоплазмин) на изменение количества активных форм кислорода при гемоперфузии.
Проанализировать количественное соотношение наработки супероксидного радикала и гипохлорита при контакте нейтро-филов с гемосорбентами.
Охарактеризовать специфические свойства сорбента фибро-нектин-агароза для связывания экстрацеллюлярной миелопе-роксидазы.
Научная новизна.
Впервые проведена всесторонняя оценка влияния различных гемосорбентов на генерацию АФК лейкоцитами крови при контакте с ними как в стендовых условиях, так и в экспериментах на животных. Показана индуктивная активность сорбентов в цельной крови и в безсывороточной среде, которая зависит от их химической структуры. На основании полученных результатов предложен способ определения биосовместимости гемосорбентов с учетом индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам (Патент РФ №2122734, 1998).
Впервые исследовано влияние антиоксидантов (СОД и ЦП) на изменение количества АФК, генерируемых лейкоцитами крови в процессе контакта крови с гемосорбентами. Показана специфичность воздействия антиоксидантов на факторы, запускающие и поддерживающие процесс генерализованного воспаления, то есть на активные производные кислорода. В большей степени нейтрализующий эффект характерен для СОД. На основании выпол-
ненных исследований предложен способ проведения гемосорбции на фоне инфузии антиоксидантных препаратов (Патент РФ №2137508,1999).
Впервые выполнены исследования по количественной оценке продуктов активации NADPH-оксидазной и миелопероксидазной систем нейтрофи-лов при их контакте с гемосорбентами.
Охарактеризованы селективные сорбционные свойства иммобилизованного на агарозу 4Б ФН в отношении жидкофазной МПО. Высказано предположение о возможности использования сорбента ФН — агароза для элиминации экстрацеллюлярной МПО - источника реактивиых, производных кислорода (гипогалоидов и свободных радикалов).
Теоретическое и практическое значение работы. Работа является экспериментальным исследованием, которое вносит вклад в изучение прикладной научной проблемы связанной с исследованием биосовместимости гемоконтактных материалов медицинского назначения: Работа расширяет теоретические представления об участии нейтрофильных лейкоцитов крови в запуске кислородмодифицирующих систем клетки в возможном создании дисбаланса в системе антиоксиданты - прооксиданты в сторону последних на уровне целостного организма при гемоконтактной процедуре. С теоретических позиций проведенные в работе эксперименты in vivo могут служить основой при создании экспериментальной модели для изучения синдрома системного ответа на воспаление (Systemic Inflamatory Response Syndrome — SIRS) и компенсаторного ответа организма на генерализованное воспаление (Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome - CARS). Результаты исследования расширяют представления о генезе процессов, разворачивающихся в результате гемоконтактной процедуры на поверхности сорбентов и в перфузируемой крови и связанных с активацией кислородзависимых био-цидных систем нейтрофильных лейкоцитов. В работе проанализирован спектр и количественные характеристики активных производных кислорода, что дает возможность предполагать появление определенных интермедиатов
кислорода при гемоперфузии через различные виды гемосорбентов и целенаправленно воздействовать на них в случае гиперпродукции.
С точки зрения практической значимости в работе предложено два варианта проведения гемоперфузии с целью снижения негативных последствий гиперпродукции АФК. Во-первых, это проведение гемосорбции на фоне постоянного введения антиоксидантов - супероксиддисмутазы и церулоплаз-мина. Второе, — предложено использование селективного гемосорбента фиб-ронектин — агароза, который специфически связывает и удаляет из циркуляции экстрацеллюлярную МПО — продуцента одного из наиболее агрессивных интермедиатов - НОСІ.
Выполненное исследование позволит разработать оптимальные схемы проведения гемосорбции с учетом общего антиоксидантного статуса больного.
Основные положения выносимые на защиту.
Контакт лейкоцитов крови с гемосорбентами приводит к индукции генерации клетками активных форм кислорода, степень выраженности которой зависит от химической природы сорбента и условии проведения экспериментов in vitro и in vivo,
Проведение гемоперфузии у животных на фоне постоянного введения антиоксидантов (супероксиддисмутаза и церулоплазмин) приводит к снижению люминол-зависимой хемилюминесценции крови, что более выражено при инфузии супероксиддисмутазы
Взаимодействие нейтрофильных лейкоцитов с гранулами сорбентов сопровождается активацией кислородзависимых биоцидных систем клеток (NADPH - оксидазы и миелопероксидазы), степень выраженности которой связана с химической структурой гранул.
Селективный сорбент фибронектин — агароза специфически связывает экстрацеллюлярную миелопероксидазу.
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы были представлены на:
Научной конференции в честь 280-летия 1ВМКГ «Актуальные проблемы военно-морской и клинической медицины», - СПб, 1995; I Всероссийском Конгрессе по патофизиологии, - М., 1996; Ш Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов, - СПб, 1996; Международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты», - СПб, 1999; Научной конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», - СПб, 2001; Научной конференции «Дни иммунологии в Санкт - Петербурге -2001», - СПб, 2001; Научной конференции «Механизмы типовых патологических процессов», -СПб, 2003.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в центральных журналах и 3 патента на изобретение.
Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на 139 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, из 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и рекомендаций по использованию научных выводов. Библиография включает 251 источников, из которых 42 отечественных и 209 зарубежных. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 5 таблицами.
Супероксидный радикал (Ог"0 и его генератор (NADPH- оксидаза)...
В арсенале защитных средств нейтрофилов наиболее высоким разрушительным потенциалом обладают факторы кислородзависимой биоцидной системы. Именно эти химически активные агенты, гарантирующие уничтожение фагоцитом многих форм патогенных организмов, играют доминирующую роль в развитии деструктивных процессов в зоне воспаления. Перечень таких субстанций, продуцируемых лейкоцитами, включает весь спектр интермедиатов восстановления О2 (Ог , Н2О2, НО-), его возбужденные формы (]Ог — синглетный кислород) и некоторые другие реактивные агенты, условно включаемые в состав АФК, например, НОСІ [Зенков Н.К. и соавт., 1993]. Весь спектр образующихся лейкоцитами АФК является продуктом деятельности NADPH-оксидазы и МПО. К АФК также относят и окись азота, хотя образование N0 осуществляется по принципиально иному механизму и генерировать NO- способны многие другие типы клеток [Реутов BJL и соавт., 1995, Moncada S. et al., 1991]. Однако, продукт его взаимодействия с Ог", т.е. OONO-, значительно превосходящий N0 по разрушительным свойствам, так же можно отнести к АФК по тем же критериям, что и HOCL Поэтому в перечень генераторов АФК, продуцируемых лейкоцитами, все же следует включить и так называемую индуцибельную NO-синтазу, активируемую в ответ на стимуляцию этих клеток провоспалительными иммуномодуляторами [Янковский О.Ю., 2000]. Следует отметить, что аналогичным лейкоцит-стимулирующим действием обладают и АФК в нецитотоксических концентрациях [Янковский О.Ю., Слепенков СВ., 1995].
Супероксидный радикал (Ог ) и его генератор (NADPH — оксидаза).
Первичным продуктом кислородзависимой биоцидной системы лейкоцитов является супероксидный радикал - Oj . В основе его антимикробного и повреждающего действия лежит то обстоятельство, что Ог выступает в роли как хорошего восстановителя (Е10СУО2 = -0,33 В), так и сильного окислителя (Е Ог /НгОг = + 0,89 В). Время жизни этого радикала в биологическом материале составляет Ю-6, что определяет радиус его действия около 0,3 мкм. Мембранотропный эффект этого радикала реализуется преимущественно его протонированной формой - НОг, обладающей и более пролонгированным временем жизни (10"3сек) и радиусом действия (10 мкм) [Sawyer D.T., 1988]. Однако в физиологических условиях (рН7,4) доля Н02 составляет лишь 0,25 Ус-Генератором Ог в лейкоцитах служит фермент NADPH-оксидаза, использующий в качестве источника восстановительных эквивалентов для Ог продукт гексозомонофосфатного пути -NADPH... По уточненным современным данным [Jones O.T.G. et. al., 1993], этот фермент представлен низкопотенциальным цитохромом Ь, состоящим из двух субъединиц: а(22 Ша) и (3(91 kDa), и обладающим FAD-связывающим участком в тяжелой субъединице. В отличие от большинства известных электронтранспортных цепей организация NADPH-оксидазы не требует участия убихинона для трансформации двухэлектронного переноса с пиридиннуклеотида на одноэлектронный в цитохроме. С другой стороны, есть много данных в пользу участия убихинона в продукции клеткой Ог [Crowford D.R. et al., 1982]. Интересной особенностью NADPH-оксидазы является и то обстоятельство, что в окружении его простетической группы стабилизируется новый редокс-потенциал пары CV02 . В противном случае, обычный потенциал этой пары не обеспечил бы окисление низкопотенциального цитохрома молекулярным Ог Простейший механизм генерации Ог" NADPH-оксидазой может быть представлена следующей схемой:
NADPH - FAD -+ 2 цит.Ь - 202 - 202 Специфичность фермента к его субстратам и кофакторам (по параметру Км) характеризуется следующими значениями: FAD - 60 нМ (FMN - более ЮмМ); NADPH - 0,05 мМ (NADH - 1,0 мМ); Ог - 0,03мМ [Babior В.М., 1985]. Молекулярная активность NADPH-оксидазы по числу оборотов в отношение восстановления ( составляет 1000 - 2000 мин 1 [ВаЫог В.М. et al., 1988, Black C.D.V. et. at, 1991]. Данное значение Км для ( от момента активации клетки реализуется в течение 1-3 минут, после чего наступает более пролонгированная фаза продукции СЬ", характеризующаяся значением Км, равным 0,004мМ. Благодаря этой фазе обеспечивается эффективность продукции данного радикала даже на поздних этапах развития воспалительного процесса. Концентрация ( в этих условиях достигает 12мкМ [Babior В.М. et al., 1988], Внутри же фагосомы концентрация кислорода составляет 11,2±3,4мкМ даже в аэробных условиях [James Р.Е. et. al., 1995]. В целом 1 млн стимулированных нейтрофилов генерирует 1мкмоль/ч радикалов CV, что составляет около 200млн QT в 1 сек на один нейтрофил.
Поскольку цитохром Ь д45 всегда локализован на поверхности мембраны, а источник электронов для него - в цитозоле, то активация NADPH-оксидазы ведет к деполяризации мембраны [Korchak Н.М. et. al., 1978, Schumann M.A. et. al.r 1995]. Для удаления из цитозоля Н (в качестве противоио-нов) NADPH-оксидаза ассоциирована с протонными каналами. Причем, как активность фермента, так и гГ-каналов сопряжены общей регуляцией арахи-доновой кислотой, что обеспечивает стехиометрию процесса (подкисление области функционирования 02 ): 8 ИҐ710 02 [Clark R.A. et. al., 1987, Jones O.T.G; et. al., 1993]. В физиологических условиях это соотношение ионов полностью соответствует эквивалентности их концентрационных активностей [Jones O.T.G. et. al., 1993].
Постановка экспериментов in vitro и учет активных форм кислорода (АФК) in vitro и in vivo
Постановку реакции in vitro проводили по следующей схеме [Yonemara М. et.al., 1989]:
1. У донора брали венозную кровь в пробирку с гепарином в объеме 8,0 мл. Далее в работе использовали либо цельную кровь, либо выделенную на градиенте плотности фиколл - верографина фракцию нейтрофильных лейкоцитов.
2. Выделение нейтрофилов: Для выделения нейтрофилов венозную кровь забирали в пробирку с 3 мл полиглюкина с гепарином. Реактивы: Полиглюкин Гепарин, 5000 ед Фиколл - верографиновая среда с градиентом плотности 1,077 Среда Хэнкса, рН 7,4 NaCl, 1,8% раствор
Кровь отстаивали в течение 60 мин при температуре 25 С. Слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, наслаивали на 2 мл среды с градиентом плотности и центрифугировали в течение 35 мин при 1500 обУмин.
После центрифугирования удаляли верхний слой плазмы и среду. На дне пробирки оставался осадок нейтрофилов и немного эритроцитов.
К осадку нейтрофилов с эритроцитами добавляли 2 мл воды и ровно через 30 секунд добавляли 2 мл 1,8 % раствора NaCl и перемешивали. Центрифугировали в течение 5 минут при 1000 об ./мин, супернатант сливали, а нейтрофилы ресуспендировали в 1 мл среды Хэнкса и подсчитывали количество клеток.
3. В цельной крови подсчитывали количество лейкоцитов в 1 мм3. В наших экспериментах расчет индекса активации производили, учитывая количество полиморфноядерных лейкоцитов ( НФ), так как эти клетки вносят основной вклад в генерацию АФК. Количество выделенных на градиенте плотности нейтрофилов доводили до 106 клеток в 1 мл среды
4. Инкубацию крови (клеток) с сорбентами проводили непосредственно в кюветах люминометра.
В кювету люминометра вносили: - 100 мкл сорбента; - 100 мкл гепаринизированной крови донора или взвеси клеток; -100 мкл раствора люминола; - 700 мкл раствора Хэнкса без фенолового красного.
5. Параллельно ставили контрольную пробу без сорбента для оценки спонтанной ХЛ, соответственно увеличив объем раствора Хэнкса до 800 мкл.
6. Учет реакции проводили на люминометре LKB - Wallac 1251 (Швеция) в термостатируемом режиме (t=37C) при постоянном перемешивании содержимого кювет с автоматическим учетом результатов на компьютере, который управлял работой люминометра. Показатели ХЛ в каждой кювете регистрировали с интервалами в 40 секунд. Общее время просчета пробы - 60 мин.
7. В пробах регистрировали максимальный уровень ХЛ (Max(mV), время развития пика реакции (t (min) и интегральный показатель активации клеток - светосумму (LS). Уровень активации клеток в ответ на их контакт с сорбентами оценивали индексом ХЛ, который представляет собой отношение светосуммы ХЛ к количеству нейтрофилов в 1 мм крови, умноженное на 1000 (LS/ NPHxlOOO).
Гемоперфузию in vivo проводили на морских свинках. Общую схему эксперимента можно представить следующим образом (рис 2.1). Животных в/б наркотизировали нембуталом из расчета 30-50 мг/кг. Свертывающую систему крови блокировали гепарином в дозе 500 Ед/кг. Подключение экстракорпорального контура осуществляли по схеме артерия - вена. Для под-ключения внешнего контура катетеризировали общую сонную артерию и наружную яремную вену. В экстракорпоральный контур включали колонки с различными сорбентами. Объем колонок составлял 2,0 мл сорбента. Скорость гемоциркуляции в контуре задавали перистальтическим насосом, которая соответствовала 20 мл/час. Продолжительность гемоперфузии 1 час. В среднем объем гемоперфузии составлял 1 ОЦК. При проведении эксперимента делали заборы крови для регистрации различных параметров. Артериальную кровь брали до гемоперфузии, через 30 и 60 мин после начала ге-мосорбции (до колонки и после нее), через 1 и 2 часа после завершения процедуры из артериального катетера.
Опыты с использованием антиоксиданта проводили на морских свинках по той же схеме как и предыдущие эксперименты. В качестве гемо-контактного препарата была выбрана Агароза 4Б, имеющая наибольший из всех ранее исследованных препаратов реактогенный потенциал в качестве индуктора АФК лейкоцитами крови. СОД растворяли в 2 мл физиологического раствора с гепарином и подавали на колонку перистальтическим насосом со скоростью 2 мл/ч в течение всей процедуры гемоперфузии. Доза вводимого препарата составляла 50 м кг на кг массы животного. Результаты оценивали по тем же параметрам, что и в предыдущих экспериментах.
Опыты с использованием антиоксиданта проводили на морских свинках по той же схеме как и предыдущие эксперименты. В качестве гемо-контактного препарата использовалась Агароза 4Б. Церулоплазмин растворяли в 2 мл физиологического раствора с гепарином и подавали на колонку перистальтическим насосом со скоростью 2 мл/ч в течение всей процедуры гемоперфузии. Доза вводимого препарата составляла 1250 мкг на кг массы животного. Результаты оценивали по тем же параметрам, что и в предыдущих экспериментах.
Индукция АФК лейкоцитами крови морских свинок при гемоперфузии через различные сорбенты
В данном разделе работы оценивали изменение индекса ХЛ в процессе гемоперфузии у животных в спонтанном и индуцированном (форболмери-статацетатом ФМА) режимах.
Результаты выполненного исследования представлены на рисунке 4.1. Полученные данные свидетельствуют о том, что гемоперфузия крови сопровождается выраженной активацией клеток при применении любых из использованных сорбентов (р 0,01 по критерию Вилкоксона). Причем, разные типы сорбентов характеризуются различной индуцибельной активностью в отношении генерации АФК. Все исследованные препараты можно разделить на 3 группы: производные полисахаридов (Агароза 4Б, Агароза-БСА, Имасорб А-700, Сфероцел и ГПА), на основе поливинилового спирта (ПВС-1, ПВС-2) и угольные (СКН-2К, СКТ-6А, ФАС). В каждой группе можно выделить как высокореактогенные сорбенты, так и с более низкой индуцибельной активностью для клеток крови. Среди гранулированных углей наиболее реактогенным оказался СКТ-6А, что характерно в пробах крови до и после колонки. Препараты на основе ПВС оказывают активирующее действие на лейкоциты сопоставимое с воздействием угольных сорбентов, хотя к концу гемоперфузии отмечается тенденция к усилению их индуцибельной активности во всех пробах крови. Наиболее существенные изменения индекса ХЛ наблюдаются в группе полисахаридных препаратов.
Контакт крови с агарозной матрицей вызывает наибольшую активацию лейкоцитов в пробах крови, взятых непосредственно после колонки. Значительное увеличение индекса ХЛ при контакте с этим материалом наблюдается и в системном кровотоке (до колонки). Модификация агарозы путем ко-валентной иммобилизации белковых структур (БСА и белок A S.aureus) приводит к изменению индуцибельной активности гемоконтактных препаратов. БСА, обладая большой степенью гомологии с альбуминами всех видов животных (очевидно, и морских свинок), маскирует реактогенные участки молекулы агарозы, снижая тем самым активацию клеточных и гуморальных систем крови. Реактогенность препарата Агароза-БСА ниже по сравнению с Агарозой 4Б во всех пробах крови. Белок A S. aureus, который является активным лигандом препарата Имасорб А-700, прочно связывает иммуноглобулины человека и многих видов животных (в том числе и морских свинок) в области Fc-фрагментов. Являясь компонентом клеточной оболочки микроорганизма, белок А представляет собой одну из чужеродных: структур, на которую обусловлена реакция нейтрофильных фагоцитов. Поэтому вполне закономерна повышенная активация лейкоцитов на иммобилизованный белок A S.aureus. Как показали эксперименты, на начальных этапах гемоперфузии индуцибельная активность Имасорба А-700 превышает индукцию АФК на чистой агарозе. В процессе гемоперфузии антигенные детерминанты белка А "прикрываются" аутоиммуноглобулиновыми молекулами морской свинки, приводя к снижению реактогенности препарата, что наблюдается в более поздних пробах крови. Противоположная картина характерна при гемоперфузии через ГПА. Низкая реактогенность препарата в начале гемо-сорбции с последующим увеличением индукции АФК в конце процедуры. Из апробированных сорбентов только Имасорб А-700 и ГПА обладают селективными сорбционными свойствами. ГПА специфически связывает и элиминирует из кровотока липопротеиды низкой плотности. Локальное многократное увеличение концентрации липопротеидов на сорбенте, очевидно, сдвигает индуцибельные характеристики модифицирующегося в процессе гемоперфузии препарата в сторону прооксидантной активности.
Приведенные данные указывают на вполне реальную перспективу создания более инертных (биосовместимых) носителей и селективных препаратов на их основе для гемосорбции. Следует обратить внимание на тот факт, что ХЛ клеток имеет место не только сразу после прохождения ими сорбента, но и перед колонкой (в системном кровотоке), что свидетельствует о возможности активации лейкоцитов и других клеток организма опосредовано, через факторы гуморальных систем плазмы. Естественно в первом случае уровень ее несколько выше.
Параллельно, наряду со спонтанной активацией, оценивали степень чувствительности лейкоцитов крови к действию ФМА, который шунтирует генерацию продукции АФК клетками через протеинкиназа С-зависимый путь [Jones O.T.G. et al.,1993]. Для наиболее наглядной иллюстрации сравнивали отношение индексов спонтанной и ФМА-индуцированной ХЛ, полученных во всех пробах крови, что представлено в таблице 4.1. Незначительное превышение уровня индуцированного с помощью ФМА свечения клеток, особенно в пробах крови, взятых непосредственно после колонки с сорбентом, свидетельствует о практически полной мобилизации клеточных систем АФК-продукции, опосредуемых через протеинкиназа С-механизм. Это указывает на возможность вовлечения в процесс активации клеток механизмов, реализующих свое действие преимущественно через адгезивные молекулы в качестве кофакторов стимуляции.
Супероксиддисмутаза (СОД) как антиоксидантний препарат при эфферентной гемокоррекции
Приведенные выше результаты исследований свидетельствуют о том, что гемоперфузия через любые сорбционные препараты in vivo в большей или меньшей степени сдвигает динамическое равновесие системы проокси-данты-антиоксиданты в сторону увеличения продукции АФК. Поэтому, наряду с разработкой и использованием наиболее биосовместимых сорбентов, применения тех или иных методов иммобилизации целевых лигандов, было бы целесообразно проведение гемосорбции на фоне антиоксидантной терапии. В качестве наиболее перспективного средства в настоящее время признана СОД. Действие этого фермента нацелено не только на инактивацию первичного продукта нейтрофилов - O-f» но и определяет также прерывание цепи образования других АФК [Halliwell В. et al.,1992].
Функция СОД сводится к катализу реакции дисмутации, в результате которой супероксидный радикал 0{ переходит в более стабильное и менее реакционноспособное состояние при физиологических условиях - Н2О2. Так как основным продуктом активации нейтрофилов при гемоперфузии является, очевидно, Ог, применение СОД при эфферентных методах лечения будет патогенетически обосновано. Это положение иллюстрируется при анализе результатов проведенных экспериментов (табл. 5.1).
Проведение гемосорбции на фоне инфузии СОД приводит к снижению индексов ХЛ (спонтанной и индуцированной ФМА) практически на всех этапах регистрации АФК-продукции. На 30 мин гемоперфузии, регистрируемая АФК-активность в 2 раза ниже при использовании антиоксиданта в пробах крови до и после колонки. Аналогичное снижение индексов ХЛ отмечается и на 60 мин процедуры в пробах после прохождения крови колонки с агарозой. Интересно отметить, что в эти же сроки в пробах крови взятых из системного кровотока (до колонки) индексы ХЛ в три раза ниже (р 0,05), чем у животных без СОД-терапии и практически соответствует уровню индексов ХЛ в контрольной группе. Незначительное снижение регистрации АФК отмечается и в пробах после окончания процедуры (1 и 2 часа). Отношения индексов ХЛ в спонтанной и наведенной ФМА пробах остается практически неизменным.
Это может свидетельствовать о том, что СОД, поступающая на колонку и в кровоток, не вмешивается в процесс активации лейкоцитов при контакте крови с сорбентом, а дисмутирует уже образовавшиеся в системе супероксидные радикалы, снижая уровень ХЛ.
Таким образом, применение СОД в процессе гемоперфузии через сорбенты приводит к инактивации АФК, что отражает индекс ХЛ. Антиокси-дантные препараты, и в частности СОД, могут быть рекомендованы для купирования процесса генерализованного воспаления, развивающегося в ходе гемоперфузии через сорбенты и, очевидно, при контакте крови с чужеродными поверхностями в экстракорпоральном контуре при использовании методов эфферентной терапии. В пользу этого свидетельствует огромный фактический материал 25-ти летнего использования препаратов этого фермента в противовоспалительной терапии.
Действие СОД направлено на первичный продукт активации нейтро-филов - Ог , но гемосорбция может вызвать сдвиг оксидантной системы и через миелопероксидазный катализ. Вот именно в этом случае можно использовать другой антиоксидант - церулоплазмин. По сравнению с другими сывороточными белками церулоплазмин на порядок эффективнее ингибиру-ет продукты миелопероксидазного катализа.
Церулоплазмин (ЦП) - медьсодержащая оксидаза (КФ 1.16.3Л.), гли-копротеин а2-глобулиновой фракции плазмы крови человека, содержит единственную полипептидную цепь с мм. 132 000 Да, включающую 1046 аминокислотных остатков. Молекула ЦП содержит 6-7 атомов меди, из которых 4 атома принадлежат каталитическому центру. Концентрация в плазме составляет 3 10"6 М (концентрация СОД составляет КО"10 М (Marklund S.L., Holme R,et.al., 1992)).
