Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 12
1.1. Генетика бронхиальной астмы. 12
1.1.1. Функции и локализация ангиотензин-превращающего фермента . 14
1.1.2. Глутатион-S- трансферазы и их роль в формировании БА. 17
1.1.2.1. Глутатион-Б-трансфераза класса М. 20
1.1.2.2. Глутатион-8-трансфераза класса Т(т). 21
1.1.2.3. Другие представители семейства глутатион- S - трансфераз. 22
1.1.3. Синтазы оксида азота и роль оксида азота в организме. 23
Глава 2. Материалы и методы. 27
2.1. Методы исследования 27
2.2. Клинические и лабораторные методы исследования 29
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования . 31
2.4. Математические методы исследования. 37
Результаты исследования. 39
ГЛАВА 3. Генетические особенности больных БА . 39
3.1. Анализ распределения генотипов глутатион-8-трансферазы Ml и глутатион-Б-трансферазы ТІ у больных БА и в популяции. 39
3.2. Анализ распределения генотипов по гену АСЕ у больных БА и в популяции . 41
3.3. Анализ распределения del.F508 у больных БА и в популяции. 43
3.4. Анализ полиморфизмов гена эндотелиальной N0 — синтазы у больных БА и в популяции. 43
3.5. Результаты исследования генетических сочетаний у больных БА. 44
Глава 4. Анализ генетических особенностей у больных БА в зависимости от тяжести течения заболевания . 50
4.1. Распределение генотипов по генам GSTT1 и GSTM1 в популяции и у больных БА в зависимости от тяжести течения заболевания. 50
4.2. Распределение генотипов по гену АСЕ в популяции и у больных Б А в зависимости от тяжести течения заболевания . 51
4.3. Распределение частоты генотипов по гену eNOS в популяции и у больных БА в зависимости от тяжести течения заболевания. 53
Глава 5. Корреляция генотипа и фенотипа у больных БА . 56
5.1.Сопутствующая аллергопатология у больных Б А. 56
Глава 6. Генетические особенности БА при контролируемом и неконтролируемом течении заболевания . 70
Заключение 83
Выводы 97
Практические рекомендации 98
Список литературы. 99
- Функции и локализация ангиотензин-превращающего фермента
- Молекулярно-генетические методы исследования
- Анализ распределения генотипов по гену АСЕ у больных БА и в популяции
- Распределение генотипов по гену АСЕ в популяции и у больных Б А в зависимости от тяжести течения заболевания
Введение к работе
Бронхиальная астма - актуальная проблема педиатрии и клинической медицины в целом. За последние годы во всем мире, в том числе России, отмечается увеличение заболеваемости бронхиальной астмой. Заболевание, возникшее в детском возрасте, часто продолжается в зрелом возрасте, приводит к снижению качества жизни, может явиться причиной инвалидизации, а иногда и гибели пациентов. Эпидемиологические исследования последних лет подтверждают высокую распространенность бронхиальной астмы у детей и взрослых, которая варьирует в среднем от 5 до 10% (Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика», 2006, Федосеев Г.Б., 1996; Чучалин А.Г., 1999; Чучалин А.Г. и др., 2000; 2004).
Бронхиальная астма относится к числу типичных заболеваний мультифакториальной, полигенной природы (Пузырев В.П., 2003). В результате проведенных семейных, близнецовых и генетико-эпидемиологических исследований была выявлена важная роль наследственности в возникновении бронхиальной астмы, в том числе ее атопической формы (Балаболкин И.И., 2003; Богорад А.Е., 2002; Каганов С.Ю., 1999; Геппе Н.А и др., 2008; Greally М. et al, 1982; Jenkins М.А et al., 1994; Laitinen T et al., 1998; Sibbald В., et al., 1979; SibbaldB., 1991; SkadhaugeL. R, 1999).
Среди генетических факторов, влияющих на формирование и течение астмы, можно выделить «главные» гены и гены-«модификаторы», гены-«кандидаты», взаимодействие которых определяет фенотипические особенности БА (Ober С. et al., 1998; Ober С. et al., 2000; Steinke J.W., et al., 2003). В многочисленных исследованиях показано, что «главными» факторами в развитии БА являются атопия (синтез IgE) и гиперреактивность дыхательных путей. В популяционных исследованиях показано, что влияние генетических факторов на развитие БА составляет, по крайней мере, 35-70% в зависимости от популяции и дизайна
исследования. Общее число генов, связанных с развитием астмы, точно не установлено, хотя в настоящее время считается, что их не меньше 30 (Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика», 2002). Помимо наследственных факторов, важное значение в развитии заболевания имеют неблагоприятные воздействия факторов окружающей среды. При воздействии ряда неблагоприятных факторов внешней среды происходит проникновение в дыхательные пути ксенобиотиков, что обусловливает изменения реактивности и нарастание сенсибилизации (Величковский Б.Т. 1991; 2000; Емельянов А.В., 1996; Каганов С.Ю., 1999). В условиях действия факторов, индуцирующих воспалительный процесс в дыхательных путях (аллергия, вирусные инфекции, поллютанты окружающей среды, воздействие компонентов табачного дыма, профессиональных токсинов и др.), может создаться порочный круг взаимного потенцирования воспаления и десенситизации Р-адренергической рецепции, ведущий к развитию и прогрессированию гиперреактивности дыхательных путей, а, следовательно, и утяжелению течения БА (Геппе Н.А и др., 2008). Поэтому изучение полиморфизма генов системы детоксикации ксенобиотиков - суперсемейства глутатион-8-трансфераз (GSTT1, GSTM1) является актуальным. В немногочисленных работах, посвященных изучению ассоциативной связи полиморфизма генов системы детоксикации ксенобиотиков, была показана их важная роль в формировании хронического бронхита, рака легких, тяжелого течения муковисцидоза и бронхиальной астмы (Худолей В.В., 1999; Иващенко Т.Э. и др., 2001; Желенина Л.А и др., 2003; Сиделева О.Г. и др., 2001; Сиделева О.Г. 2002; Райе Р.Х. и др., 2003; Brockmoller J. et.al., 1996; Carrol W.D., et al, 2005; Saadat M. et al., 2007). Гены, аллельные варианты которых предрасполагают к развитию определенных заболеваний, получили название генов «предрасположенности» (predisposition gene). Среди генов «предрасположенности» можно выделить несколько групп генов: гены
«метаболизма» или гены системы детоксикации, гены мембранных рецепторов, а также гены-«трштеры», исполняющие роль своеобразных «шунтов» в каскаде жизненно важных биохимических реакций. Среди генов-«триггеров» большое значение имеют гены эндотелиальной синтазы оксида азота - eNO синтазы и ангиотензин превращающего фермента — АСЕ (Невзорова В.А и др., 1997; Харитонов С.А. и др., 1997).
Как и при всех воспалительных процессах, при аллергическом воспалении возникает оксидативный стресс. Одним из маркеров оксидативного стресса является оксид азота (N0) - важный биологический медиатор, который вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. Оксид азота участвует в реализации таких важных физиологических функций, как вазодилатация, нейротрансмиссия, снижение агрегации тромбоцитов, реакции иммунной системы, регуляция тонуса гладких мышц, состояние памяти и др. (Lowenstein С J. et al., 1994; Moncada S., 1997; Nakaki Т., 1994; Snyder S.H., 1993). Известно, что NO усиливает воспалительные изменения в дыхательных путях при астме (Barnes P.J., 1995). В последние годы появляется все больше данных о способности N0 оказывать влияние на иммунную систему и воспалительный ответ. Оксид азота угнетает активность Th-І клеток, способствуя развитию ТЪ2-ответа (Ashutosh К., 2000, Ferreira Н.Н, 1998). Изучение роли полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы в генезе БА, приведет к углублению знаний о патогенезе бронхиальной астмы.
В последние годы изучается роль полиморфизма гена ангиотензин превращающего фермента (АСЕ), участвующего в метаболизме брадикинина и других биологически активных субстанций, в формировании хронических неспецифических заболеваний легких. Несомненный интерес представляет факт появления повышенной мышечной активности у людей с полиморфизмом гена АСЕ VI, что может иметь значение в патогенезе течения БА (Williams A.G. et al., 2000).
Роль аллельного полиморфизма генов «предрасположенности» у детей, больных атопической БА в настоящее время не ясна, так как недостаточно изучена. Практически нет работ, посвященных исследованию ассоциативной связи нарушений в системе генов «предрасположенности» и течением БА у детей, не изучены фенотипические особенности БА при аллельном полиморфизме генов GSTT1, GSTM1, АСЕ, eNOS.
Поэтому представляется актуальным изучение фенотипических особенностей атопической бронхиальной астмы у детей с вариантами полиморфизма генов «предрасположенности», что позволит прогнозировать течение заболевания и проводить целенаправленную терапию и профилактику болезни.
Цель исследования.
Изучить фенотипические особенности бронхиальной астмы у детей, обусловленные влиянием полиморфизма генов «предрасположенности», кодирующих ферменты системы детоксикации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1, гена ангиотензин превращающего фермента и гена эндотелиальной синтазы оксида азота для совершенствования диагностики и оптимизации терапии. Задачи исследования:
1.Изучить особенности аллельного полиморфизма генов GSTT1, GSTM1 и их ассоциативную связь при бронхиальной астме у детей.
2.Изучить особенности течения бронхиальной астмы при аллельном полиморфизме гена eNOS.
3.Оценить возможную ассоциативную связь аллельного полиморфизма генов АСЕ с тяжестью течения бронхиальной астмы.
4.Определить особенности формирования и течения бронхиальной астмы при различных генотипах и их ассоциациях.
5.Провести сравнительную оценку генотипов бронхиальной астмы в структуре «атопической» болезни и вне структуры «атопической» болезни.
б.Изучить взаимосвязь вариантов полиморфизма генов «предрасположенности» с различной степенью контроля над бронхиальной астмой.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.Распределение генов GSTT1 и GSTM1 у детей с бронхиальной астмой отличается от популяционных, причем ассоциация GSTT1-, GSTM1-является важной составной частью генетической структуры, предрасполагающей к развитию бронхиальной астмы.
2.В патогенезе тяжелого течения бронхиальной астмы неблагоприятную роль играет ассоциация полиморфизма по гену eNOS 5\5 и генотипа GSTT1-/GSTM1-.
3.Генотип GSTT1+/GSTM1+ в ассоциации с генотипом АСЕ I/I является протективным фактором в возникновении бронхиальной астмы. 4.Фенотипы бронхиальной астмы во многом определяются аллельным полиморфизмом генов - «предрасположенности» и их ассоциаций. 5.Контроль над бронхиальной астмой зависит от аллельного полиморфизма генов - «предрасположенности» и их ассоциаций.
Научная новизна.
Впервые проведена клинико-генетическая оценка риска возникновения, тяжести течения и прогноза бронхиальной астмы у детей в зависимости от полиморфизма генов - «предрасположенности» и их ассоциаций. Впервые установлено потенцирующее действие генотипа eNOS 5/5 для носителей нулевых аллелей по GSTT1 и GSTM1 в возникновении бронхиальной астмы. Впервые выявлена протективная роль генотипа GSTT1+/GSTM1+ в сочетании с генотипом I/I по гену АСЕ, препятствующая формированию бронхиальной астмы.
Впервые установлено значение полиморфизма генов, кодирующих ферменты
детоксикации ксенобиотиков, в формировании сенсибилизации у детей,
больных бронхиальной астмой.
Впервые выявлены варианты генетических ассоциаций у больных с
различными фенотипами бронхиальной астмы: астмы в структуре и вне
структуры «атопической» болезни».
Впервые, на основе клинико-генетического анализа, предложена
дифференциально-диагностическая таблица фенотипических вариантов
бронхиальной астмы у детей, позволяющая индивидуализировать терапию и
прогнозировать тяжесть течения заболевания.
Впервые установлены аллельные полиморфизмы генов
«предрасположенности» при контролируемой и плохо контролируемой
бронхиальной астме.
Новые данные, полученные в результате исследования, дополнят
представления о роли генов- «модификаторов» в патогенезе бронхиальной
астмы у детей.
Практическая значимость.
Разработана дифференциально-диагностическая таблица фенотипов бронхиальной астмы, позволяющая индивидуализировать терапию и профилактику заболевания с учетом выделенных фенотипических групп.
Показана целесообразность определения аллельных вариантов генов GSTT1, GSTM1, АСЕ, eNOS для выявления различных фенотипов бронхиальной астмы у детей, отличающихся по тяжести течения и ответу на противовоспалительную базисную терапию. Апробация и внедрение результатов.
Результаты научных исследований внедрены в работу пульмонологического отделения СПбГПМА, пульмонологического отделения
ДГБ Св. Ольги, аллергологического отделения ДГБ №1, амбулаторно-поликлинического отделения СПбГПМА, работу районных аллергологических кабинетов. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах аллергологии и клинической фармакологии ФПК и ПП, кафедре педиатрии с курсом перинатологии и эндокринологии ФПК и ПП СПбГПМА. Материалы диссертации доложены на заседании 16-го Национального конгресса по болезням органов дыхания (Казань, Россия, 2007), на конгрессе «Актуальные проблемы педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2007), Европейском респираторном конгрессе (Берлин, 2008), различных Российских и региональных конференциях.
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 200 литературных источников (отечественных и зарубежных). Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирована 53 таблицами, 7 рисунками.
Личный вклад автора
Автором составлена программа и разработан протокол исследования, проведены отбор и осмотры обследуемых детей, разработана дифференциально-диагностическая таблица для выявления фенотипов бронхиальной астмы и оптимизации схем профилактики и терапии бронхиальной астмы. Доля участия автора в работе с протоколом, сборе материала диссертации, осмотре обследуемых детей — 100%, в анализе и обобщении материала - 90%.
Функции и локализация ангиотензин-превращающего фермента
Ангиотензин превращающий фермент(АСЕ), пептидил-дипептидаза А, хорошо известен как фермент, регулирующий кровяное давление. Ведущая роль АСЕ в регуляции артериального давления (АД) подтверждается успешным использованием ингибиторов АСЕ при терапии гипертензий различного генеза, а также состояний, сопровождающихся спазмом сосудов и ишемией тканей (Havelka J., et al., 1982; Morris BJ.,1996; Celentano A., et.al.,1998; Butler R., 2000; Nui. T. et.al , 2002; Di Pasquale P., et al. , 2005). Участие в регуляции АД - это основная, но не единственная функция АСЕ. Данный фермент вовлечен в целый ряд процессов, протекающих в организме; его функция определяется локализацией, а также воздействием на регуляторные пептиды. Фермент располагается в плазматической мембране различных клеток эндотелиальных, специализированных эпителиальных, клеток, находящихся в местах интенсивного всасывания или выделения жидкости и солей, нейроэпителиальных, на нервных окончаниях, в клетках мононуклеарного ряда, а также в репродуктивных opraHax(Skidgel R.A., Erdos F.G.., 1987; Hooper T.L, Stepherson L.W., 1991). Относительно недавно было выявлено, что АСЕ является компонентом тканей, богатых фибриллярным коллагеном: матрикс сердечных клапанов, рубцы, образующиеся в результате инфаркта миокарда, и др., и что его содержание повышается с усилением фиброза (Sun Y. et al., 1993). Предполагается, что АСЕ может оказывать влияние на состав внеклеточного матрикса, в частности на синтез коллагена (Wilke A., et al., 1996). Кроме того, АСЕ присутствует в атеросклеротических бляшках в стенках сосудов, что указывает на участие фермента в атеросклеротических процессах (Diet F. et al., 1996). Растворимая форма фермента присутствует практически во всех биологических жидкостях (Skidgel R.A., et al., 1987; Hooper T.L., et al., 1991)., ген АСЕ картирован на хромосоме 17q23. При клонировании гена АСЕ было обнаружено, что в интроне 16 либо присутствует (Insertion, I), либо отсутствует (Deletion, D) Alu-повтор, состоящий из 287 пар оснований (Rigat et al., 1990). Показано, что уровень АСЕ в сыворотке у людей, гомозиготных по D аллели, почти в два раза выше, чем у гомозиготных по I аллели и имеет среднее значение у гетерозиготных - I/D генотип (Rigat B.et al., 1990; Tiret L.et al., 1992). D аллель гена АСЕ считают фактором риска развития инфаркта миокарда, спазма коронарных сосудов, гипертрофии левого желудочка, ишемической болезни сердца и атеросклероза (Schunkert Н. et al., 1994; Arbustini Е. et al., 1995; Lindpaintner К. et al., 1995; Oike Y. et ah, 1995). У больных, гомозиготных no D аллели, отмечается повышенный тонус гладкой мускулатуры сосудов (Prasad А. et al., 2000). Наличие аллели I гена АСЕ связывают с проявлением повышенной выносливости, в особенности у спортсменов, бегунов, гребцов, альпинистов (Montgomery Н. et al., 1999; Woods D.R., et al., 2000). Возможность переносимости длительных физических нагрузок достоверно возрастала у людей с генотипом I/I. При изучении изменений эффективности механической работы скелетных мышц человека, связанных с тренировками, было показано, что при генотипе ІЛ наблюдается более высокая эффективность работы мышц по сравнению с генотипом D/D (Williams A..G. et al., 2000; Woods D.R., Brull D. et al., 2000). Подобные преимущества объясняются низкой активностью АСЕ при наличии аллели I.
В последние годы широко обсуждалось значение АСЕ в пульмонологической патологии, что связано с его участием в метаболизме брадикинина. Брадикинин - основная субстанция калликреин-кининовой системы. Источником- кининов (ацетилхолина, гистамина, брадикинина) могут быть все ткани, в том числе и легкие. Брадикинин, может, синтезироваться и разрушаться при прохождении через легочное русло. Легкие инактивируют кинины лучше, чем другие органы. У пациентов с астмой при ответе на оксидативный стресс, степень вазодилатации в системе a. brachialis выражена в меньшей степени, чем у здоровых людей и менее выражена у больных с тяжелой астмой. В тоже время не выявлено достоверной зависимости степени вазодилатации с полиморфизмом генов АСЕ и eNOS (Yidiz P. et al, 2004). Экспериментально доказана связь легочного метаболизма биологически активных веществ с воспалением (Lunde Н., et al 1994; Федосеев Г.Б., 1998). Метаболизм брадикинина в легких сопряжен с активацией и превращением АСЕ І в АСЕ П. При снижении активности АСЕ, с помощью которого инактивируется большая часть брадикинина в эндотелии легочных капилляров, концентрация брадикинина повышается и приводит к формированию прогрессирующей обструкции (Roisman G.L. et al., 1999; Федосеев Г.Б., 1998). Так в жидкости бронхоальвеолярного лаважа концентрация биологически активных веществ, том числе и брадикинина, была максимальной у больных хронической обструктивной болезнью легких по сравнению с больными хроническим бронхитом. Аналогичные изменения наблюдались у пациентов с фиброзрующим альвеолитом и саркоидозом. (Федосеев Г.Б., 1998; Molina-Molina М., 2008). При хроническом воспалении, с одной стороны, повышается проницаемость эндотелия легочных капилляров, обусловленная действием вазоактивных биогенных аминов, а с другой, накапливаются продукты распада соединительной ткани, оказывающие неблагоприятное влияние на структуры клеточных мембран, интенсифицируя перекисное окисление липидов, свободно радикальные реакции (выделение супероксидного аниона 02, гидроксильного аниона, перекиси водорода.). Антиоксидантная защита осуществляется целым рядом ферментов, среди которых важнейшее место занимает суперсемейство глутатион-8-трансфераз. Слабость антиоксидативной защиты является одной из причин прогрессирования воспалительного процесса в легких и бронхах. Наиболее уязвима в отношении свободно радикального воздействия на организм, группа детей и лиц пожилого возраста (Федосеев Г.Б., 1998). 1.1.2. Глутатион - трансферазы и их роль в формировании БА.
Многочисленные эпидемиологические исследования указывают на то, что практически все широко распространенные заболевания обусловлены агрессивным воздействием неблагоприятных факторов внешней среды. Гены, детерминирующие реакцию организма на канцерогены и экзотоксины, относятся к генам «предрасположенности» (Баранов B.C., 2000). Гены «предрасположенности» кодируют белки, определяющие метаболизм ксенобиотиков, а также белки-рецепторы клеточных мембран, с помощью которых ксенобиотики проникают в клетки.
Молекулярно-генетические методы исследования
Все молекулярно-генетические методы исследования были выполнены в лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней НИИ акушерства и гинекологии РАМН им. Д.О. Опта (руководитель профессор B.C. Баранов) Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови.
Выделение ДНК из свежей крови с использованием солевого метода. 1. Смешивают нитратную кровь с равным объемом холодного (t+4 С) сахарозного буфера (состав буфера: 0,32 М сахарозы, 5мМ MgCl2,1% Nonidet Р 40, 0,01 М Tris-HCl рН 7,6). Для приготовления 1л раствора берут 109,5 г сахарозы, 10 мл Nonidet Р 40, 1,08 мл насыщенного раствора MgCl, 10 мл 1 М Tris-HCl рН 7,6 и добавляют дистиллированную воду до 1 л. Для полного растворения компонентов прогревают раствор на водяной бане в течение 1 ч. Хранят в холодильнике при t+4 С. 1 М Tris-HCl, рН 7,6 готовят следующим образом: 121,1 г Tris растворяют в 800 мл дистиллированной воды, рН подводят концентрированной НС1, затем добавляют воду до 1 л. Аналогично готовят растворы 1 М трис с иными требуемыми значениями рН. Добавление сахарозного буфера приводит к лизису эритроцитов и клеточной мембраны лимфоцитов, при этом ядерная мембрана остается интактной. Образец центрифугируют при 3000 об./мин, при t+4 С в течение 15 мин. Слить супернатант и ресуспензировать ядерный осадок в 400 мкл буфера для протеиназы К (состав буфера для протеиназы К: 10 мМ Tris-HCl, рН 10,5, 0,5 М NaCl, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетраацетата Na), рН 8,0). Приготовление буфера для протеиназы К : для приготовления 100 мл раствора берут 1мл 1 М Tris-HCl, рН 10,5; 200 мкл 0,5 М EDTA, рН 8,0; 15 мл 1 М NaCl, доводят объем до 100 мл. Готовый раствор хранить в холодильнике при t+4 С. 1 M NaCl :58 г NaCl растворить в 1л дистиллированной воды. 0,5 М EDTA, 186,1 г EDTA и приблизительно 20г NaOH растворить в 800 мл дистиллированной воды, проверить рН, при необходимости подвести его концентрированным раствором NaOH и довести объем до 1л. 2. Ядерный осадок переносят в микропробирку типа эппендорф, объемом 1,5 мл, и добавляют 20 мкл 10% додецилсульфата Na (SDS) до конечной концентрации 0,5%. При добавлении SDS происходит лизис ядерной мембраны, ДНК выходит из ядра, и можно визуально наблюдать увеличение вязкости раствора. Добавляют 5 мкл маточного раствора протеиназы К с концентрацией 20 мг/мл (конечная концентрация - 250 мкг/мл). Инкубируют с протеиназой К в течение 12 ч при t+ 37 С, либо - 3 ч при t+ 55 С. По окончании инкубации добавляют 500 мкл 5 М NaCl, перемешивают в течение 3 мин, затем добавляют 700 мкл хлороформа и еще раз перемешивают в течение 10 мин. Затем центрифугируют 5 мин при 5000 об./мин. После разделения фаз, ДНК находится в верхней водной фазе, белки - на интерфазе. 3. Верхнюю водную фазу (800мкл) переносят в другую чистую пробирку и добавляют 800 мкл охлажденного 96 % этанола. Осторожно перемешивают, наблюдая преципитацию ДНК. Образец центрифугируют при 12000 об./мин в течение 5 мин. Промывают осадок 1 мл 70 % этанола для удаления соли. Образец повторно центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин. Осадок высушивают (при комнатной температуре) до исчезновения запаха спирта и растворяют ДНК в ТЕ буфере (в течение ночи при комнатной температуре). Состав ТЕ буфера: 10 мМ Tris-HCl, рН 7,4; 1мМ EDTA, рН 8.0. Идентификация структурного полиморфизма генов. Идентификацию аллельных вариантов гена АСЕ, eNOS, GSTM1 и GSTT1 выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция. Выделенную из лейкоцитов геномную ДНК амплифицировали методом ПЦР на автоматическом термоциклере "Терцик" ("ДНК-технология", Москва) с использованием термостабильной рекомбинантной Taq-полимеразы фирмы "Promega" (США). Смесь для амплификации, объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-НС1, рН 8.8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgC12, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U ДНК-полимеразы (производства "Бион", Москва). Сверху наносили 25 мкл минерального масла для предотвращения высыхания раствора. После начальной денатурации образцов при t+95C, в течение 5 мин выполнялось 30 циклов ПЦР: денатурация 1 мин при t+95C, отжиг 1 мин и синтез 1 мин при t+72C; заключительный синтез проводили при t+72C в течение 5 мин. Температура отжига при амплификации фрагмента ДНК была специфичной для каждого набора праймеров. Продукты амплификации разделяли в 7,5% неденатурирующих полиакриламидных гелях, приготовленных на трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате для вертикального электрофореза с длиной стекла 20 см. Буфер для нанесения проб содержал 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фикола.
Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 1х ТБЕ при 120 В, пока образцы не входили в гель и не проходили около 1 см от лунок. После этого напряжение увеличивали до 260 В. Останавливали электрофоретическое разделение, когда до выхода маркера (бромфенола или ксиленцианола) из геля оставалось 3-7 см.
Гель окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «Macrovue», «Pharmacia LKB», (Великобритания) и фотографировали в системе видео-гель-документации («Vilber Lourmat»). Идентификация делеции гена GSTM1. Для идентификации делеции гена GSTM1 при проведении ПЦР использовали праймеры GST Ml F: 5 GAA СТС ССТ GAA AAG СТА AAG ОЗ ; GST Ml R: 5 GTT GGG СТС AAA TAT ACG GTG G 3 . Температура отжига праймеров - t+60C.
Анализ распределения генотипов по гену АСЕ у больных БА и в популяции
Выявленные сочетания генотипов по генам GSTT1, GSTM1 и eNOS , представленные в таблице №11, практически не отличались от популяционных, кроме генотипа eNOS 5\5 + GSTTlAGSTMl-, который достоверно чаще обнаруживался у больных БА (р=0,0241). Риск развития Б А при данном сочетании генотипов повышался почти в 4 раза (OR=3,724, С195%: 1,18-11,81).
Таким образом, можно предположить потенцирующее действие генотипа eNOS 5\5 для носителей нулевых аллелей по GSTT1 и GSTM1, в плане увеличения относительного риска развития БА по сравнению с носителями других аллельных сочетаний. Подобное «межгенное» взаимодействие между двумя вышеуказанными генотипами выявлено впервые. Проанализирована частота сочетаний АСЕ , GSTT1 и GSTM1 у больных Б А и в популяц Таким образом, сочетание генотипов Ш по гену АСЕ и GSTT1+\GSTM1+ может обладать протективным действием по отношению к формированию БА и снижать риск развития БА в 7 раз (OR=0,1265, С1=0,0276-0,5787). Клиническая картина и тяжесть течения астмы во многом определяются спектром сенсибилизации. У всех обследованных пациентов с БА (92человека) в 100% случаев имела место бытовая сенсибилизация: сенсибилизация к аллергенам домашней пыли, микроклещей. Пищевая сенсибилизации присутствовала у 38 детей (41,3%), пыльцевая у 60 детей (65,2%), эпидермальная - у 48 (52,1%). Учитывая важную роль ферментов семейства GST в детоксикации ксенобиотиков, было интересно проанализировать зависимость формирования сенсибилизации от активности ферментов GSTT1 и GSTM1 и, особенно их ассоциации, так как при «функционально неактивных» ферментах системы детоксикации происходит более длительная циркуляции ксенобиотиков, в том числе аллергенов, что может приводить к развитию сенсибилизации. Проанализированы распределения сочетанных генотипов по генам GSTT1 и GSTM1 в группе больных с Б А в зависимости от спектра сенсибилизации (таблица №13). Распределение сочетанных генотипов по генам GST статистически достоверно различалось в группах детей с БА, имеющих и не имеющих сенсибилизацию к пищевым аллергенам (р=0,0285). У больных БА с пищевой сенсибилизацией частота встречаемости «нулевого» генотипа по двум генам была достоверно выше и составила 39%, чем при ее отсутствии -19% (р 0,05). Функционально активный генотип (GSTT1+\GSTM1+) чаще выявлялся у больных БА без пищевой сенсибилизации (р 0,05) и составил 41%, против 18%, имеющих пищевую сенсибилизацию. Полученные данные подтверждают предположение о важной роли ферментов системы детоксикации ксенобиотиков в формировании пищевой аллергии у детей. Распределение генотипов по генам GSTTIH GSTM1 при эпидермальной и пыльцевой сенсибилизации достоверно отличалось от популяционной (р=0,0029 и р=0,0277). Значимых различий в распределении генотипов GSTT1 и GSTM1 пределах групп больных с эпидермальной и пыльцевой сенсибилизацией не отмечено (таблицы №14, №15). В группе больных БА с поливалентной сенсибилизацией (таблица№16) достоверно чаще встречались функционально неполноценные генотипы GSTT1 - 38,7% и 25%( р 0,001) и GSTM1 - 62,5% и 30%, соответственно (р 0,05). При поливалентной сенсибилизации, сочетание генотипов GSTT1-/GSTM1- встречалось в 2 раза чаще, чем при ее отсутствии - 28,8% и 16,7%. Сочетание генотипов GSTT1+/GSTM1+ встречалось в два раза реже (27,5%) при отсутствии поливалентной сенсибилизации. Полученные данные согласуются с результатами исследования McCunny (2005). Таким образом, в результате анализа распределения различных вариантов изучаемых генов было установлено, что: І.При бронхиальной астме достоверно чаще, чем в популяции, встречались «нулевые» аллели гена GSTT1 и GSTM1 и их сочетания, причем риск формирования БА возрастал примерно в 2-3 раза; 2.У больных БА статистически достоверно чаще, чем в популяции встречался D\D генотип по гену АСЕ. З.У больных БА, осорбенно при тяжелом течение заболевания, чаще, чем в популяции, встречалась мутация delF508 типичная для муковисцидоза. Наличие данной мутации, может способствовать утяжелению течения БА; 4.Частота распределения генотипов eNO-синтазы у больных Б А не отличалась от популяционной; 5.Сочетание генотипов GSTT1AGSTM- и e-NOS 5\5 встречалось при БА в 4 раза чаще, чем в популяции. 6.Сочетание генотипа GSTT1+ \GSTM1+ и генотипа І\І по гену АСЕ в популяции встречалось достоверно чаще, чем при БА. Данный генотип может быть назван «протективным», так как при его наличии риск развития БА уменьшался в 7 раз. 7.Сочетание «нулевых» генотипов по генам GSTT1 и GSTM1 чаще, чем в популяции встречались у больных с доказанной сенсибилизацией к различным аллергенам; 8.Пищевая сенсибилизация достоверно чаще встречалась при генотипах GSTT1AGSTM1-, и реже, при генотипе GSTTl+\ GSTM1+, что подтверждает предположение о важной роли ферментов системы детоксикации ксенобиотиков в формировании пищевой аллергии у детей.
Распределение генотипов по гену АСЕ в популяции и у больных Б А в зависимости от тяжести течения заболевания
В настоящее время проблема бронхиальной астмы у детей привлекает большое внимание исследователей в силу ее высокой распространенности, трудностей в диагностике заболевания в раннем возрасте, профилактике и лечении.
Значительные успехи, достигнутые в изучении генома человека, позволяют точно идентифицировать гены, мутации которых приводят к моногенным наследственным болезням, либо предрасполагают к появлению распространенных полигенных (мультифакториальных) заболеваний. Одним из типичных представителей мультифакториальных заболеваний является бронхиальная астма. В настоящее время выявлено около 100 различных генов, ассоциированных с развитием БА.. Показано, что к локусам, сцепленным с БА, относятся 5q23.1-33, 6р21.1-23, 14ql2-13, 12ql4-24.1, 13ql4.3-gtep, 14qll.2-ql3, 16pl2.1-11.2 и Xq28/Yq28 и т. д. (Noguchi Е et al., 1997).
Одной из наиболее важных задач при изучении БА, является отбор среди «главных» генов, генов-кандидатов, продукты которых являются определяющими в развитии или предотвращении бронхиальной астмы, а также генов, модифицирующих клиническое течение заболевания —генов-«модификаторов» (Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы, 2002). В нашей работе проанализированы клинические особенности и некоторые генетические механизмы, влияющие на развитие и тяжесть течения бронхиальной астмы у детей. То есть, бронхиальной астмы раннего возраста, когда модифицирующее влияние различных сопутствующих заболеваний, в отличие от взрослых больных, выражено минимально.
Целью нашей работы было изучить фенотипические особенности бронхиальной астмы у детей, обусловленные влиянием полиморфизма генов «предрасположенности», кодирующих ферменты системы детоксикации ксенобиотиков GSTTl, GSTM1, гена ангиотензин превращающего фермента и гена эндотелиальной синтазы оксида азота для совершенствования диагностики и оптимизации терапии.
Для выполнения поставленных задач была сформирована группа пациентов с бронхиальной астмой и контрольная группа здоровых доноров. В первую группу вошли 92 ребенка от 2-х до 17-ти лет с верифицированным диагнозом: бронхиальная астма, атопическая форма различной степени тяжести. Вторую группу (популяционную) составили здоровые доноры, жители Санкт-Петербурга и Северо-Западного региона РФ в возрасте от 17 до 35 лет, без аллергических и хронических заболеваний органов дыхания в анамнезе (87 человек).
У большинства детей первые признаки заболевания появились на первом году жизни (68%), что согласуется с данными литературы (Чучалин А.Г., 1997; Шапорова Н.Л., 2001). Позднее начало заболевания отмечалось в, 3 раза чаще при ЛБА по сравнению с СБА (р=0,0354; OR=3,333; df=l; Cl-1,133-9,803) и в 11 раз чаще по сравнению с ТБА (р=0,0004; OR=ll,25; df=l; 0=2,73 5-46,274). Статистически достоверно чаще, раннее начало заболевания наблюдалось у детей с тяжелым и среднетяжелым течением БА по сравнению с легким течением заболевания. ЛБА чаще дебютировала в старшем возрасте.
Все больные анализируемой группы имели атопическую форму БА, подтвержденную наследственной предрасположенностью, данными аллергологического анамнеза, уровнем общего IgE, кожными скарификационными тестами.
Известно, что между возрастом возникновения заболевания и возрастом возникновения сенсибилизации к аллергенам существует определенная связь. Дети, у которых сенсибилизация к аэроаллергенам появляется в возрасте до 3 лет, чаще болеют БА.. Риск развития Б А у детей, сенсибилизированных в позднем возрасте, в 8-10 лет, не выше, чем у несенсибилизированных детей. (Bjorksten В., 1997; Martinez F.D., 2000). Бытовая сенсибилизация в анализируемой группе была установлена в 100% случаев, пищевая сенсибилизация присутствовала у 41,3% больных, пыльцевая у - 65,2%, эпидермальная - у 52,1% пациентов. Частота поливалентной сенсибилизация доминировала и составляла 86,9%. При отягощенном семейном анамнезе по аллергопатологии поливалентная сенсибилизация выявлялась в 85% случаев, а при отсутствии указаний на проявления аллергии в семье, только в 15% наблюдений. Частота отягощенности была выше по материнской линии и составляла 68,7%, по отцовской лини- 33,3% (р 0,001), что соответствует данным литературы (Глобальная стратегия лечения и профилактики БА, 2002).
Поливалентная сенсибилизация выявлялась достоверно реже у пациентов с легкой БА по сравнению со среднетяжелой и тяжелой БА (р=0,0005 и р = 0,0002, соответственно).
Отмечено статистически достоверное увеличение частоты сопутствующей аллергопатологии при тяжелой БА по сравнению со среднетяжелыми формами заболевания (р=0,0115). Риск сопутствующей аллергопатологии при тяжелой форме бронхиальной астмы был в 4 раза выше, что согласуется с данными, полученными Martinez F.D, 2000. Сопутствующее аллергическое поражение других органов и систем встречалось у 40% пациентов. Клинические особенности течения БА, наличие или отсутствие аллергического поражения различных органов и систем (от кожи до респираторного тракта) позволило нам выделить две фенотипические группы больных БА: 1- БА в структуре «атопической» болезни, при которой наблюдались пищевая сенсибилизация, клинически проявляющаяся атопическим дерматитом и сенсибилизация к различным аэроаллергенам, клинически проявляющаяся аллергическим ринитом, коньюктивитом и т. д., и развитием астмы - «атопический» марш - 40% детей. 2 группа - с БА вне структуры «атопической» болезни, в которую вошли дети, не имевшие пищевую сенсибилизацию, атопический дерматит и другую сопутствующую аллергопатологии, кроме респираторной- 60% детей. Для БА в структуре «атопической» болезни было характерно повышение уровня общего IgE свыше 200 МЕ/л у подавляющего большинства детей, для БА вне структуры «атопической» болезни - высокие значения IgE наблюдались лишь у 1/3. Это подтверждает мысль о различных патогенетических механизмах, лежащих в основе БА вне структуры «атопической» болезни и БА в структуре «атопической» болезни.
Для уточнения роли ферментов детоксикации ксенобиотиков, АСЕ, eNOS в формировании фенотипов БА проводилось изучение аллельного полиморфизма их генов, для чего применялись молекулярно-генетические методы исследования. Работа выполнялась на образцах ДНК, выделенных из лимфоцитов периферической крови. Для изучения полиморфизма генов GSTT1 (делеция), GSTM1 (деления) и eNOS (4a/4b), АСЕ применялся метод ПЦР. Общеизвестно, что наиболее неблагоприятным фактором развития БА является обнаружение, так называемых, «нулевых» аллелей GSTM1 и GSTT1, при которых в гомозиготном состоянии не происходит синтеза соответствующих глутатионтрансфераз, участвующих во второй фазе системы детоксикации ксенобиотиков. Это способствует нарушению баланса между первой и второй фазой системы детоксикации ксенобиотиков и как результат, накоплению активных метаболитов, способствующих развитию оксидативного стресса - одного из ключевых компонентов повреждения дыхательных путей и развития воспаления любой природы (Баранов B.C., Иващенко Т.Э., и др., 2000; Богорад А.Е., 2002; Autrup Н., 2000).
![Клинико-функциональные особенности бронхиальной астмы у детей с гастроэзофагальной рефлюксной болезнью и обоснование дифференцированной терапии [Электронный ресурс]](/i/i/4353/196426.png "Клинико-функциональные особенности бронхиальной астмы у детей с гастроэзофагальной рефлюксной болезнью и обоснование дифференцированной терапии [Электронный ресурс] Каган Юлия Михайловна")
![Качество жизни и психосоциальные особенности у детей с бронхиальной астмой [Электронный ресурс]](/i/i/4386/208835.png "Качество жизни и психосоциальные особенности у детей с бронхиальной астмой [Электронный ресурс] Никольский Михаил Андреевич")
