Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Клиническая диагностика лептоспироза 9
1.2. Современные методы специфической лабораторной дианостики лептоспирозов 24
Резюме 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Объем и методы исследования 46
2.2. Общая характеристика наблюдавшихся больных 47
2.3. Общая характеристика реконвалесцентов лептоспироза 51
2.3. Методы исследования 53
2.4. Статистическая обработка материала 60
ГЛАВА 3. Клинико-лабораторная характеристика лептоспироза у наблюдавшихся больных
3.1. Желтушная форма лептоспироза
3.2. Безжелтушная форма
Резюме
ГЛАВА 4. Диагностическая эффективность методов верификации лептоспироза: реакции микроагглютинации, байрам-али-слад- агглютинации, полимеразной цепной реакции
4.1. Диагностическое значение реакции микроагглютинации при лептоспирозе
4.2. Диагностическое значение реакции Байрам-Али-слайд-агглютинации при лептоспирозе
4.3. Диагностическое значение полимеразной цепной реакции при лептоспирозе
4.4. Сравнение диагностической чувствительности различных методов диагностики лептоспироза
4.5. Результаты исследования проб спинномозговой жидкости при лептоспирозе,
4.6. Результаты обследования реконвалесцентов лептоспироза сроком до 5 лет послеперенесенного заболевания
Резюме
Заключение.
Выводы.
Практические рекомендации.
Литература.
- Современные методы специфической лабораторной дианостики лептоспирозов
- Общая характеристика реконвалесцентов лептоспироза
- Диагностическое значение реакции Байрам-Али-слайд-агглютинации при лептоспирозе
- Результаты обследования реконвалесцентов лептоспироза сроком до 5 лет послеперенесенного заболевания
Введение к работе
Актуальность проблемы
Лептоспирозы - группа природно-очаговых инфекций с мировым
распространением. К настоящему времени идентифицировано более 230 сероваров лептоспир, объединенных в 25 серологических групп. На территории Российской Федерации выделялись лептоспиры 13 серогрупп.
Вспышки лептоспироза в РФ, как правило, обусловлены L. Grippotyphosa и L. pomona, реже L. Serjoe и L. canicola [2, 24, 134], на территории Краснодарского края - L. canicola и L. icterohaemorrhagiae [56, 136, 28, 171].
Основные тенденции современного течения лептоспироза: утрата профессионального характера заболеваемости [140], урбанизация (до 80% городских жителей), рост роли L. canicola в серопейзаже возбудителя при спорадической заболеваемости [24, 25].
, Ежегодно в стране регистрируется от 1,5 до 2,5 тыс. случаев лептоспироза [24]. Краснодарский край является наиболее неблагополучным из всех регионов России по заболеваемости людей лептоспирозами. Из общего числа заболевших в РФ на жителей края приходится около 25%, в отдельные годы - более половины; заболеваемость колеблется от 6,3 до 10,2 на 100 тыс, в 1997 году составила 29,7 на 100 тыс населения [56].
Создается впечатление, что в современный период лептоспирозы занимают относительно скромное место в структуре инфекционной патологии человека, вместе с тем, фактическая заболеваемость лептоспирозами значительно (до 10 и более раз) выше регистрируемой [23, 25]. Так, показатель заболеваемости лептоспирозами в Белоруси составляет 0,54 на 100 тыс, а противолептоспирозные антитела обнаруживаются у 4,2% населения республики [80]. Гиподиагностика лептоспироза, по мнению Стояновой <Н. А с соавт. [161], подтверждается выявлением антител к лептоспирам у 9,6% лихорадящих больных с неустановленным диагнозом.
, Доказано существенное влияние сроков начала антибиотикотерапии на дальнейшее течение и исход лептоспироза, в связи с чем ранняя диагностика приобретает первостепенное значение. Сопоставление показателей заболеваемости
и летальности на отдельных территориях также косвенно указывает на гиподиагностику, верификацию преимущественно тяжелых осложненных случаев. В 2002 году заболеваемость лсптоспирозами в Белоруси составила 0,54 на 100 тыс, летальность - 13,6% [80]; в Ставропольском крае заболеваемость - 1 на 100 тыс, летальность в отдельные годы достигала 20% [140]; в Ростовской области заболеваемость - 0,7-1,2 на 100 тыс, летальность — 7-16% [12]; в Краснодарском крае 6,6-10,2, а летальность - 2,3-5,8%.
Практически единственный метод специфической диагностики лептоспироза, используемый в клинической практике в настоящее время, - реакция микроагглютинации лептоспир (РМА) - выявляет специфические антитела в крови больных, образующиеся не ранее конца 1 - начала 2 недели заболевания, сложна в постановке [24] и не решает проблемы ранней диагностики. Больные со стертыми, не диагностированными в острый период формами пополняют статистику соматических болезней [24, 392].
Изучение диагностической ценности новых методов лабораторной верификации лептоспироза представляет практический интерес. Цель исследования: выявить.при лептоспирозе диагностическую ценность методов - полимеразной цепной реакции, реакции микроагглютинации и Байрам-Али-слайд-агглютинации - в зависимости от периода болезни, клинической формы и тяжести течения лептоспироза, что позволит повысить качество диагностики заболевания. Задачи исследования:
1. ' Изучить особенности клинического течения и ошибки диагностики
лептоспироза на современном этапе.
Изучить диагностическую чувствительность, специфичность, прогностическое значение 'положительного и отрицательного результата, диагностическую эффективность реакции микроагглютинации (РМА) в зависимости от периода болезни, клинической формы и тяжести течения лептоспироза.
Изучить диагностическую * чувствительность, специфичность, прогностическое значение положительного и отрицательного результата, диагностическую эффективность реакции макроагглютинации, или Байрам-Али-
слайд-агглютинации (БАСА) в зависимости от периода болезни, клинической формы и тяжести течения лептоспироза.
Изучить диагностическую ' чувствительность, специфичность, прогностическое значение положительного и отрицательного результата, диагностическую эффективность метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в зависимости от периода болезни, клинической формы и тяжести течения лептоспироза.
Изучить возможность использования РМА и ПЦР при тестировании проб спинномозговой жидкости для определения этиологии менингита.
Новизна исследования
-Впервые дана оценка эффективности методов реакции микроагглютинации (РМА), Байрам-Али-слайд-агглютинации (БАСА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики лептоспироза в( зависимости от клинической формы и тяжести заболевания, а также при лептоспирозе, обусловленном возбудителями двух наиболее распространенных серогрупп - L. icterohaemorrhagiae и L. canicola; показатели изучены в динамике, в связи с периодом болезни.
Впервые методы РМА и ПЦР использованы при тестировании проб спинномозговой жидкости у больных с менингитом. Практическая значимость
Дана современная характеристика клинического течения лептоспироза и проведен анализ ошибок диагностики на догоспитальном и госпитальном этапах.
Даны рекомендации по применению методов лабораторной верификации «лептоспироза» (РМА, БАСА и ПЦР) в зависимости от периода, клинической формы и тяжести заболевания; показана возможность применения методов РМА и ПЦР при исследовании спинномозговой жидкости. Основные положения, выносимые на защиту
Установлены особенности иммунологического ответа при
лептоспирозе в зависимости от тяжести патологического процесса и серогруппы возбудителя. У больных иктерогеморрагическим лептоспирозом при тяжелом течении заболевания, по сравнению со среднетяжелым и легким, специфические агглютинины обнаруживаются раньше (Q=1,0). Лептоспироз, обусловленный L. canicola, по сравнению с иктерогеморрагическим, характеризуется более
кратковременной лептоспиремией (1 неделя, Q=0,7-l,0) и ранним сроком обнаружения антител (на 1 неделе Q=0,4, на 2 неделе - Q=1,0).
' Установлены особенности диагностической чувствительности и
эффективности методов РМА и БАСА в зависимости от периода и тяжести
заболевания. Диагностическая чувствительность и эффективность РМА и БАСА на
1-5 неделях при лептоспирозе существенно не отличаются (р>0,05), что позволяет
рекомендовать использование метода БАСА для диагностики лептоспироза в
клинической практике.
Установлена высокая диагностическая эффективность метода ПЦР
для верификации лептоспироза на 1 неделе заболевания (76,3%)- Использование
этого метода на 1 неделе болезни повысит эффективность лабораторной
диагностики по сравнению с применением только РМА - «золотого стандарта» - в
2,7 раза.
Внедрение результатов работы
Методика Байрам-Али-слайд агглютинации (БАСА) внедрена в работу специализированной клинической инфекционной больницы департамента здравоохранения Краснодарского края.
Отдельные положения диссертации включены в лекции и практические занятия курсантов кафедры инфекционных болезней ФПК и ППС КГМУ. Апробация диссертационного материала
Основные положения работы доложены на заседаниях Ассоциации инфекционистов и эпидемиологов Кубани (2004-2005), X Всероссийской научно-практической конференции по лептоспирозу (2003), Южнороссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России» (2005). Публикации
По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ. Объем и стуктура диссертации
Диссертация изложена на 173 страницах, содержит введение, 4 главы, включая обзор литературы, заключение, выводы, практические рекомендации, иллюстрирована 35 таблицами, 18 рисунками: Библиографический указатель' включает 511 источников, в том числе 178 отечественных и 333 зарубежных.
Современные методы специфической лабораторной дианостики лептоспирозов
Генодиагностика - комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для возбудителя данного инфекционного заболевания [50, 253, 254, 327, 374, 381].
Первые сообщения о применении ДНК - диагностики, а именно гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами, появились в-середине 70-х годов. На первых этапах их широкое применение сдерживалось . необходимостью использовать в работе фенол и другие токсичные органические соединения, а также радиоактивные изотопы для детекции результатов анализа. К началу 80-х годов, появились тест-системы, в которых использовались методы нерадиоактивной детекции результатов и пробоподготовка, не требующая применения токсичных веществ [128].
Для проведения реакции гибридизации ДНК с ДНК необходимо располагать клонированной последовательностью ДНК, которая используется в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд должен быть специфичным по отношению к ДНК тестируемого микроорганизма, а также, желательно, быть частью гена, кодирующего синтез одного из факторов патогенности. При использовании молекулярного зонда, удовлетворяющего этим требованиям, можно не только идентифицировать микроорганизм, но и дать заключение о его вирулентном потенциале и эпидемиологической значимости - подход более информативный по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, таких как определение серотипа, фаготипа, способности агглютинироваться в присутствии специфических сывороток, которые не всегда коррелируют с вирулентностью исследуемого микроба [50]. Однако метод не отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаружить 10 - 105 мишеней в пробе, в связи с чем малоинформативен в диагностике инфекционных состояний, при которых концентрация микробов ниже порога чувствительности метода, а сами микробы в силу тех или иных причин не размножаются в лабораторных условиях;, подобные ситуации возникают при диагностике хронических инфекций, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов, идентификации внутриклеточных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы [50].
Метод полимеразной цепной реакции позволил преодолеть выше перечисленные трудности и открыл новые возможности при лечении и эпидемиологическом анализе инфекционных болезней [50, 53, 84, 100, 174, 252]. Принцип ПЦР был описан в 1986 г К. Mullis, в основе - многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного вида [354]. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках, для создания которых используют затравки, представляющие собой специально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 нуклертидов, называемых праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними (см. рисунок 1.1). В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2П, где п-число циклов амплификации. Поскольку праймеры входят в состав амшшфицируемого фрагмента, его размер определяется числом олигонуклеотидных пар между 5 - концами праймеров. Обычно размер фрагмента составляет несколько сотен нуклеотидных пар. Процесс амплификации заключается в повторении циклов, состоящих из денатурации ДНК (1 мин), отжига праймеров (1-2 мин) и построения фрагмента (1-2 мин). В
результате 30-35 циклов синтезируется 10 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Использование термостабильной ДНК -полимеразы (Taq-полимеразы), выделенной из термофильных бактерий Thermus aquaticus, с оптимумом работы 70-72С, позволило автоматизировать процесс, так как фермент - катализатор реакции не инакгивируется при денатурации ДНК нагреванием: нагревание Taq- полимеразы в течение 40 минут при температуре 95 С снижает активность фермента всего в 2 раза [128, 193, 197].
Специальный прибор, называемый термоциклером, автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.
Механизм простой полимеразиой реакции не пригоден для идентификации РНК, так как Taq- полимераза не способна катализировать синтез ДНК по матрице РНК. Возможно два способа практического решения этой проблемы. 1. Использование дополнительного фермента - РНК-зависимой ДНК-полимеразы - обратной транскриптазы ОТ (RT - reverse transcriptase). Реакция, катализируемая этим ферментом, приводит к образованию однонитевых фрагментов ДНК, используемых в дальнейшем в амплификации с помощью Taq- полимеразы, - ОТ-ПЦР [128, 264, 295, 407].
В 1991 г. из другого экстремального термофила Thermus thermophilus выделена ДНК-зависимая ДНК-полимераза (ТЙьполимераза), которая в присутствии ионов марганца катализирует синтез на РНК однонитевой комплементарной ДНК, а при последующем добавлении в среду ионов магния и хелаторов ионов марганца катализирует обычную ДНК-зависимую ДНК-полимеразную реакцию [128]
Методика мультипраймерной (мультиплексорной) ПЦР представляет процесс коамплификации нескольких ДНК-матриц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров, что позволяет производить скрининг сразу- по нескольким инфекционным возбудителям, определять одновременно наличие комплекса факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным или противовирусным препаратам [68, 128, 333, 358, 437].
Одной из распространенных модификаций метода ПЦР является гнездовая ПЦР (nested PCR), заключающаяся в использовании двух пар праймеров, одна из которых способна амплифицировать внутренний участок амликона, полученный после первого раунда амплификации с внешней парой праймеров. Существует несколько вариантов применения гнездовой ПЦР в лабораторной диагностике [128]:
Проводят ПЦР с внешней парой праймеров (15-30 циклов), при этом, амплйфицируется основной фрагмент ДНК, после чего содержимое переносят в другую пробирку, содержащую реакционную смесь, в состав которой входит пара праймеров, узнающая последовательности, лежащие внутри основного ампликона, второй раунд амплификации тоже составляет 15-30 циклов.
Общая характеристика реконвалесцентов лептоспироза
Синтезируемый в ходе реакции продукт можно детектировать различными способами. Один из самых простых, эффективных и распространенных -электрофоретическое разделение ампликонов в агарозном или полиакриламидном гелях с детекцией ДНК при помощи интеркалирующих флюоресцентных зондов, таких, например, как бромид этидия [48, 290, 291]. В последнее время получают широкое распространение иммуноферментные методы, существуют методики высокоэффективной жидкостной хроматографии, капиллярного электрофореза, масс-спектроскопии. Развитие этих подходов способствует автоматизации регистрации результатов [40, 76, 128, 169].
Ложноположительные результаты ПЦР могут быть связаны с присутствием гомологичных белков [299]. Наиболее обсуждаемым является вопрос о вероятности ложноположительных результатов, обусловленных контаминацией реакционной смеси [464]. Эта проблема решаема благодаря применению ультрафиолетового облучения, гипохлорита натрия, ряда фотохимических и ферментных методов [271, 348, 384, 409, 410, 411, 412].
Наивысшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой, эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом [50]. На успех определения в этом случае влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул [50].
В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР [42, 208, 314]. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии-лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода связан, в первую очередь, с природой клеточной стенки микроба [50]. Для экстракции ДНК используют два основных метода: классическую фенольно-хлороформную экстракцию; ее преимущество: хорошая очистка ДНК, в первую очередь х т ингибиторов Taq-полимеразы; недостаток: неизбежные потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с небольшими объемами образца при низкой концентрации инфекционного агента; и использование нуклеосорбентов - методика более простая в исполнении и занимающая меньше времени, но не всегда гарантирующая удаление возможных ингибиторов [50].
Ингибирование ПЦР - не всегда контролируемый процесс, значительно снижающий ее чувствительность, обуславливая ложноотрицательные результаты [41, 102]. Для конкретных разновидностей клинического материала характерна определенная специфика ингибиторов ПЦР: при исследование фекалий конечные результаты зависят от "чрезмерных2 концентраций сопутствующей бактериальной флоры, наличия билирубина, желчных кислот, мочевины, гепарина, следов фенола, додецилсульфата натрия [413] и полисахаридов [354]; при исследовании биоптатов - от используемых для консервации и фиксации ртутьсодержащих соединений, нейтрального забуференного формалина и рибонуклеата ванадия [266], коллагена [313]; при исследовании мокроты - от присутствия гемоглобина [189] и муколитиков - N-ацетил- L-цистеина и дитиотретиола [102]; при исследовании мочи - непосредственно с мочевиной [312]; при исследовании образцов цельной крови - от присутствия железосодержащих белков - лактоферрина и гемоглобина, содержащихся в лейкоцитах и эритроцитах соответственно [85, 102]. Для успешного прохождения реакции количество гемоглобина не должно превышать 4 мкл на 100 мкл реакционной смеси, что преимущественно связывают с гемином и хелатами Mg"+ [181]. При подготовке к ПЦР клеток крови необходимо использовать детергенты, следы которых также могут отрицательно сказываться на результатах реакции [308]. Кроме того, установлено, что наибольшее влияние на ПЦР, при исследовании крови связано с ионами и низкомолекулярными соединениями плазмы, например, фракции Gi и G3 иммуноглобулинов вне зависимости от специфичности связываются с одноцепочечной ДНК - мишенью [182, 471]. При исследовании почвы - ингибитором ПЦР является гумус [457, 458], а молока - протеиназы [102].
В любом исследуемом материале наибольшее снижение чувствительности ПЦР происходит на этапах, связанных с эффективностью лизиса клинического материала и экстрации ДНК, с деградацией ДНК-матрицы и/или праймеров и непосредственным ингибированием активности ДНК-полимеразы [102].
Образующиеся на этапах лизиса сложные комплексы ДНК-белок можно разрушить кипячением, однако это может вызывать фрагментирование ДНК-мишени [102]. Существенное значение на этом этапе имеет гиперсомолярность исследуемого материала [102]. Ферменты лизиса могут быть недостаточными в связи с протеолизом действующего начала протеолитическими энзимами, изначально содержащимися в клиническом материале, и химическими денатурантами, в частности фенолами [298]. Наименее изучено ингибирование ПЦР, обусловленное различной чувствительностью клеток, находящихся в разных фазах роста или культивировавшихся в различных условиях. Недостаточный лизис приводит к тому, что клеточный детрит, включающий белки и полисахариды, маскирует ДНК-матрицу, уменьшая вероятность ее контакта с ДНК-полимеразой. Этот эффект удается нивелировать экстакцией ДНК с использованием бензилхлорида и дополнительным растворением и осаждением высокомолекулярных полисахаридов [388].
Деградация (фрагментирование) исследуемой ДНК или праймерных последовательностей могут быть связаны с неудовлетворительными условиями хранения, высокой чувствительностью первичной структуры ДНК к гидролизу, не ферментативному метилированию, окислению или воздействию ферментов [336]. Амплификация крупных фрагментов ДНК затруднена в связи с активностью нуклеаз, источником которых могут быть лизируемые клетки, бактериальное экзогенное загрязнения образца, ферменты секретов слизистых, выделяющиеся при дыхании и/или находящиеся в испарениях с кожи исполнителя [102]. Наименее чувствительными к этому являются грамотрицательные бактерии, ДНК которых защищена мембраноподобными структурами [102].
Диагностическое значение реакции Байрам-Али-слайд-агглютинации при лептоспирозе
В работе Graverkamp [279, 280, 281, 282] в качестве олигонуклеотидных последовательностей праймеров был использован случайно клонированный фрагмент из библиотеки штаммов, гена RGA (серовар icterohaemorrhagiae), эта система явилась родоспецифичной, при проведении ПЦР происходит амплификация как патогенных (L. interrogans), так и сапрофитных лептоспир (L. biflexa).
Тест-системы, где в качестве праймеров используют последовательности генов рРНК, также являются родоспецифичеекими; к настоящему времени установлено, что у патогенных лептоспир эти гены не организованы в опероны, их расположение на хромосоме у различных сероваров имеет специфические особенности, что делает не возможным получение ампликонов идентичных локусов [154, 214, 292, 293, 329, 349, 376, 390, 475, 485, 486, 487, 488]. Это снижает их диагностическую ценность, причем после электрофореза в агарозном геле для повышения чувствительности ПЦР требуется проведение гибридизации с меченным комплементарным фрагментом ДНК [349]. Чувствительность этих тест-систем можно повысить, если вместо амплификации фрагментов ДНК генов синтеза 16s-pPHK использовать ПЦР с обратной транскрипцией 16s-pPHK [488]. Некоторые авторы предлагают дифференцировать родо- и видоспецифичность тест-систем путем расщепления продуктов амплификации рестриктазами: показано, что при проведении ПЦР с ДНК L. Biflexa происходит амплификация продуктов такого же размера, как и. с ДНК L. Interrogans, но в последствии рестриктазой Крп- I расщепляют только продукты амплификации ДНК L. interrogans [448, 487]. Удлинение и усложнение процесса исследования не желательно в условиях клинической лаборатории.
Тест-система с использованием в качестве праймеров генов 23s-pPHK является видоспецифической по угверждению авторов, но при этом не исследована видоспецифичность по отношению к эукариотической ДНК, а при исследовании клинического материала омечается до 15% ложноположительных результатов [500].
В последние годы для идентификации лептоспир используются тест-системы с произвольными праймерами [237, 311, 330, 334, 390].
Применению ПЦР в таксономических целях посвящена работа Hookey, 1992 [293]: проведена амплификация фрагмента гена 16-рРНК, прямое автоматическое секвенирование продуктов ПЦР лептоспир, Escherichia coli, Serpulina hyodysenteriae и S. innocens и сравнение этих последовательностей.
С 1992 года в лаборатории лептоспирозов и генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН проводятся исследования, цель которых - разработка видоспеЦифичного высокочувствительного метода индикации патогенных лептоспир (L. interrogans). Взяв за основу родоспецифическую тест-систему ПЦР, предложенную Graverkamp с соавторами, Самсонова А. П. [144, 145] показала, что существует зависимость таксономической специфичности этой тест-системы от температуры отжига праймеров. Это позволило подобрать такие условия реакции, при которых удается осуществлять индикацию патогенных лептоспир большинства эпидемически значимых серогрупп и сероваров: Icterohaemorrhagiae (icterohaemorrhagiae, copenhageni), Javanica (poi, hanka), Canicola (canicola), Ballum (castellonis), Pyrogenes (pyrogenes), Pomona (pomona, monjakov, mozdok), Sejroe (wolffii, saxkoebing), Tarassovi - тест-система G-l 1.
Сравнительная оценка диагностической эффективности различных методов индикации лептоспир (темнопольная микроскопия, посев в питательные среды, ПЦР) показала более высокую диагностическую ценность последнего при. исследовании паренхиматозных органов экспериментально инфицированных животных (золотистые хомячки) как при острой, так и при хронической форме инфекции: микроскопическим и бактериологическим методами наличие лептоспир установлено только в 4,8% проб, а с помощью ПЦР - в 61,9% [147], аналитическая чувствительность метода составляет 100-1000 клеток лептоспир в пробе. Показана так же возможность применения этой тест-системы для диагностики лептоспирозов на ранних стадиях заболевания в серонегативный период [144].
К недостаткам разработанной тест-системы следует отнести невозможность выделения ДНК лептоспир ряда серогрупп и прежде всего одной из наиболее распространенных - Grippotyphosa. Это затруднение было преодолено после модификации тест-системы, разработанной Graverkamp, по тому же принципу -создание тест-системы В [ 101 ].
С помощью компьютерной программы OLIG04.0 была проанализирована опубликованная Haake D. А. [283] нуклеотидная последовательность ДНК гена,, кодирующего липопротеин внешней мембраны патогенных лептоспир LipL32. На основании результатов анализа были синтезированы праймеры LEP21 и LEP22, фланкирующие фрагмент размером 677 п. н. Показано, что с помощью этих праймеров в тест - системе ПЦР можно выявить ДНК лептоспир геномовидов L. interrogans, L. borgperseni, L. kirschneri. В тоже время при тестировании ДНК L. biflexa, ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий, спирохет borrelia afzelii и эпителиальных клеток человека получены отрицательные результаты. При исследовании ДНК лептоспир и модельных систем показано, что эта тест-система не уступает ранее разработанным и в то же время имеет более широкий спектр таксономической специфичности (исследовано 15 серогрупп) [153, 154].
Установлено, что метод ПЦР дает хорошие результаты при исследовании сывороток больных даже в процессе лечения антибиотиками [376], что свидетельствует о перспективности его использования для контроля эффективности лечения [273, 455, 493].
Brown P. D. [218], изучая эффективность различных методов обнаружения лептоспир в тканях умерших от лептоспироза (56 образцов 8 человек), пришел к выводу, что наименее чувствителен культуральный метод - 3%, чувствительность ИФА - 11%, чувствительность ПЦР наиболее высокая - 20%.
Wagenaar J. [476] сравнил эффективность методов гибридизации ДНК и ПЦР для обнаружения лептоспир в моче крупного рогатого скота: чувствительность метода гибридизации составила 55%, ПЦР - 91%.
Результаты обследования реконвалесцентов лептоспироза сроком до 5 лет послеперенесенного заболевания
Большинство заболевших - жители сельской местности - 119 человек (66,5%). Наиболее часто отмечалась связь заболевания с рыбалкой - у 74 (41,3%) и купанием в стоячем водоеме - у 53 (29,6%) пациентов. У 22 (12,3%) больных эпидемиологический анамнез не был установлен. У 8 (4,5%) человек лептоспироз связан с профессиональной деятельностью.
В общей группе наблюдавшихся больных желтушная форма регистрировалась у 109 (60,9%), безжелтушная - у 70 (39,1%) человек. Легкое течение отмечалось у 2 (1,1%), средней тяжести - у 58 (32,4%), тяжелое - у 119 (66,5%) пациентов.
Наиболее частыми осложнениями заболевания были ИТШ — у 83 больных (46,4%), ОППН - у-96 (53,6%), ТГС - у 48 (26,8%), РДСВ - у 38 (21,2%), анемия - у 23 (12,8%). Менингит зарегистрирован у 5 больных желтушной формой заболевания (4,2% желтушных форм). Изолированно острая почечная недостаточность наблюдалась у 7 (3,9%),.острая печеночная недостаточность — у 1 (0,6%). Миокардит установлен у 2 (1,1%), хориоретинит - у 1 пациента (0,6%).
У 2 больных установлено сочетанное заболевание: лептоспироз и сепсис, обусловленный клебсиеллой и грибами рода Кандида, лептоспироз и инфаркт миокарда. Сопутствующие заболевания у наблюдавшихся больных: хронический гепатит вирусной этиологии «В» - 6 (3,3%), «С» - 4 (2,2%), «В+С» - 1 (0,6%), алкогольной этиологии - 4 (2,2%), пастинфекция вирусного гепатита В - 1 (0,6%), пневмония - 17 (9,5%), хронический бронхит в стадии обострения - 6 (3,3%), пиелонефрит - 34 (19% ), сахарный диабет - 1 (0,6%), лекарственная токсикодермия - 3 (1,7%), активная форма туберкулеза легких - 1 (0,6%). У всех больных с сопутствующим хроническим гепатитом лептоспироз протекал тяжело в желтушной форме. При исследовании мокроты у больных лептоспирозом выделялись гемолитический стрептококк, эпидермальный стафилококк, клебсиелла, синегнойная палочка, серрация и грибы рода Кандида. 2/3 пневмоний наблюдались у больных с тяжелым течением желтушной формы лептоспироза. Результаты исследования на урокультуру: клебсиелла выделена у 12 больных (6,7%), стафилококк - у 9 (5%), гемолитический стрептококк - у 7 (3,9%), синегнойная палочка - у 1 (0,6%),. кишечная палочка - у 4 (2,2%), протей - у 3 (1,7%), псевдомонас - у 1 (0,6%), энтеробактер - у 1 (0,6%); у 8 больных (4,5%) определялось 2 и более патогенных микроба. 2/3 пиелонефритов также наблюдались у больных желтушной формой с тяжелым течением. У 81 больного (45,3%о) отмечен дисбиоз кишечника. У 18 больных (10%) наблюдалось снижение общего количества кишечной палочки, бифидум- и лактобактерий, патогенных микробов семейства кишечных бактерий не обнаружено. Изолировано выделялись клебсиелла - 14 больных (7,8%), энтерококки - 10 (5,6%), грибы рода Кандида - 7 (3,9%), гемолитическая кишечная палочка - 4 (2,2%), синегнойная палочка - 4 (2,2%). У 18 (10%) больных определялось несколько патогенных микробов: синегнойная палочка и серрация, клебсиелла и кокковая флора, протей и кишечная палочка со слабовыраженными ферментными свойствами, синегнойная, палочка, протей и лактозонегативные энтеробактерии, синегнойная палочка, протей, Enterobacter cloacea и кокковая флора. 2.3. Общая характеристика реконвалесцентов лептоспироза Нами обследовано 116 рековалесцентов лептоспироза спустя 3 мес - 5 лет после перенесенного заболевания. У большинства их них наблюдалось осложненное течение периода отдаленной реконвалесценции. В течение первого полугода-обследовано 36 человек. Женщин - 3 (8,3%), мужчин - 33 (91,7%). У 35 больных выявлены патологические изменения: у 34 больных (94,4%) - признаки нефропатии,,у 25 (69,4%) - проявления хронического гепатита невирусной этиологии, у 20 (55,6%) - жалобы астеновегетативного характера, у 1 (2,8%) - поражение органа зрения. Спустя 1-2 года обследовано 18 человек. Женщин - 2 (11,1%), мужчин - 16 (88,9%) человек. Патологические изменения со стороны различных органов и систем выявлялись у всех больных. Наиболее часто наблюдалось сочетанное поражение печени и почек - у 10 (55,6%), изолированное поражение почек - у 2 (11,1%), изолированное поражение печени - у 3 (16,7%), астенический синдром - у 10 человек (55,6%). Спустя 3-4 года обследовано 8 реконвалесцентов. Женщин - 2 (25%), мужчин - 6 (75%) человек. Признаки нефропатии наблюдались у 4 (50%) человек, хронического гепатита - у 4 (50%), жалобы астеновегетативного характера - у 3 (37,5%), полирадикулопатия после осложненного течения лептоспироза (неврит локтевого нерва) сохранялась у 1 реконвалесцента (12,5%). Изменения носили изолированный характер. Спустя 5 лет обследовано 12 человек, перенесших иктерогеморрагический лептоспироз, 43 человека после каникулезного лептоспироза и 7 человек, лептоспироз у которых был обусловлен возбудителями других серогрупп. У реконвалесцентов иктерогеморрагического лептоспироза наиболее часто регистрировались признаки нефропатии и хронического гепатита - у 5 (41,7%), только поражение почек или печени - у 1 (8,3%), поражение глаз - у 1 (8,3%), астеновегетативные проявления - у 1 человека (8,3%). У 4 (33,3%) патологические изменения не регистрировались. У 23 (53,5%) реконвалесцентов каникулезного лептоспироза выявлены патологические изменения. Наиболее часто наблюдались жалобы астеновегетативного характера - у 13 (30,2%), гепатобилиарные расстройства - у 9 (20,9%), нефропатии - у 3 (7%), поражение глаз - у 2 (4,7%), признаки миокардиодистрофии - у 1 обследованного (2,3%).
