Введение к работе
Актуальность темы. Спинальная и бульварная амиотрофия (СБМА) - редкая форма наследственной нервно-мышечной патологии, впервые описанная W. R. Kennedy в 1968 году. Она наследуется по Х-сцепленному рецессивному типу. СБМА характеризуется поздним дебютом на 3м - 4й десятилетии жизни, проявляющимся распространенными фасцикуляциями с постепенным развитием мышечной слабости и атрофии приемущественно проксимальных отделов конечностей. Через 10-20 лет от начала заболевания возникают контрактуры в суставах кистей рук и появляются бульварные симптомы (дисфагия, дисфония). Причиной СБМА Кеннеди является специфическая мутация в гене андрогенового рецептора (АР), картированного в области Xqll-12, характеризующаяся увеличением количества тринуклеотидных повторов (CAG) в начале гена, которую возможно эффективно детектировать, используя только молекулярно-генетические методы. Точной постановке диагноза придается особое значение не только из-за трудностей клинической диагностики СБМА, но также в связи с тем, что при других тяжелых нервно-мышечных заболеваниях (прежде всего при боковом амиотрофическом склерозе) могут наблюдаться сходные феногипические проявления. Важное значение приобретает доклиническая диагностика носительсгва этого заболевания среди детей и подростков.
Данное заболевание в России остается относительно малоизученным. Широкий круг педиатров, специалистов-неврологов и генетиков недостаточно знаком с особенностями клинического течения и диагностики СБМА. В России описаны не более 10 клинически верифицированных семейных случаев данного заболевания [Бадалян и др., 1987]. Эффективных методов лечения этого заболевания в настоящее время не существует. В связи с этим важное значение приобретает его профилактика, которая в настоящее время невозможна без медико-генетического консультирования семей с использованием ДНК диагностики. Особый интерес с точки зрения оценки рекуррентного риска представляет выявление гетерозиготного носительсгва мутации в гене АР у женщин. Методы молекулярно-генетической диагностики в принципе позволяют осуществлять пренатальную диагностику СБМА, в этом случае выявления мутации и своевременное прерьшании беременности может предотвратить рождение больного ребенка.
Обнаружение и исследование генов, мутации в которых приводят к развитию наследственных заболеваний человека, позволяет не только понять патогенетические механизмы возникновения этих заболеваний на молекулярно-генетическом уровне, но и разработать эффективные методы пренатальной диагностики, дифференциальной диагностики, медико-генетического прогноза и профилактики, в перспективе подойти к проблеме лечения.
Цель и задачи исследования. Цель работы - разработать и предложить для практического применения комплексную программу диагностики, медико-генетического прогноза и профилактики СБМА у детей и подростков на основе молекулярных методик исследования ДНК в сочетании с клиническими, биохимическими, ЭМГ и ЭНМГ методами исследования в семьях больных СБМА. При этом ставились следующие задачи:
-
Разработать методы ДНК-диагностики СБМА на основе известных методик определения количества CAG повторов в 1" экзоне гена андрогенового рецептора. Определить значимость молекулярно-генетических методов диагностики по отношению к традиционным клинико-генеологическим, бихимическим, ЭМГ и ЭНМГ методикам исследования СБМА.
-
Основываясь на результатах дифференциальной и пресимптоматической ДНК-диагностики, проанализировать ранние клинические и аддитивно-функциональные проявления СБМА.
-
Провести диагностику гетерозиготного носительства мутации в гене андрогенового рецептора у женщин, являющихся родственницами больных СБМА. Провести углубленное клиническо-генеалогическое, биохимическое, ЭМГ и ЭНМГ исследования гетерозиготных носительниц патологического гена для обнаружения возможных фенотипически-функциональньц проявлений СБМА.
-
Уточнить критерии дифференциальной диагностики СБМА с учетом молекулярно-генетических данных.
-
Разработать и внедрить в практику медико-генетическое консультирование семейных случаев СБМА. Исследовать морально-этические аспекты, связанные с пренатальной и доклинической диагностикой, профилактикой этого заболевания.
Научная новизна. Впервые разработан оригинальный метод, позволяющий точно определять количество CAG повторов в Vм экзоне гена АР без использования сложных методик сиквенирующего определения нуклеотидной последовательности. При помощи данного метода выявлено явление мейотической нестабильности в пределах одной семьи с СБМА, характеризующееся патологическим накоплением CAG повторов в 1ом экзоне андрогенового рецептора при передаче патологического гена от матери к сыну и уменьшением их при передаче дочери.
Впервые в отношении СБМА при клиническом исследовании был обнаружен синдром "бепокойных ног" у женщины. При помощи молекулярно-генетических методов установлено, что она является гетерозиготной носительницей мутации в 1ом экзоне гена АР. Используя дополнительные молекулярно-генетические методы исследования, было установлено, что возможным механизмом развития этого и других неврологических нарушении у женщин, являющихся гетерозиготными носителями мутации в 1ом экзоне гена АР, может служить несбалансированная лайокизация.
Практическая значимость. В ходе настоящей работы разработаны и внедрены в
клиническую практику эффективные молекулярно-генетические методы, позволяющие
проводить прямую диагностику в 100 /о случаев, пресимптоматическую диагностику,
диагностику гетерозиготного носительства, дифференциальную диагностику и в принципе
осуществлять пренатальную диагностику СБМА. Впервые разработаны и внедрены в
практическое здравоохранение основные принципы медико-генетического
консультирования семей с этой формой заболевания, основанные на результатах полученных при помощи молекулярно-генетических методик исследования ДНК.
Разработаны и внедрены в практику дополнительные молекулярно-генетические методы исследования ДНК женщин, позволяющие определять лайонизацию. Результаты, полученные при помощи данных методов, являются информативными в отношении
гетерозиготных носительниц мутации в гене АР, позволяют устанавливать причину развития денервационных нарушений, выявляемых только специальными ЭМГ и ЭНМГ исследованиями.
Положения выдвигаемые на защиту. В данной работе показано:
Молекулярно-генетические методы анализа ДНК, основанные на амплификации участка ДНК 5* области 1го экзона андрогенового рецептора позволяют максимально эффективно осуществлять диагностику СБМА (включая пресимптоматическую и пренатальную диагностику), диагностику гетерозиготного носительства заболевания у женщин, дифференциальную диагностику и эффективную профилактику СБМА, эффективно осуществлять медико-генетическое консультирование семей с этим заболеванием.
Молекулярный анализ CAG-повгоров фрагмента 1го экзона гена АР позволяет точно дифференцировать СБМА от других нервно-мышечных заболеваний, имеющих сходные фенотипические проявления, проводить пресимптоматическую диагностику, выявлять статус гетерозиготного носительства мутации в гене АР у женщин, а также в принципе осуществлять пренатальную диагаостику этого заболевания.
При помощи разработанного оригинального молекулярно-генетического метода количественного определения полиморфных CAG повторов установлено, что фрагмент ДНК гена АР 1го экзона содержит 20-26 тринуклеотидных повторов у здоровых лиц, 46-51 у больных СБМА. Впервые показано увеличение количества CAG повторов в одной семье при передаче гена от матери к сыну и уменьшение -при передачи от матери к дочери. Этот факт мейотической нестабильности позволяет предположить, что при СБМА также может наблюдаться явление антиципации, наблюдаемое при других наследственных заболеваниях, характеризующихся сходным типом мутации (болезни накопления тринуклеотидных повторов).
Методы ЭНМГ и ЭМГ-детекции электрических потенциалов поперечно-полосатой мускулатуры позволяет диагностировать состояние гетерозиготного носительства СБМА у женщин и являются информативными при диагностики наиболее ранних доклинических стадий развития денервационных нарушений, присущих СБМА, у потенциально больных.
При клиническом обследовании гетерозиготных носительниц мутации СБМА нами был обнаружен симптом "беспокойных ног" (Виттмака-Экбона), ранее не описанный в отношении СБМА. Преимущественная инактивация Х-хромосом не несущих мутации в гене АР у данной больной позволяет предполагать, что гетерозиготное носительство мутации при несбалансированной ланониэации Х-хромосом может быть причиной выявляемых нами клинических и функциональных нарушений.
Разработана комплексная программа обследования пациентов и диагностика СБМА основанная на молекулярно-генетических, клинико-генеалогических, биохимических, ЭМГ и ЭНМГ методах исследования. Молекулярно-генетические методы диагностики СБМА являются высоко эффективными и определяющими при проведении медико-генетического консультирования семейных случаев СБМА. В случае невозможности проведения ДНК диагностики могут быть рекомендованы электромиографические методы исследований.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 5ом рабочем совещании неврологов России и Германии (Санкт-Петербург, май 1995), кафедре иегтных болезней педиатрического факультета РГМУ (Москва, май 1996), кафедре клинической генетики ФУВ РГМУ (Москва, октябрь 1996), совместной научно-цитогенетической конференции НИИ детской гематологии, МГНЦ РАМН, РДКБ Министерства здравоохранения РФ (ноябрь 1996).
Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов клинико-генеалогического обследования, результатов молекулярно-генетических исследований, результатов биохимических исследований в семьях с спинальной и бульварной амитрофией, результатов электромиографических исследований, заключения и выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 27 рисунков; библиографический указатель содержит 143 источников, из них 12 отечественных и 131 зарубежных.
