Содержание к диссертации
Список принятых сокращений 5
Введение 7
Часть I. Обзор литературы 12
Глава 1. Распространенность заболеваний, вызванных Neisseria meningitidis; профилактика и диагностика менингококковой
инфекции 12
Глава 2. Особенности антигенного состава Neisseria meningitidis 17
Глава 3. Железорегулируемые белки менингококков 26
Способность микроорганизмов к усвоению железа 26
Современные сведения о ЖРБ менингококков 30 Заключение 39
Часть II. Собственные исследования 41
Глава 1. Материалы и методы исследований 41
Материалы исследования 41
Методы исследования 43
Приготовление питательных сред 43
Культивирование N. meningitidis В125 44
Методы выделения антигенных препаратов 45
Получение моноспецифических сывороток 48
Определение содержания белка по Марквеллу 49
Электрофорез в полиакриламидном геле 50
Определение молекулярной массы белков 51
Иммуноблоттинг 51
Статистические методы анализа 52
Глава 2. Изучение содержания железорегулируемых белков в
различных антигенных препаратах N. meningitidis В125 53
Выявление железорегулируемых белков в составе бактериальных лизатов N. meningitidis 53
Индивидуальные ЖРБ, полученные из бактериальных 59 лизатов с помощью препаративного электрофореза
Состав поверхностных антигенов 62
Состав ЖРБ в препаратах белков наружной мембраны
(БНМ) 63
Характеристика препаратов, полученных с помощью экстракции цетавлоном 66
Выделение ЖРБ-35 из цетавлоновых экстрактов 67
Глава 3. Исследование спектра антител к ЖРБ менингококков в сыворотках доноров крови
Общая характеристика спектра антител к ЖРБ в сыворотках доноров крови 72
Сравнение спектра антител к ЖРБ менингококков в сыворотках детей и взрослых
Глава 4. Спектр антител к ЖРБ в сыворотках больных менингококковой инфекцией
4.1. Общая характеристика спектр антител к ЖРБ
менингококков в сыворотках инфицированных N.
meningitidis 0
Сравнение спектра антител к ЖРБ в сыворотках больных, инфицированных менингококками различных серогрупп
Сравнение спектра антител к ЖРБ в сыворотках детей и взрослых - больных менингококковой инфекцией
4.4. Изменение уровня антител к ЖРБ менингококков у лиц,
инфицированных N. meningitidis на разных стадиях болезни 87
Обсуждение результатов 93
Выводы 102
Список используемой литературы
Список принятых сокращений.
АГ - антиген(ы)
AT - антитело(а)
БНМ — белки наружной мембраны
БСА — бычий сывороточный альбумин
Гм — гемоглобин
ГБМ — гнойные бактериальные менингиты
ГФМИ - генерализованые формы менингококковой инфекции
ДДС-Na - додецилсульфат Na
ДОХ — дезоксихолат натрия
ДТПУ - диэтилентриаминпентоуксусная кислота
СТВ - цетавлон
ЖРБ - железорегулируемые белки
ЖРБ-37 - железорегулируемый белок с моллекулярной массой 37 кД
ЛОС - липоолигосахарид
ЛПС — липополисахарид
Лф — лактоферрин
МАТ — моноклональные антитела
МИ - менингококковая инфекция
м.м. - молекулярная масса
НМ — наружная мембрана
ОБНМ - основные белки наружной мембраны
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР — полимеразная цепная реакция
СМЖ - спиномозговая жидкость
Тф - трансферрин
TTBS - буферный раствор триса, содержащий Tween-20
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
FbpA — переплазматический транспортный белок
FrpB — рецептор сидерофор
РогА - белок первого класса, образующий катионоизбирательные поры
РогВ - белки 2 и 3 класса, образующие анионоизбирательные поры
ТЬрА - белок, входящий в состав рецептора трансферрина
ТЪрВ - белок, входящий в состав рецептора трансферрина
Ора - белки пятого класса
Орс — белок пятого класса
Введение к работе
Актуальность проблемы
Менингококковая инфекция в виде острого назофарингита, гнойного менингита и менингококкцемии — заболевание преимущественно детского и юношеского возраста — возникает относительно редко, но протекает тяжело, с высокой смертностью (10-15%) и обладает эпидемическим потенциалом. [23].
Несмотря на низкую заболеваемость, весьма широко, особенно в очагах инфекции с частотой от 5 до 40% распространено бессимптомное назофарингиальное носительство менингококков [12, 21], которое одновременно служит резервуаром инфекции и, вероятно, основой естественно приобретённого противоменингококкового иммунитета. Конкретные механизмы естественного менингококкового грундиммунитета до сих пор остаются невыяснеными, хотя их анализ имеет ключевое значение в эпидемиологическом надзоре за менингококковой инфекцией и в создании менингококковых вакцин нового поколения.
Своевременная иммунопрофилактика позволяет управлять
заболеваемостью этой инфекцией [36; 45]. Однако существующие вакцинные препараты, сконструированные на основе капсульного полисахарида, неэффективны, когда инфекция протекает у детей до года, а так же когда заболевание вызвано менингококками серогруппы В [1].
Так как состав циркулирующих штаммов периодически изменяется, важным является поиск видовых антигенов, которые могли бы быть использованы для вакцины широкого спектра действия.
Антигенная структура менингококков сложна и представлена антигенами различной локализации и природы. Значительное место в ней занимают железорегулируемые белки, синтезируемые микробами в условиях
недостатка железа в среде обитания и являющихся жизненно необходимыми для бактерий.
Специфические антитела к некоторым ЖРБ могут блокировать утилизацию железа клетками менингококков и, следовательно, приводить к нарушению процесса размножения бактерий. Кроме того, некоторые индуцированные генетические нарушения в системе утилизации железа приводят к неспособности бактерий использовать определенные источники железа, снижая вирулентность штаммов [12].
Поскольку только патогенные Neisseria способны усваивать железо из организма хозяина, можно предположить, что ЖРБ должны играть важную роль в патогенезе менингококковой инфекции. Установлено [72], что различные штаммы менингококков могут индуцировать до двух десятков различных ЖРБ, которые, вероятно, вносят различный вклад в иммунный ответ организма хозяина к менингококковой инфекции [40].
Наиболее хорошо изучен рецептор трансферрина. Показано, что, специфические антитела к белкам ТЬрА и ТЬрВ, входящим в состав рецептора, выявлены в сыворотках больных, реконвалесцентов и носителей менингококковой инфекции [77]. У вакцинированных добровольцев отмечали повышенное содержание антител к ТЬрВ менингококков, принадлежащих к разным серогруппам. Бактерицидные свойства этого белка изменялись в зависимости от применяемых адъювантов. Обнаружена также его способность к выработке протективных бактерицидных антител [12].
В сыворотках крови лиц, переболевших менингококковолй инфекцией, были выявлены антитела специфичные к белку FrpB, перекрестно реагировавшие с гетерологичными штаммами менингококков [51].
Периплазматический ЖРБ — FbpA (34-37 кД) может индуцировать выработку специфических антител у мышей и кроликов и является общим белком для большинства нейссерий [7, 67, 73].
Общие Т- и В-клеточные эпитопы ЖРБ N .meningitidis с другими
представителями рода нейссерий позволяют высказать предположение, что большая часть здорового населения должна обладать высоким уровнем естественного иммунитета против менингококков, т. к. основу нормальной микрофлоры носоглотки человека составляют непатогенные представители рода Neisseria [46, 47]. Выявление антител к различным ЖРБ в крови практически здоровых людей и больных менингококковой инфекцией может служить не только методом идентификации потенциальных протективных антигенов - кандидатов в состав будущих вакцин, но и инструментом анализа специфичности и уровня экспрессии естественно приобретённого менингококкового грундиммунитета.
Цель работы: охарактеризовать спектр специфичности антител к индивидуальным железорегулируемым белкам N. meningitidis в сыворотках крови здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией.
Задачи исследования:
Выделить и охарактеризовать по составу железорегулируемых белков антигенные препараты N.meningitidis.
Изучить спектр антител класса IgG к ЖРБ менингококков в сыворотках крови практически здоровых людей.
Определить частоту выявления антител класса IgG, специфичных к различным ЖРБ менингококков в сыворотках крови больных, инфицированных менингококками разных серогрупп.
Научная новизна
Впервые охарактеризован спектр специфичности антител к ЖРБ менингококков у лиц, не имеющих в анамнезе тяжелых форм
менингококковой инфекции. С различной частотой (1,7-90,9%) у лиц этой группы выявлены IgG антитела к 16 ЖРБ.
При анализе сывороток крови здоровых лиц установлено, что с возрастом увеличивается частота выявления антител класса IgG к ЖРБ с м.м. 35 кД, что свидетельствует о постепенном формировании естественно приобретенного грундиммунитета.
У больных тяжелыми формами менингококковой инфекции спектр специфичности антител к ЖРБ не отличается от спектра антител здоровых лиц, но частота выявления антител к отдельным белкам (с м.м. 41,5; 43; 47; 76; 98; 107 и 116 кД) значимо возрастает.
Установлено, что в образцах сывороток крови больных, инфицированных менингококками серогрупп А и В, преобладали антитела к высокомолекулярным ЖРБ (98, 107, 116 кД).
Впервые установлено, что по мере выздоровления у больных происходит нарастание концентрации антител к ЖРБ с м.м. 35, 43 и 47 кД.
Практическая значимость
Разработана оригинальная технология препаративного выделения ЖРБ менингококков с м.м. 35 кД, который может быть использован при конструировании ИФА тест-систем для серологических исследований в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.
Основные положения, выносимые на защиту:
Бактериальные лизаты N. meningitidis серогруппы В характеризуются более широким спектром ЖРБ, чем препараты белков наружной мембраны (БНМ), поверхностных антигенов и цетавлоновых экстрактов.
В сыворотках крови здоровых лиц выявлены антитела к 16 ЖРБ менингококков, определяемые с различной частотой (1,7-90,9%). При
этом с возрастом увеличивается частота выявления антител к ЖРБ с м.м. 35 кД. 3. В сыворотках крови больных тяжелыми формами менингококковой инфекции с частотой от 1,8 до 87,9% выявляются антитела к 15 ЖРБ менингококков. В ходе заболевания нарастает концентрация сывороточных антител к ЖРБ с м.м. 35, 43 и 47 кД. Сдвиг спектра специфичности антител в сторону низкомолекулярных ЖРБ и нарастание их концентрации может служить положительным прогностическим признаком при манифестированной менингококковой инфекции.
