Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы
Глава 1. Современные представления об этиологии, эпидемиологии социальном значении лептоспироза 9
1.1. Значение патогенных лептоспир для Тулы и Тульской области 14
Глава 2. Современные представления о патогенезе лептоспироза 18
Глава 3. Клинические проявления при лептоспирозе 25
Глава 4. Современные принципы диагностики лептоспироза 35
Глава 5. Персистенция лептоспир и её значение в патологии человека 40
Часть 2. Собственные наблюдения
Глава 1. Материалы и методы исследования
1.1. Объем исследования 44
1.2. Специальные методы исследования
1.2.1 .Полимеразная цепная реакция 45
1.2.2.Реакция микроагглютинации и лизиса 49
1.3. Статистическая обработка результатов 51
Глава 2. Клинико-лабораторная характеристика больных лептоспирозом
2.1. Общая характеристика исследованных больных 52
2.2. Клинико-лабораторная характеристика больных различными формами лептоспироза 58
2.2.1. Клинико-лабораторная характеристика начального периода лептоспироза у больных с безжелтушными и желтушными формами 59
2.2.2.Клинико-лабораторная характеристики периода разгара лептоспироза у больных с безжелтушнымиижелтушными формами 67
2.2.3.Клинико-лабораторная характеристика периода ранней реконвалесценции лептоспироза у больных с безжелтушными и желтушными формами 85
2.2.4. Клинико-лабораторная характеристика периода поздней реконвалесценции лептоспироза у больных с безжелтушными и желтупшыми формами 91
2.3.Анализ особенностей клинического течения лептоспироза в зависимости от серогруппы возбудителя 96
Глава 3. Лабораторная диагностика лептоспироза
3.1 Реакция микроагглютинации со специфическим антигеном (РМА) 98
3.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 108
Заключение 120
Выводы 143
Практические рекомендации 144
Список литературы 145
Приложение 169
- Значение патогенных лептоспир для Тулы и Тульской области
- Современные принципы диагностики лептоспироза
- Клинико-лабораторная характеристика начального периода лептоспироза у больных с безжелтушными и желтушными формами
- Клинико-лабораторная характеристика периода поздней реконвалесценции лептоспироза у больных с безжелтушными и желтупшыми формами
Введение к работе
Актуальность темы.
В последнее десятилетие в России отмечается выраженная и устойчивая тенденция к росту и заболеваемости людей лептоспирозами. Для Тульской области, где эта проблема аісгуальна в связи с природной очаговостью данной инфекции, в последние годы уровень заболеваемости яедтоспирозом нревышаег таковой по России: в 2004 году он составил 21,13 на 100 тысяч населения в сравнении с 1,72 на 100 тысяч по РФ. Повышенная заболеваемость обусловлена в первую очередь активностью природного очага леитосшфоза еерогрушш гриппотифоза, связанного с увеличением численности грызунов.
Полиморфизм клинических проявлений лептоспироза обусловливает необходимость улучшения клинической и лабораторной диагностики заболевания. Наиболее перспективным является применение на практике молекулярно-генетических методов диагностики и прежде всего полимеразной цепной реакции, которая позволяет выявлять присутствие ДНК лешоспир в крови с начального периода заболевания до периода ранней реконвалесценщш [19,27]. В настоящее время в диагностике инфекционных заболеваний с целью увеличения чувствительности метода применяется формат ПЦР, при котором из іслинического материала выделяется РНК микроорганизма. Циркуляция в крови РНК микроорганизма отражает острый инфекционный процесс, цельность активно размножающейся бактерии, поэтому обнаружение в материале РНК в полной мере отражает остроту заболевания и как нельзя более подходит для диагностики острого периода [128]. Выделение из материала ДНК возбудителя, принятое в нашей стране, не может в полной мере служить доказательством активности инфекционного процесса, ввиду возможной циркуляция ДНК микроорганизма после острого заболевания и проведегаюго лечения еще в течение нескольких недель [162]. Используемая в нашем исследовании методика ГПДР для выявления РЫК лептоспиры в сыворотке крови, ликворе, аутопсийном материале является приоритетной среди отечественных и зарубежных авторов.
Количество исследований, посвященных изучению характера клинических проявлений лептоспироза в зависимости от серогруппы возбудителя, и в частности, серогруппы гриппотифоза, особешюстей течения заболевания в периоде ранней и поздней реконвалесцешщи, очень ограничено. Нуждается также в уточнении диагностическая значимость РМА и ПЦР в различные периоды лептоспироза в зависимости от формы заболевания и серогруппы возбудителя.
Вышеизложенные данные обусловливают актуальность исследований, направленных на изучение клинико-лабораторной характеристики лептоспироза серогруппы гриппотифоза в динамике ргафекционного процесса в сопоставлении с персистенцией возбудителя в крови.
Цель исследования:
Изучить особенности персистешдии возбудителя в крови у больных лептоспирозом различными клиническими формами, диагностическую ценность ПЦР (рРНК) и РМА для подтверждения лептоспироза на разных стадиях заболевания.
Для выполнения поставленных целей были выполнены следующие задачи:
1.Проведен анализ этиологии и особенностей клинического течения лептоспироза на основе вспышки в Тульской области.
2.Проведена серологическая верификация диагноза лептоспироза методом РМА.
3.Исследована динамика уровня специфических антител в крови методом РМА в периоды рекоіталесценции. 4. Проведена молекулярная диагностика лептоспироза методом ПЦР (рРНК) в крови больных в различные периоды заболевания (острый, ранняя и поздняя реконвалесценция).
5.Сопоставлена диагностическая значимость РМА и ПЦР (рРНК) в разные периоды заболевания.
Научная новизна:
Впервые на территории Тулы и Тульской области на большом іслиническом материале прослежена вспышка лептосгаїроза в динамике инфекционного процесса.
Установлены особенности клинического течения лептоспироза в зависимости от формы заболевания, серогрунпы возбудителя.
Впервые был проведен анализ диагностической значимости РМА и ПЦР в различные периоды заболевания лептоспирозом, вызванного серогруппой гриппотифоза.
Впервые установлена длительная персистенция ссрогруппы гриппотифоза у больных после острой формы заболевания.
Впервые исследовалась рРНК лентоспиры в сыворотке крови, что при ее обнаружении гарангированно указывало на активную стадию процесса, проведен сравнительный анализ чувствительности метода по выявлению рРНК лептоспиры в сыворотке крови в сравнении с ДНК.
Апробация работы и внедрение в практику:
Работа выполнена на базе ГУЗ ТО Тульской областной больницы (ТОБ), МУЗ г. Тулы 2Городской больницы (2ГБ), лаборатории ФГУН ЦНИИЭ Роспотребпадзора г. Москвы.
Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы кафедры инфекционных болезней Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова (зав. кафедрой, член-корреспоидеит РАМН, профессор С.Г.Пак) «Интоксикация при бактериальных и вирусных инфекциях. Патогенез и механизмы адаптации» 01.200.110439. Рекомендации, полученные в результате исследования, внедрены в практику на кафедре инфекционных болезней ММА им.И.М.Сеченова, инфекционного отделения Тульской областной больницы и 2Городской больницы г.Тз лы.
Все основные положения диссертации опубликованы в виде тезисов докладов.
Материалы диссертационной работы были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика жіфекционньїх болезней» (27 октября 2005 года, г. Новосибирск), научно-практической конференции «Молекулярио-гепетичесіше методы диагностики и принципы терапии социально обусловленных инфекционных болезней» (17 марта 2006 года, г.Казань), Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское оборудование на рубеже веков» (19 мая 2006 года, г. Алматы).
Работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней
ММА ИМ.И.М. Сеченова.
Практическая значимость:
Установлены сроки оптимального применения РМА и ГТЇДР для верификации диагноза лептоспироза, определена длительность лептоспиремии методом ІЩР (рРНК) в крови.
Установлено преимущество по выявлению рРНК лептоспиры в сыворотке крови методом ГЩР в сравнении с выявлением ДНК, что позволяет рекомендовать метод для обследования как на ранних сроках заболевания, так и при обследовании лихорадящих больных, а также в качестве замены культуральному методу исследования.
Имеющиеся результаты ПЦР по обнаружению рРНК в ликворе и аутоптате позволяют рекомендовать этот метод для дополнительной верификации диагноза лептоспироза. Особую актуальность приобретает метод при исследовании аутопсийного материала. Часть 1. Обзор литературы Глава 1 Современные представления об этиологии, эпидемиологии и социальном значении лептоспироза. Лептосггароз — зоонозная инфекция, протекающая у человека в виде острого лихорадочного заболевания с выраженной интоксикацией, поражением почек, печени, центральной нервной системы, развитием геморрагического синдрома. Лептоспироз остается одной из самых распространенных и тяжело протекающих зоонозных іщфекций человека и характеризуется высокой летальностью. По данным ВОЗ [217,219], лептоспироз, наряду с эхинококкозом и бешенством, отнесен к природно-очаговым заболеваниям первостепенной важности. Эта инфекция эпидемиологически и эпизоотологически недостаточно контролируется и приносит значительный экономический и социальный ущерб во многих странах мира [106,211,212,].
Согласно современным ггоинципам таксономии, лептоспиры выделены в отдельное семейство Leptospiraceae, относящееся к порядку Spirochaetales. В это семейство входят три рода: Leptonema, включающий вид L. illini; Тшпепа, включающий вид L. narva, а также род Leptospira, включающий два номенвида (Leptospira interrogans sensu lato и Leptospira biflexa sensu lato). Из перечисленных видов только L. interrogans является патогенным для человека и животных, остальные — сапрофитами. На сегодняшний день известно более 250 сероваров L. interrogans, объединенных в 24 серогрунпы [79,129,141,145,146].
Лептоспиры обладают своеобразной клеточной архитектоникой и способом движения, что позволяет идентифицировать их только лишь на основании морфологических критериев. Клетки спирохет имеют характерную спиралевидтгую конфигуращпо и специфические локомоторные органеллы — периплазмаческие жгутики, расположенные между наружной оболочкой и протоплазматическим цилиндром [54]. Способность к пенетрации связывают со спиралевидной конфигурацией лептоспир, их активной подвижностью и быстрым перемещением в жидкостях, обладающих высокой вискоэластичностью (повышенной вязкостью среды). Явление впскотаксиса впервые открыто на модели лептоспир, оно позволяет клетке противостоять неблагоприятному расположешяо в пространстве и накапливаться в вязком окружении [5]. Внугриклегочная пенетрация подтверждена работой на морских світках [100], оігоеделтпшіими лептоспирозньга антиген в лизосомах гепатоцитов и эпителия канальцев почек.
По данным генетических исследований, выявлены особенности строения генома лептоспир, а именно: наличие двух кольцевых хромосом в клетке (размером 4500 и 350 тпн) [69]. Одну из хромосом раньше относили к плазмиде, однако после обнаружения на ней гена asd, отвечающего за синтез компонента пептидогликана (диаминопимелата), была впоследствии отнесена к "вторичной" хромосоме. Однако вопрос о наличии внехромосомных генетических элементов у лептоспир окончательно не решен. Была описана нлазмида размероїм около 370 тіш у вирулентных штаммов лептоспир сероваров copenhageni, lai, canicola и poraona. У свободноживущих непатогенных лептоспир плазмиды не обнаружены [140]. Вместе с тем из культуры сапрофитных лептоспир впервые удалось изолировать три литических бактериофага (LEI, LE2 и LE4), геном которых состоит го молекул линейной двунитевой ДНК размером 50 (LET) и 60 (LE2 и LE4) тпн. Изучается возможность использовании бактериофагов сапрофитных лептоспир в целях генетического анализа [185 Л 86].
Природным резервуаром для большинства лептоспир являются около 160 видов диких и домашних млекопитающих (крысы, свиньи, собаки, кошки, еноты, крупный рогатый скот и др.). Наибольшее значение имеют грызуны, особенно крысы, в связи с их широким распространением во всем мире. Некоторые серовары лептоспир имеют специфических хозяев. Например, L. pomona характерен для крупного рогатого скота и свиней, L. grippotyphosa — для полевки, крупного и мелкого рогатого скота, для L. balium и L. icterohaemorrhagiae — крысы и мыши, для L. canicola — собаки. Также большую роль в патологии человека играют серовары hebdomatis, australis, autumnaiis [77,114,120].
Согласно ВОЗ [217], L. inadai числится как вид лептоспир с невыясненной патогенностыо. Сведения об особенностях L. raadai весьма скудны. Некоторые исследователи классифицируют его как переходный вид, наряду с Leptospira fainei and Leptonema illini. При этом ни в одном из упомянутых микроорганизмов с помощью современных методик ГШР не определяется характерный для патогенных лептоспир белок наружной мембраны LipL32 [145]. Известно, что этот вид представлен еероварами aguarana, iyme, manhao, kaup. Была получена амплификация участка ДНК L. Inadai [129]. С помощью серологических тестов и ПНР-анализа впервые из 56 образцов ткани почек 4 видов грызунов, распространенных в Индии, в 23 определены L. Inadai [116]. Преобладание этого серовара лептоспир может говорить о том, что исследованные виды грызунов являются их природным резервуаром. Неясным остается вопрос об экологических взаимоотношениях с известными патогенными лептоспирами, персистіфующими в организме индийских грызунов. Исследователи считают- необходимым включить антигены L. inadai в состав тест-систем с целью более глубокого изучения их эпидемиологических особенностей. Сообщается, что несколько лет назад в Италии началась работа по изучению вирулентности L. inadai.
На сегодняшний день лептоспироз относят к особо опасным инфекциям. Данное положение иллюстрируется произошедшими за последнее десятилетие крупными вспышками в Никорагуа [78,85,147,191,208], Бразилии, Индии [149,219], Юго-Восточной Азии, США [86], Малайзии [87,111]. В мире заболеваемость лептоспирозом в эндемичных зонах имеет как правило характер вспышки, а на остальной территории как правило спорадическая [146,213].
В России с середины 80-х годов наблюдается подъем заболеваемости, особенно иктерогеморрагическим лептоспирозом, летальность от которого продолжает оставаться высокой [20,52,53]. По данным официальной статистики, с 1988 по 1997 г. уровень заболеваемости населения в России вырос в 1,6 раз. В последние годы отмечается относительная стабилизация этого показателя. Одна из причин — внедрение в практику высокоэффективных вакцин нового поколения: для профилактики людей (концентрированная корпускулярная поливалентная вакцина, [59]) и животных (поливалентная вакцина для сельскохозяйственных животных и др. ассоциированные вакцины [30]). Активизации природно-очаговьтх ршфекций в 80-90-е тт. способствовало ухудшение уровня жизни населения, сокращение вакщшно-профилактических и дератизационных работ в связи с удорожанием препаратов и общим снижением финансирования здравоохранения [43]. Все чаще в мире вспышки лептоспироза оказываются связаны с активным отдыхом людей, более тесным общением с природой. Тем не менее, имеет свою значимость профессиональный фактор заражения[35,391120,145,161,195,].
В России лептоспироз регистрируется практически во всех климатических зонах, на 58 адмшшстрагивных территориях и в среднем за год составляет до случаев, с заболеваемостью 1,0 на 100 тысяч населения [7]. Наиболее неблагополучная эпидемиологическая обстановка сложилась на Северном Кавказе, где заболеваемость достигает 8,1-29,6 на 100 тысяч населения [25]. На фоне спорадических случаев периодически регистрируется групповая и «вспышечная» заболеваемость, как правило, обусловленная возбудителями серогрупп Grippothyphosa и Pomona, реже Sejroe и Canicola, хотя последний возбудитель стал проявляться чаще [19]. Средние показатели летальности, по данным официальной статистики - 3-4,5%. Однако на отдельных территориях, эндемичньгх по лептоспирозам Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают 20% и более. Как при других зоонозах, в большинстве регионов России наблюдается урбанизация лептоспирозов: на долю городского населения приходится от 60 до 80% от числа больных. Понятно, что основной причиной этого являются увеличение численности городского населения, сезонная миграция, а также увеличение числа безнадзорных животных. Например, за 90-е гг. произошло 8-кратное увеличение распространенности лептоспироза среди собак, вызываемого обычно возбудителями серогруппы Canicola. В связи с этим, во многих городах России резко увеличилась доля каникулёза в структуре заболеваемости людей лептоспирозом (подобная тенденция описана и в других странах). Поэтому каникулёз относят к числу «возвращающихся» ішфекикй [29,52,53]. Наблюдается расширение спектра эпидемически значимых источников инфекции. В эпизоотический процесс, помимо основного хозяина - собаки, вовлекаются и некоторые виды сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи). По некоторым исследованиям, основным источником распространения почти всех возбудителей лептоспироза среди сельскохозяйственных животных являются свиньи [56]. Зарегистрированы водные (купальные) вспышки каникулёза в Ульяновской области [35,39] и в Краснодарском крае [14]. Таким образом, наблюдается феномен преодоления «барьера гостальной специфичности» [5].
В некоторых странах Европы (Англии, Северной Ирландии, Германии, Чехии и др.) среди свиней получили распространение лептоспиры серогруппы Australis (серовары muenchen и bratislava) [74,187,197,203,211,]. Появились сообщеїшя о заболеваниях людей этим лептоспирозом, в том числе и в России [38,41]. Доля тех или иных сероваров в структуре заболеваемости лептоспирозами в Российской Федерации очень сильно зависит от региона. Например, в Москве за 12 лет наблюдения (1991-2002) преобладает Canicola -(54,4%), кроме того: Icterohaemorrhagiae - 23,8%, Pomona - 7,14%, Grippothyphosa - 9,5%, Javanica - 2,38%. Основным источником заражения людей являются собаки. Отмечено повышение мнфицированности собак лептоспирами Icterohaemorrhagiae, Pomona, Grippothyphosa, что может свидетельствовать об их контактах с серыми крысами и другими грызунами [31]. В Волгоградской области наблюдается следующая картина: Icterohaemorrhagiae (38%), Pomona (30,3%), Grippothyphosa (13,4%) и смешанные (11,1%) [24]. В Вологодской области: Grippothyphosa (28%), Icterohaemorrhagiae (10%), Canicola (10%), Hebdomads (3,0%), Batviae (2,0%), Pomona (1,0%) [46]. В Северо-Западном федеральном округе: Icterohaemorrhagiae (47,8%), Canicola (32,6%), Grippothyphosa (11,7%), Pomona (4,3%), Sejroe (1,8%), другие (1,8%) [52]. В Кировской области наиболее частым возбудителем лептоспироза являются представители сероіруип Grippoihyphosa (52,4%), Canicola (36,9%) и Pomona (9,5%); преобладают безжелтушные формы [12]. 1.1. Значение патогенных лептоспир для Тулы и Тульской области.
По данным официальной статистики, предоставленной Тульским областным центром Госсанэпиднадзора, в регионе наблюдается высокий уровень заболеваемости, который колеблется в пределах от 0,2 до 16,0 случаев на 100 тысяч населения. Лептоспироз в Тульской области регистрируется с 1948 года в виде спорадических случаев, но первые вспышки были отмечены лишь в 1950 г. С момента регистрации лептоспироза в области наблюдалось 2544 случая во всех районах. Эпидемиологический надзор за лептоспирозом введен с 1975 года.
По характеру эпидемического процесса на терригории Тульской области выделено три периода. 1-й период (продолжительностью 16 лет с 1948 — 1964 г.г. с показателем заболеваемости 2,1 на ШОтыс. населения) характеризовался вспышками купального типа. Основным источником лептоспироза были сельскохозяйственные животные. В этиологической структуре преобладала серогруппа Pomona (94,6 %), Tarassovi (4%). Сезонность заболевания преимущественно летняя - 99,9%.
Во 2-й период (с 1964 по 1984 год) наблюдалась спорадическая заболеваемость с показателем 0,24 на 100 тыс. населення. Превалировала роль антропургических очагов: 64% больных заражались при контакте с сельскохозяйственными животными. Лептоспироз регистрировался в течение всего года с незначительным подъемом в июле-октябре. Серологический пейзаж стал более разнообразен: до 55% снизилась роль серогруштьт Pomona, а распространенность серогруппы Tarassovi возрос до 12,5%. С 1965 года впервые был установлен и подтвержден лабораторно лептоспироз серогруппы Australis, в этом же году серотип еж европейский был включен в музейный набор іптаммов лептоспир для серологической диагностики лепгоспироза. Впервые зарегистрирована заболеваемость, вызвашгая серогруппамм Icterohaemorrhagiae - 11,3%, Grippolhyphosa - 5%. У сельскохозяйственных животных и мышевидных грызунов з этот период положительных находок с серогруппамии Grippothyphosa и Icterohaemorrhagiae не обнаруживалось.
Значение патогенных лептоспир для Тулы и Тульской области
Средние показатели летальности, по данным официальной статистики - 3-4,5%. Однако на отдельных территориях, эндемичньгх по лептоспирозам Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают 20% и более. Как при других зоонозах, в большинстве регионов России наблюдается урбанизация лептоспирозов: на долю городского населения приходится от 60 до 80% от числа больных. Понятно, что основной причиной этого являются увеличение численности городского населения, сезонная миграция, а также увеличение числа безнадзорных животных. Например, за 90-е гг. произошло 8-кратное увеличение распространенности лептоспироза среди собак, вызываемого обычно возбудителями серогруппы Canicola. В связи с этим, во многих городах России резко увеличилась доля каникулёза в структуре заболеваемости людей лептоспирозом (подобная тенденция описана и в других странах). Поэтому каникулёз относят к числу «возвращающихся» ішфекикй [29,52,53]. Наблюдается расширение спектра эпидемически значимых источников инфекции. В эпизоотический процесс, помимо основного хозяина - собаки, вовлекаются и некоторые виды сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи). По некоторым исследованиям, основным источником распространения почти всех возбудителей лептоспироза среди сельскохозяйственных животных являются свиньи [56]. Зарегистрированы водные (купальные) вспышки каникулёза в Ульяновской области [35,39] и в Краснодарском крае [14]. Таким образом, наблюдается феномен преодоления «барьера гостальной специфичности» [5].
В некоторых странах Европы (Англии, Северной Ирландии, Германии, Чехии и др.) среди свиней получили распространение лептоспиры серогруппы Australis (серовары muenchen и bratislava) [74,187,197,203,211,]. Появились сообщеїшя о заболеваниях людей этим лептоспирозом, в том числе и в России [38,41]. Доля тех или иных сероваров в структуре заболеваемости лептоспирозами в Российской Федерации очень сильно зависит от региона. Например, в Москве за 12 лет наблюдения (1991-2002) преобладает Canicola -(54,4%), кроме того: Icterohaemorrhagiae - 23,8%, Pomona - 7,14%, Grippothyphosa - 9,5%, Javanica - 2,38%. Основным источником заражения людей являются собаки. Отмечено повышение мнфицированности собак лептоспирами Icterohaemorrhagiae, Pomona, Grippothyphosa, что может свидетельствовать об их контактах с серыми крысами и другими грызунами [31]. В Волгоградской области наблюдается следующая картина: Icterohaemorrhagiae (38%), Pomona (30,3%), Grippothyphosa (13,4%) и смешанные (11,1%) [24]. В Вологодской области: Grippothyphosa (28%), Icterohaemorrhagiae (10%), Canicola (10%), Hebdomads (3,0%), Batviae (2,0%), Pomona (1,0%) [46]. В Северо-Западном федеральном округе: Icterohaemorrhagiae (47,8%), Canicola (32,6%), Grippothyphosa (11,7%), Pomona (4,3%), Sejroe (1,8%), другие (1,8%) [52]. В Кировской области наиболее частым возбудителем лептоспироза являются представители сероіруип Grippoihyphosa (52,4%), Canicola (36,9%) и Pomona (9,5%); преобладают безжелтушные формы [12]. 1.1. Значение патогенных лептоспир для Тулы и Тульской области.
По данным официальной статистики, предоставленной Тульским областным центром Госсанэпиднадзора, в регионе наблюдается высокий уровень заболеваемости, который колеблется в пределах от 0,2 до 16,0 случаев на 100 тысяч населения. Лептоспироз в Тульской области регистрируется с 1948 года в виде спорадических случаев, но первые вспышки были отмечены лишь в 1950 г. С момента регистрации лептоспироза в области наблюдалось 2544 случая во всех районах. Эпидемиологический надзор за лептоспирозом введен с 1975 года.
По характеру эпидемического процесса на терригории Тульской области выделено три периода. 1-й период (продолжительностью 16 лет с 1948 — 1964 г.г. с показателем заболеваемости 2,1 на ШОтыс. населения) характеризовался вспышками купального типа. Основным источником лептоспироза были сельскохозяйственные животные. В этиологической структуре преобладала серогруппа Pomona (94,6 %), Tarassovi (4%). Сезонность заболевания преимущественно летняя - 99,9%.
Во 2-й период (с 1964 по 1984 год) наблюдалась спорадическая заболеваемость с показателем 0,24 на 100 тыс. населення. Превалировала роль антропургических очагов: 64% больных заражались при контакте с сельскохозяйственными животными. Лептоспироз регистрировался в течение всего года с незначительным подъемом в июле-октябре. Серологический пейзаж стал более разнообразен: до 55% снизилась роль серогруштьт Pomona, а распространенность серогруппы Tarassovi возрос до 12,5%. С 1965 года впервые был установлен и подтвержден лабораторно лептоспироз серогруппы Australis, в этом же году серотип еж европейский был включен в музейный набор іптаммов лептоспир для серологической диагностики лепгоспироза. Впервые зарегистрирована заболеваемость, вызвашгая серогруппамм Icterohaemorrhagiae - 11,3%, Grippolhyphosa - 5%. У сельскохозяйственных животных и мышевидных грызунов з этот период положительных находок с серогруппамии Grippothyphosa и Icterohaemorrhagiae не обнаруживалось.
3-й период с 1985 года по настоящее время характеризуетя как период повышенной заболеваемости, значительными по сравнению с предыдущими тремя десятилетиями изменениями в эпидемиологии, активизацией природных очагов серогруппы Icterohaemorrhagiae и Grippothyphosa, ростом инфіщированности грызунов до 9%, преобладанием среди заболевших городских жителей до 80%, ростом тяжелых форм заболевания со среднегодовой летальностью до 10%. Сельскохозяйственные животные являлись источником инфекции только в 16,7%, тогда как роль обыкновенной полевки возросла до 39%, крыс до 36,3%. В этиологической структуре преобладала заболеваемость, вызванная еерогруппами Grippothyphosa и Icterohaemorrliagiae. Укоренению и распространению природных очагов на территории области способствовала производственная деятельность человека. Так, созданный в 1970 году Балаховский клеевой завод из-за несвоевременной переработки технической кости стал резервуаром серых крыс, которые поступали сюда с косгями из разных регионов страны. В течение 12 лет серая крыса расселилась на всей территории области, в связи с чем количество лептоспироза серогруппы Icterohaemorrhagiae возросло.
Современные принципы диагностики лептоспироза
Современные принципы диагностики лептоспироза. Лептоспиры имеют одинаковые морфологические и культуралыше свойства, но существенно различаются по антигенной структуре и генетическому материалу. Ведущее место в лабораторной диагностике лептоспироза занимают иммунологические методы. С их помощью удается выявить в крови больных и переболевших специфические антитела и обнаружить в биологических жидкостях антигены лептоспир [106]. Эффективность ранее использованного бактериологического метода ограничена из-за широкого спектра ферментных систем лептоспир, наличия среди них трудно культивируемых штаммов, а также токсического действия компонентов тканей организма хозяїша на их рост in vitro [30]. Разработанная в 1927 г. реакция агглюттгаащта-лизиса с живыми культурами лептоспир продолжает оставаться основным тестом диагностики лептоспироза, дающим надежные специфические результаты. Согласно рекомендации ВОЗ (2003), в настоящее время используется модификация — реакция микроаітлютинаці-ш (РМА) с набором эталонных культур 13 серологических групп. Положительные результаты в РМА обнаруживаются не ранее конца первой -начала второй недели болезни, нарастают в титре и достигают наибольшей концентрации к периоду выздоровления. По данным некоторых исследователей, антитела в РМА к 7 дню заболевания регистрируются у половины заболевших, на 8-14 день - у 75%, па 15-21 день - у 96%. При тяжелом течении лептоспироза антитела в ряде случаев образуются в поздние сроки на 16-56 день заболевания и в невысоких титрах, что существенно усложняет подтверждение диагноза [13]. Кроме того, торможение выработки специфических антител описано па фоне терапии антибиотиками, глюкокортикоидами, специфическим гамма-глобулином и применения экстракорпоральных методов детоксикации [75]. Несмотря на недостатки РМА, этот тест остается основным в ветеринарии. При этом в случае поступления животных из Центральной, Южной Америки, Японии рекомендуется ставить реакцию с полным набором патогенных лептоспир, а не с 5-15 серогруппами, как это обычно делается [30].
Разработан ряд серологических реакций на лептоспирозный аитигеп, позволяющих установить родоспецифичность возбудителя. Преимуществом этой методики является высокая чувствительность, небольшое время постановки, возможность определения как живых, так и разрушенных бактерий. К ним относится реакция иммунноадгезивной гемагглютинашш, реакция иммуннофлтооресценции [64], микрокапсульный тест на агглютинацию [65]. иммуноферментный метод в различных модификациях [34,198], радиоиммунный анализ. В качестве экспресс-методов иммунодиагностики лептоспироза существуют реакция торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), реакция агрегатгемагглютинации (РАГА), реакция торможения непрямого гемолиза, реакция ко-агглютинации. Получил распространение иммуноферментный анализ (ELISA, dol-ELTSA) [66,93,148,182]. Однако отсутствие промышленного выпуска соответствующих антигенов затрудняет внедрение перечисленных реакций в практическое здравоохранение [1].
В последние годы развитие способов диагностики инфекционных болезней идет в направлении разработки молскулярно-генетических тестов определения антигенов возбудителей. Для выявления антигенов лептоспир в настоящее время применяются методы геномной дактилоскопии: ДНК-гибридизации и рестрикцнонный анализ, метод молекулярного зондирования [95,118]. Эти методы обладают высокой специфичностью, быстротой выполнения, позволяют определять погибшие и разрушенные микроорганизмы. Тем не менее, чувствительность разработанных к настоящему времени методов индикации лептоспир (микроскопических, иммунологических, молекулярно-генетических) остается довольно низкой: от 105 до 107 клеток в 1 мл [55].
Более перспективным в этом направлении представляется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на амплификации in vitro специфических последовательностей ДНК и отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью. С его помощью возбудитель выделяется в концентрации 4 103 — 4 104 клеток/мл. При изучении возможностей определения лептоспир на материале сывороток крови больных при спорадических случаях и эпидемических вспышках лептоспирозов на территории различных регионов России и Китая выявлено, что на ранних стадиях заболевания (1-я неделя) отмечаются достаточно высокие показатели диагностической чувствительности (78,2%), специфичности (94,2%) и эффективности (88,8%) метода. ДНК лептоспир можно обнаружить в крови больных уже с 1-3-го дня заболевания, в то время как в РМА специфические антитела обнаруживались только в конце 1-й недели. В единичных случаях положительные результаты ПЦР отмечались и в период реконвалесценции (4-5-я неделя). Анализ полученных данных позволил установить некоторые особенности динамики содержания ДНК бактерий в крови больных. [28,47,48,49,168,189,].
В настоящее время ведутся разработки по применения ПЦР с целью ранней диагностики лептоспироза [67,80,145,157,170,172,220].
В целом, молекулярно-генстические тесты могут эффективно применяться при изучении этиопатогенеза лептоспирознои инфекции, для генотигшроваия лептоспир и в качестве метода лабораторной диагностики [49]. На основе полимеразной цепной реакции разработаны две высокочувствительные и специфичные тест-системы, позволяющие проводить іщдикацию ДНК лептоспир всех эпидемически значимых серогрупп и сероваров [28,47]. При проведении исследования с помощью ПЦР на модели сирийских золотистых хомячков в случаях острой PI хронической формы лептоспирознои инфекции показано, что диагностическая чувствительность ПЦР превосходит таковую микроскопического и бактериологического методов, особенно при индикации лептоспир в тканях центральной нервной системы. Для определения бактерий различных серогрупп при смешанных инфекциях был использован методический подход, основанный на применении двух тест-систем ПЦР с различной серогрупповой специфичностью на моделях in vitro и in vivo. Выявлено, что в смешанной культуре лептоспир серогрушт Javanica и Grippotyphosa в течение срока наблюдения, равного 70 суткам, обнаруживались лептоспиры обеих серогрупп. При одновременном или последовательном заражении белых мышей линии BALB/c обеими культурами наблюдатюсь развитие почечного носительства не только лептоспир серогруппы Javanica, к которым эти животные восприимчивы, но и Grippotyphosa, к которым они при моноинфекции резистентны [49].
Клинико-лабораторная характеристика начального периода лептоспироза у больных с безжелтушными и желтушными формами
Дополнительно к лабораторным исследованиям многим больным проводились в динамике заболевания ішструментальньте исследования: ЭКГ, ЭГДС, рентгенограмма легких, УЗИ брюшной полости и почек, Эхо-КГ.
Комплексная терапия больных лсптоспирозом в лечебных отделениях проводилась по следующих! направлениям: постельный режим в периоде разгара заболевания, диета номер пять. 11 больных при развитии тяжелых осложнений на разных сроках заболевания получали интенсивную терапию в отделении реанимации (6 человек - вследствии развития ИТШ Зстепени, почечно-печеночной недостаточности, у троих имело место более трех осложнений — ИТШ, ОПЯ, острая печеночная недостаточность., миокардит, у 2 пациентов с летальным исходом имел место синдром полиорганной недостаточности).
Все больные с первого дня поступления в стационар получали антибактериальную терапию (пеііициллин по 6мли.ЕД/сутки в/м - в 66(70,2%) случаях, докешгиклин 0,1 г/сутки per os- в 14 (14,8%) случаях, в 2 (2,12%) — тетрациклин 1,2г/сутки ). Антибактериальная терапия проводилась в течение всего лихорадочного периода + 2-3 дня нормальной температуры и составляла в среднем 11+1,82 дня. Часть больных (12 человек (12,7%)) получали одновременно несколько антибиотиков в связи с тяжелым течением лептоспироза и развившимися осложнениями (пневмония, пиелонефрит). Вторая волна лихорадки имела место у 11 человек и требовала повторного курса антибиотикотерагши. Назначались доксищіклнн, левомицетин, ампициллин, цефазолин как правило, в средних терапевтических дозах до нормализации температуры тела. При наличии у больных менингита применялись доксициклин в/в 0,2 гр/сутки и далее левомицетин в/в 3 гр/сутки - у 2х больных, в одном случае левомицетин в/в 3 гр/сутки и далее цефотаксим 3 гр/суткы в/м до санации лыквора. Терапию глюкокортикоидами (преднизолон), дофаминергическими препаратами (допамин) внутривенно капельно получали 46 больных. Доза гормонов зависела от тяжести состояния больного и составляла от 90 до 300 мг/сутки. В одном случае проводился гемодиализ.
Помимо этого, всем больным проводилась общепринятая дезинтоксіжационная терапия. По показаниям в отделении реанимации и интенсивной терапии применялась патогенетическая и симптоматическая терапия: альбумин, плазма, ноотропные препараты, трентал, витамины, физиотерапия. 2.2 Клигожо-лабораторная характеристика больных различными формами лептоспироза.
Клиническая характеристика больных изучена в двух группах, выделенных в соответствии с формами течения болезни — желтушной (33 человека) и безжелтушной (61 человек).
С целью выявления особенностей течения лептоспироза в зависимости от серогрутпты возбудителя, мы разделили больных по этиологической природе заболевания: 1-я группа - лептоспироз, вызванный серогруппой grippotyphosa (77 человек) , 2-я группа — лептоспироз, вызванный другими серогруппами (17 человек).
Безжелтушиая форма лептоспироза наблюдалась у 61 (64,8%) человека из 94 . У 4 больных имело место легкое течение заболевания, у 48 59 среднетяжелое и у 9 - тяжелое течение. В одном случае имел место летальный исход.
По этиологическому признаку больные с безжелтушной формой лептоспироза распределились следующим образом: у 53 (86,8%) из 61 больного были выявлены антитела к лептосттирам серогруппы grippotyphosa, в 4 случаях (6,5%) - austraiis, в одном случае (1,6%) выявлены высокие антитела к двум серогруппам лептосшір — grippotyphosa + austraiis. У 3-х (4,9%) больных серогруппа установлена не была.
Желтушная форма лептоспироза наблюдалась у 33 (35,1%) человек. У 16 имело место среднетяжелое течение заболевания, у 17 больных — тяжелое. Летальный исход был один.
По этиологическому признаку больные с желтушной формой лептоспироза распределились следующим образом: в 24 (72,7%) из 33 случаев заболевание вызвано серогруппой grippotyphosa , в 3-х (9%) -austraiis, у 2-х больных (6%) выявлены антитела к двум серогруппам лептоспир - sejroe + canicola, по одному- sejroe (3%) и canicola (3%). Не установлена серогруппа у 2-х больных (6%).
Больные с безжелтушной формой в среднем находились в стационаре 35,6 койко-дней, в то время как пациенты с желтушной формой — 9,1 койко-дней, причем данные отличия недостоверны (по критерию Стьюдента р 0,57). Это объясняется тем, что среди больных с безжелтушпой формой (в 2-х случаях) возникли осложнения в виде лептоспирозного менингита, что потребовало длительной повторной госпитализации, а также чаще возникали рецидивы заболевания.
В среднем у больных с безжелтуншой формой лептоспироза длительность лихорадки составляла 6,26 дней. Сравнимые данные были получены у пациентов с желтушной формой - 6, 36 дней.
Клинико-лабораторная характеристика периода поздней реконвалесценции лептоспироза у больных с безжелтушными и желтупшыми формами
В настоящее время РМА занимает ведущее место в диагностике лептоспироза среди иммунологических методов (Методические указания МУ 3.1.1128-02). При помощи РМА в динамике заболевания определялся уровень специфических антител в крови всем 94 больным. Количество исследований в разные периоды заболевания зависело от сроков поступления больных в стационар, забором крови в динамике для получения результатов парных сывороток, а также сроками диспансеризации реконвалесцентов. Максимальное количество исследований пришлось на 2-3 неделю заболевания лептоспирозом, полугодовой и годовой периоды после перенесенного заболевания.
Диагностическим считался титр 1:100 и выше. РМА была положительной у 89(95%) из 94 человек. В парных сыворотках нарастание титров антител в крови было отмечено у 72(81%) больных, из них в трех случаях отмечалось позднее появление антител — только в 6-7 месяце (у 2 человек в титрах 1:200 и у одного в титре 1:1600). Монотонно низкие антитела без нарастания титров определялись у 3 человек (3,3) % , у них наличие активной лептоспирозной инфекции лабораторно подтверждено методом ПЦР обнаружением рРНК в сыворотке крови. Монотонно высокие антитела отмечались у 7 (7,9%)человек. У 4(4,5%) пациентов отмечено быстрое исчезновение антител уже в остром периоде. Не исследовались в динамике антитела у 3-х больных. У пяти пациентов результаты РМА были отрицательны, у них диагноз был верифицирован методом ПЦР. При анализе причин отсутствия специфических антител в крови было отмечено, что в трех случаях из пяти кровь исследовалась в РМА однократно на 5-й, 8-й, lift дни заболевания соответственно, т.е. сроки исследования были очень ранние, что не позволило подтвердить диагноз этим методом. Еще у одной пациентки антитела не выявлялись ни на 9-й, ни на 16-й дни болезни, в одном случае тяжелого течения лептоспироза РМА была отрицательной на 16-й, 96-й дни и через 1 год от начала заболевания.
Результаты постановки РМА в динамике инфекционного процесса у наблюдавшихся нами больных представлены в таблице 33. Забор крови для исследования проводился в соответствии с днями поступления больных в стационар и зависел от сроков наблюдения в динамике.
В первую неделю заболевания (1-7 дни болезни) из 16 исследованных больных РМА была положительной у 1 пациента с безжелтушной формой лептоспироза, что составило 6,2%. На 2-й неделе заболевания (8-14 дни болезни) исследовалось 62 человека, положительные результаты были в 30,6% случаев, поровну в обеих группах (30,2% у безжелтушных форм и 31,5% у желтушных ). На 3-й неделе (15-21 дни болезни) положительные титры в РМА выявлены у 81,8% пациентов из 66 исследованных (из них в 88,1% у безжелтушных форм и 70,8%- у желтушных). На 4-й неделе (22-28 дни болезни) из 12 исследованных РМА положительна у 8(66,6%)больных, на этот раз в 80% желтупшых форм и 57% безжелтушных. На 5-й неделе положительных результатов в РМА было 7(87,5%) из 8 исследованных, из них процент безжелтушных форм составил 83%, желтупшых форм -100%. Сроки 2,3 месяца, полгода и год от начала заболевания характеризовались высоким процентом положительных результатов РМА от 72,7% до 96% и достоверно не отличались при безжелтушных и желтупшых формах.
Следовательно, выявление специфических антител методом РМА приобретает максимальные значения, только начиная с 3-й недели заболевания (81,8%). При анализе времени появления специфических антител в крови в зависимости от формы заболевания нами была выявлена разница между сроками появления антител и формой заболевания в периоде разгара лептоспироза (таблица 34).
Используя критерий Фишера при статистической обработке наших данных, было установлено, что в группе больных безжелтушной формой лептоспироза достоверно выше процент больных с выявленными специфическими антителами на 3-й неделе заболевания, что свидетельствует о более быстром темпе нарастания антител у пациентов данной когорты. Это также косвенно свидетельствует о повышенной антигенной нагрузке в периоде разгара заболевания у больных желтушными формами лептоспироза и более позднем у них формировании точки эквивалентности, что нашло отражение в более тяжелой клинической картине заболевания у лиц с желтушных формами. Описанную картину можно объяснить поражением Купферовских клеток и стагнацией обменных процессов в печени [176].
Следовательно, полученные данные предполагают иные механизмы иммунопатогенеза у больных желтушными формами лептоспироза.
В периоде отдаленной реконвалесценции, через 5-7 месяцев после острого заболевания, уровень специфических антител, выявленных при помощи РМА, исследован у 51 человека, причем у 49 (96%) РМА была положительна. У 24 их них отмечалось снижение титра специфических антител в 2 и более раза в сравнении с острым периодом. У 7 человек титр антител оставался на высоком уровне (1:1600) и соответствовал по величине ранее выявленному в остром периоде; еще у 7 пациентов титры имели равномерно низкие значения как в остром периоде, так и через 6 месяцев (1:100-1:200). В одном случае антитела не были выявлены ни в остром периоде, ни через полгода от начала заболевания.
