Содержание к диссертации
Список сокращений 6
I ВВЕДЕНИЕ 8
II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 61
1. Выделение антигенов 62
1.1. Выделение липопротеидов 62
1.1.1. Выделение ЛНП из плазмы крови человека.
1.1.1.1. Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия.
1.1.1.2. Зональное ультрацентрифугирование.
1.1.1.3. Аффинная хроматография.
1Л .2. Выделение Лп(а).
1.1.2.1. Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией..
1.1.2.2. Аффинная хроматография.
1.1.3. Получение ЛВП и делипидированной плазмы.
1.2. Очистка препарата IgG человека 66
2. Получение антител 67
2.1. Получение поликлональных антител 67
2.1.1. Иммунизация животных.
2.1.2. Выделение ПкАт к ЛНП.
2.1.3. Выделение ПкАт к Лп(а).
2.1.3.1. Получение моноспецифической антисыворотки.
2.1.3.2. Очистка антител.
2.1.4. Препаративная очистка ПкАт.
2.2. Получение моноклональных антител (МкАт) 69
2.2.1. Гибридизация и скрининг гибридомных клеток.
2.2.2. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости.
2.2.3. Выделение МкАтиз культуральной жидкости.
2.2.4. Препаративная очистка МкАт.
3. Синтез аффинных сорбентов 71
3.1. Активация матриц 71
3.1.1. Активация бромцианом.
3.1.2. Периодатное окисление.
3.2. Иммобилизация белков 72
3.2.1. Иммобилизация липопротеидов
3.2.2. Иммобилизация антител.
3.3. Синтез сорбентов для процедур терапевтического афереза. 73
4. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов 73
4.1. Метод колоночной хроматографии 73
4.2. «Batch» метод 74
5. Анализ чистоты и специфичности белков 74
5.1. Электрофоретические методы - 74
5.1.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
5.1.2. Электрофорез в геле агарозы.
5.2. Иммунологические методы 76
5.2.1. Метод двойной радиальной иммунодиффузии.
5.2.2. Иммуноэлектрофорез.
5.2.3. Иммуноблотинг.
5.3. Аналитическое ультрацентрифугирование 77
6. Методы определения концентрации белков липидов 77
6.1. Иммуноферментные методы 77
6.1.1. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой.
6.1.2. Определение концентрации антител к ЛНП.
6.1.3. Определение концентрации антител к Лп(а).
6.1.4. Определение концентрации антител к IgG.
6.1.5. Определение концентрации Лп(а) в плазме (сыворотке) крови человека.
6.1.6. Определение титра антител к иммуноглобулинам барана или мыши в плазме крови человека.
6.2. Определение концентрации Лп(а) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини 80
6.3. Определение концентрации апоВ в плазме крови 81
6.4.Определение концентрации иммуноглобулинов G в плазме крови человека 81
6.5. Определение концентрации суммарного белка 81
6.6. Определение концентрации холестерина 82
6.7. Определение концентрации холестерина в клетках 82
7. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели 82
7.1. Получение образцов органных и клеточных культуры аорты человека 82
7.2. Культивирование короткоживущей органной и клеточной культур из аорты человека 83
7.3. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели 83
8. Микроскопическое исследование матриц 83
9. Контроль качества при производстве колонок для клинического применения 83
9.1. Определение стерильности 83
9.2. Испытание на пирогенность 84
9.2.1. Испытание на пирогенность на кроликах.
9.2.2. Испытание на пирогенность с использованием ЛАЛ теста.
9.3. Контроль частиц сефарозы в смывах с колонок 86
9.4. Определение свободного белка в смывах с сорбента 87
10. Проведение процедуры афереза с использованием
иммуносорбционных колонок 88
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 90
Иммуносорбенты для ЛНП афереза 90
Выделение и характеристика антигена- ЛНП плазмы
крови человека 91
Иммуносорбент с ПкАт к ЛНП 97
1. Получение ПкАт к ЛНП.
2. Характеристика ПкАт к ЛНП.
3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт для ЛНП афереза.
Иммуносорбент с моноклональными антителами к ЛНП... 107
1. Получение и характеристика МкАт к ЛНП.
2. Свойства иммуносорбентов с МкАт к ЛНП.
3. Синтез иммуносорбента с МкАт для клинического применения.
Доказательство эффективности ЛНП афереза в опытах in
vitro 124
Синтез и характеристика иммуносорбента для
гемосорбции 128
1. Выбор матрицы для гемосорбции.
2. Синтез и характеристика гемосовместимого сорбента для ЛНП афереза.
Сравнение сорбентов для ЛНП афереза 138
1. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах плазмосорбции.
2. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах гемосорбции.
Результаты использования иммуносорбентов для ЛНП
афереза в клинике 159
Иммуносорбент для Лп(а) афереза 168
Выделение и характеристика препарата Лп(а) 168
Получение и характеристика ПкАт барана к Лп(а)
человека 173
Синтез и свойства иммуносорбента с ПкАт к Лп(а)
человека 177
Специфический Лп(а) аферез - новый подход к экстракор
поральной коррекции повышенного уровня Лп(а) 184
Проведение процедур сочетанного ЛНП и Лп(а) афереза... 191 Сорбент с иммобилизованными ЛНП плазмы крови
человека 194
Изучение эффекта «атерогенности» при помощи сорбента
с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека 195
Клиническое применение сорбента с иммобилизованными
ЛНП плазмы крови человека 201
Иммуносорбент для афереза иммуноглобулинов у
больных дилатационной кардиомиопатией 206
4.1. Выделение и характеристика препарата IgG человека 207
4.2. Получение и характеристика ПкАт барана против IgG человека 210
4.3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт против
IgG человека 211
4.4. Разработка дизайна процедур Ig афереза с
использованием колонок с анти-Ig сорбентом 218
4.5. Первый опыт лечения больных ДКМП методом
иммуносорбции на колонках «Ig Адсопак»® 223
5. Вопросы безопасности и технология производства
аффинных колонок для терапевтического афереза 230
V ЗАКЛЮЧЕНИЕ 237
VI ВЫВОДЫ 242
VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 246
VIII ПРИЛОЖЕНИЯ 280
Введение к работе
История вопроса и актуальность проблемы. Появление и накопление в крови человека различных патогенных веществ приводит к возникновению и развитию многих заболеваний. Такими веществами могут быть: аутоантитела, циркулирующие иммунные комплексы, атерогенные липопротеиды, эндогенные и экзогенные токсины, прионы, вирусы, и микроорганизмы. Их полное удаление или снижение концентрации, как правило, дает положительный клинический эффект. В частности, одной из задач терапии атеросклероза, связанного с нарушением липидного обмена, является снижение концентрации атерогенных апоВюо-содержащих липопротеидов в крови пациента. Основное направление терапии при аутоиммунных заболеваниях - удаление патогенных аутоантител или антигенов.
Традиционным подходом к лечению в ситуациях, когда необходимо снизить концентрацию тех или иных веществ, является лекарственная терапия. Однако, в ряде случаев, она имеет ограничения в применении. Кроме того, для некоторых патологий, лекарства, эффективно снижающие концентрацию патогенных веществ в крови, отсутствуют. Поэтому поиск и разработка новых эффективных способов снижения концентрации и выведения их из крови больных с использованием современных методов биохимии, иммунологии, молекулярной биологии и биотехнологии до сих пор остается актуальной задачей.
Существует много методов экстракорпорального очищения крови. Согласно классификации, предложенной в 1990 году Borberg, указанные методы можно разделить по степени специфичности удаления патогенного компонента. Значительная часть методов относится к сорбционным технологиям, то есть базируется на использовании различных сорбентов.
Рис L Иерархия специфичнее и
различиъкк мет&дое терапевтического
афереза.
Наиболее простым методом является плазмаферез, при котором часть циркулирующей плазмы больного удаляется и замешается раствором альбумина, донорской плазмой или кристаляоидными растворами.
Плазмаферез широко и успешно используется и в настоящее время, особенно лри острых ситуациях. Вместе с гем, специфичностью этот метод не обладает. На рисунке 1 представлена иерархия специфичности различных жсфакорпорахішнх методов. Следующие в пирамиде специфичности методы, основанные на принципах фильтрации, осаждения иди ионообменной хроматографии, используются достаточно широко, но тоже имеют высокий процент неепещирииеекого удаления различных компонентов крови. Максимальную специфичность можно достичь при использовании аффинных сорбентов, особенно при использовании выеокоспецифичных белок-белковых взаимодействий типа: фермент-субстрат; лйганд-рецептор, пептшышганд, антиген-антитело. В основе работы аффинных сорбентов используется принцип хроматографии по сродству. Работа в области создания въкокоепетифичиых аффинных сорбентов привела к созданию иммуносорбентов (ИС) для клинического применения, которые занимают место на вершине иерархии специфичности (рис Л).
В русскоязычной литературе существует много терминов, которые определяют область медицины:, в которой используются различные технологии очищения крови. Это «гемосорбцйя» и «гравитационная
хирургия крови» [Лопухин, 1978-1985], «эфферентная терапия» [Коетюченко. Гуревич, Соколов 2003], темокоррекция или «экстракорпоральная ї емокоррекідия» (те же авторы), «экстракорпоральные методы лечения» [Коновалов, 2001] В настоящей работе мы будем пользоваться термином «терапевтический аферез», потому что за годы. становления этой области термин Tlierapeuiie apberesis» стал общепризнанным в международной литературе.
Методы терапевтического афереха находят широкое применение в современной медицине. Накоплено немало примеров успешного применения еорбхшонных технологий для леч шя сердечно-сосудистых и
аутоиммунных заболеваний, печеночной недостаточности, в акушерстве и гинекологии, при трансплантации органон, в дерматологии, онкологии, ревматологии, при острой интоксикации и инфекции организма (рис,2.)
Сердечно-сосудистыеN
ч ч №§оп&здши$? ; гинекология Ошад?к г«и
\ N
ШЩІНІВР ч - К 6 ю гдерз подю ч ШШШЩ ч. Дерматология /- -...- Рис 2 Пяктанш к применению сорбцттных технологий терапевтического афереш ДАЛ - диализ асссщииртанныи амгшоыдо В результате становления и развития этого направления медицины. стало очевидным, что разработка высокоспецифиниых сорбентов для клинического применения, которые могут быть успешно, безопасно и эффективно использованы ддя очистки крови имеет большое научно практическое значение. Наша работа посвящена созданию аффинных сорбентов для лечения больных с рефрактерными к иным видам терапии формами нарушений липидного обмена и дилатационной кардиомиопатией [ Покровский, 2004].
Пионерами в области сорбционных технологий очистки крови в России были Юрий Михайлович Лопухин и созданный им коллектив II МОЛГМИ им. Пирогова [ Лопухин, 1978; Лопухин и Молоденков, 1985]. В последнем абзаце книги «Холестериноз», вышедшей в 1983 году Юрий Михайлович Лопухин и соавторы писали: «Создание такого рода сорбентов (специфичных к ЛНП — примечание автора) позволит одномоментно удалять из крови почти полностью липопротеиды низкой плотности и таким образом способствовать выходу холестерина из клеток и тканевых депо. Эффективность подобного рода методов подтверждают и данные по использованию иммуносорбентов на апопротеиды липопротеидов низкой плотности в некоторых зарубежных клиниках. Вероятно, в ближайшем будущем именно на этом пути терапии атеросклероза клиницистов ждут наибольшие успехи» [Лопухин и др., 1983]. Фактически в то же время, в 1982 году, в КНЦ РАМН и была начата наша работа.
Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - создать новое поколение высокоспецифичных аффинных сорбентов для экстракорпорального удаления из крови человека патогенных веществ и исследовать особенности их применения при лечении больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, резистентными к лекарственной терапии.
Экспериментальные задачи:
1. Синтезировать, характеризовать и апробировать в клинике сорбент с моноспецифическими поликлональными (ПкАт) барана против липопротеидов низкой плотности (ЛНП) человека. Исследовать эффективность и безопасность использования такого сорбента в процедурах экстракорпорального удаления ЛНП (ЛНП аферез).
2. Получить и характеризовать панель моноклональных антител (МкАт) против ЛНП человека. Показать принципиальную возможность использования МкАт для синтеза иммуносорбентов с целью их применения в терапевтическом аферезе.
3. Создать in vitro модель ЛНП афереза и с помощью такой модели исследовать его эффективность на органной и клеточной культурах аорты человека.
4. Сравнить различные типы сорбентов для ЛНП афереза. Изучить особенности их взаимодействия с плазмой крови человека.
5. Исследовать связь липопротеида(а) [Лп(а)] с наличием и тяжестью атеросклеротических поражений артерий различных локализаций.
6. Синтезировать, характеризовать и провести клинические испытания иммуносорбента для специфического удаления из плазмы крови человека Лп(а). Изучить возможность и эффективность использования такого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным содержанием Лп(а).
7. Изучить возможность и особенности синтеза аффинных сорбентов с иммобилизованными антигенами на примере сорбента с ЛНП человека.
8. Синтезировать, характеризовать и показать принципиальную возможность использования иммуносорбента для удаления патогенных аутоантител из крови больных дилатационной кардиомиопатией в процедурах эктракорпорального удаления иммуноглобулинов человека (Ig аферез).
9. Разработать технологию создания колонок с аффинными сорбентами для процедур терапевтического афереза.
