Содержание к диссертации
Список сокращений 3
Введение 4
Глава 1 Гибридомпая технология и иммуноанализ на основе моноклональных антител (обзор литературы) К)
1.1. Культивируемые клетки плазмацитомы 12
1.2. Получение иммунных лимфоцитов 15
1.3. Подготовка к слиянию клеток 18
1.4. Гибридизация (слияние) клеток 19
1.5. Метаболическая селекция гибридов 20
1.6. Скрининг - выявление і ибридов-продуцентов антител 22
1.7. Клонирование гибридом-продуцентов антител 23
1.8. Криоконсервация гибридом 25
1.9. Массовое культивирование и пассирование гибридом на мышах 26
1.10. Иммуноанализ на основе моноклональных антител 30
Глава 2. I {ели, задачи и методы исследования 34
2.1. Выбор цели и постановка задач исследования 34
2.2. Материал и методы исследования 36
Глава 3. Развитие приемов гибридомной технологии 45
3.1. Выведение штамма культивируемых клеток плазмацитомы мышей -опухолевого партнера для создания гибридом 45
3.2. Исследование свойств и испытание штамма миеломы 47
3.3. Выбор линии мышей-доноров иммунных лимфоцитов 52
3.4. Приемы наработки моноклональных антител 53
3.5. Обсуждение 58
Глава 4. Получение и изучение свойств моноклональных антител против маркеров, используемых в иммуноанализе 61
4.1. Ферменты и флуорохромы - маркеры, используемые в иммуноанализе 61
4.2. Получение гибридомного штамма, синтезирующего антитела против пероксидазы 67
4.3. Изучение свойств моноклональных антител против пероксидазы и некоторых возможностей их использования в иммуноанализе 71
4.4. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител против флуоресцеина 77
4.5. Изучение свойств моноклональных антител против флуоресцеина 80
4.6. Обсуждение 91
Глава 5. Получение и изучение свойств моноклональных антител против респираторно-синцитиального (PC) вируса 95
5.1. Моноклональные антитела в исследовании PC вируса 95
5.2. Получение гибридомных штаммов, продуцирующих антитела против антигенов PC вируса человека 98
5.3. Изучение свойств и возможностей применения моноклональных антител против PC вируса 103
5.4. Обсуждение 113
Глава 6. Получение и изучение свойств моноклональных антител против иммуноглобулинов (Ig) человека 115
6.1. Антигенные свойства Ig человека. Антитела - реагенты для иммуноанализа Ig 115
6.2. Получение гибридом, синтезирующих моноклональные антитела против изотипических и субизотипических маркеров Ig человека 134
6.3. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител против Ig человека 150
6.4. Обсуждение 161
Глава 7. Конструирование тест-систем, предназначенных для детекции и определения концентраций Ig человека в биолої ических жидкостях 161
7.1. Изучение эпитопной специфичности моноклональных антител 163
7.2. Конструирование двухцентровых иммуноферментных систем для определения Ig человека в биологических жидкостях 176
7.3. Исследование Ig человека с помощью моноклональных антител 190
7.4. Обсуждение 210
Заключение Тенденции развития гибридомной технолої ии и создания моноклональных антител для имммуноанализа 213
Выводы 219
Благодарности 220
Цитированная литература 221
Введение к работе
Актуальность проблемы. Моноклональные антитела (МкАт) являются мощным инструментом исследования биологических макромолекул. С их помощью иіучаюі сірукіуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые аніиіснньїс компоненты клеток и тканей [72]. Анализ экспрессии и реіуляции генов, идентифицированных в раличных геномных проектах, требует создания тысяч и тысяч новых МкАт [238]. МкАт позволяют обеспечить высокую специфичность, чувствительность и воспроизводимость приемов иммуноанализа и в то же время -увеличить их разнообразие и адаптировать для решения проблем фундаментального и практического характера [91]. Поэтому создание МкАт для систем иммуноанализа было и остается актуальной задачей.
Опубликование в 1975 году статьи, в которой было описано слияние нормальных плазмацитов с их опухолевыми аналогами - клетками миеломы и последующий отбор клонов-продуцентов антител [200], открыло эру создания, исследования и использовании МкАт. Совокупность приемов получения штаммов-продуцентов МкАт была патана іибридомной технологией. В ее основе лежит синтез ряда достижений клеточной биологии, фундаментальной иммунологии и экспериментальной онколої ии.
Перспективность гибридомной технологии для развития методов иммуноанализа была высоко оценена исследователями, и лаборатории многих стран мира занялись ее освоением и адаптацией. Вскоре стало понятно, что на каждом этапе создания гибридом имеются многочисленные технические проблемы и что способ их решения определяет результат в целом. Первая из таких проблем связана с высокой зависимостью миеломных клеток-партнеров от ростовых факторов эмбриональной сыворотки [124, 130]. Создание клеточных линий, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, способных расти и давать жизнеспособные гибриды в средах, не содержащих фетальной сыворотки, представляло актуальную задачу. Вторая проблема состояла в том, что при создании іибридом для иммунизации почти повсеместно использовали мышей BALB/c, от которых происходят миеломные штаммы-партнеры [185, 257]. Это приводило к сужению спектра эпитопов, распознаваемых полученными МкАт. Представлялось целесообразным в качестве доноров иммунных лимфоцитов использовать животных иного генотипа с иным репертуаром вырабатываемых антител с тем, чтобы получаемые МкАт по эпитопной специфичности могли дополнять ранее созданные реагенты. Наконец, пассирование гибридом на животных с целью получения больших количеств МкАт остается до сих пор «узким местом» гибридомной технологии [118].
Таким образом, совершенствование ряда ключевых этапов гибридомной технологии представляет собой актуальную задачу.
Анализ литературы показывает, что иммунофлуоресцентные и иммунопероксидазные методы детекции антигенов и антител относятся к числу наиболее надежно работающих и чаще всего используемых вариантов иммуноанали ja как в фундаментальных исследованиях, так и в лабораторной диаіностике. Наличие МкАї против молекул - маркеров позволяет с большей гибкостью подходить к разработке и применению систем иммуноанализа, создавать иммунные комплексы сложного состава и использовать их для визуализации или инструментальной регистрации продуктов реакции ангшен-антитело [94].
МкАт служат незаменимыми инструментами в вирусологаческих исследованиях. Иммунохимические способы диагностики вирусных заболеваний основаны на выявлении вирусных антигенов в клетках и в биологических жидкостях, а также на определении спектра циркулирующих в крови антивирусных антител. Респираторно-синцитиальный (PC) вирус человека вызывает тяжелое заболевание нижних отделов дыхательных путей, особенно опасное для новорожденных и детей 1-ю года жизни [151]. Энп вир с характеризуется чрезвычайно нестабильной антигенной структурой - она леї ко нарушается при выделении, очистке и хранении препаратов вируса. Создание МкАт против антигенов PC вируса открывает пути совершенствования и стандартиіации методов иммунодиагностики этой вирусной инфекции.
При диагностике иммунодефицитов, инфекционных, аллергических, аутоиммунных, лимфопролиферативных заболеваний используют методы иммуноанализа, основанные на выявлении иммуноглобулинов (Ig) человека. В антигенном отношении Ig представляют собой молекулы с высокой степенью гомологии, в то же время они имеюг антигенные детерминанты, отличающие Ig отдельных типов, изотииов и субизошпов. Создание высокоспецифичных реагентов, способных дифференцировать и детектировать эти молекулы методами иммуноанализа, отвечает запросам фундаментальной и клинической иммунологии.
Цель работы состояла в совершенствовании ряда приемов гибридомной технологии и в создании МкАт против флуоресцеина, нероксидазы, PC вируса и Ig человека как антиі енов, широко используемых в системах иммуноанализа.
Задачи исследования.
1. Создать штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки, позволяющий получать и поддерживать гибридомы на средах с сывороткой крупного рогатого скота (СКРС).
2. Испытать целесообразность использования при создании гибридом лимфоцитов животных с репертуаром иммунного ответа, отличным от присущею мышам линии BALB/c.
3. Ра$работать способы эффективной наработки МкАт пассированием штаммов гибридом на животных.
4. Получить гибридомы-продуценты МкАт против флуоресцеина и пероксиданл маркеров антигенов и антител в системах иммуноанализа. Исследовать свойсша МкАт и возможности их применения в иммуноанализе.
5. Создать панель МкАт против антигенов PC вируса человека и отобрать реагенты, необходимые для иммунодиагностики PC вирусной инфекции. 6 Создать гибридомы, продуцирующие МкАт против антигенных маркеров иютипов (IgA, IgM, IgG, IgE) и субизотипов IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) человека.
7. Изучить иммунохимические характеристики МкАт против Ig человека и свойства распознаваемых ими антигенных детерминант.
8. Разработать лабораторные варианты систем иммуноанализа для определения концентраций Ig отдельных изотипов и субизотипов.
Работа выполнялась в рамках государственной целевой программы О.Ц.043 и КП НГП стран-членов СЭВ "Биотехнология в медицине" (задание - «Разработка и организация производства диагностических реагентов на основе моноклональпыч антител»), в соответствии с планом научно-исследовательских работ Центральною научно-исследовательского рентгено-радиологического института (номера государственной регистрации 01.83.0 021559, 01.85.0 025322 и 01.99. 0 04371). Исследования, выполняемые соискателем, были поддержаны грантами РФФИ (00-04-49516 и 02-04-49120).
Научная новизна.
Создан новый штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый ог ростовых факторов эмбриональной сыворотки.
Впервые для пассирования гибридом и наработки МкАт in vivo в сингенной системе использовано сублетальное облучение реципиентов.
Впервые получены МкАт против пероксидазы, взаимодействующие со всеми изоформами фермента и не ингибирующие его каталитическую активность.
Среди МкАт против PC вируса человека впервые описаны реагенты, способные дифференцировать полноценный вирус от вирусных частиц, имеющих структурные дефекты.
Впервые при получении МкАт против изотип-сиецифичных эпитопов IgG человека исследован профиль их антиген-распознающей активности и отобраны реагсшы, равномерно связывающие все четыре подкласса.
Получены МкАт против изотипических и субизотипических маркеров Ig человека, не имеющие аналогов по эпитопной специфичности.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Использование мышей линии SJL/J позволяет расширить репертуар эпитопов, распознаваемых МкАт.
2. Сублетальное облучение мышей при пассировании гибридом увеличивает эффективность наработки МкАт.
3. Полноценное использование МкАт в иммуноанализе требует одновременного изучения иммунохимических характеристик самих антител и свойств распознаваемых ими эпитопов.
4. МкАт против флуоресцеина и против пероксидазы позволяют расширить вошожности иммуноанализа за счет сочетанного применения антшенов и антител, меченных ферментом, флуорохромом и/или гаптеном.
5. На основе полученных МкАт против классов и подклассов IgG разрабоганы системы ИФА, позволяющие выявлять и определять концентрации IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарною IgG, как в сыворотке крови, так и в других биологических жидкостях человека.
Практическая значимость результатов работы.
Созданные в работе МкАт против PC вируса могут быть использованы как для диагностики инфекции, так и для оценки качества вирусных препаратов.
МкАт против IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарного IgG в виде нативных препаратов и в виде конъюгатов с пероксидазой прошли і осударст венные испытания и рекомендованы для практического применения Комитетом по иммунобиологическим препаратам при ГИСК им. JI.A. Тарасевича.
Государственным фармакопейным Комитетом утверждены фармакопейные статьи:
1. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека» - №42-0190-059300.
2. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена» - № 42-0596-636605.
Внедрение результатов исследования.
Прошедшие государственную экспертизу и включенные в фармакопейные статьи антитела применяются в иммунодиагносгических тест-системах, выпускаемых НПО «Вектор» (Новосибирск), ООО «ЦКФФ» (Ставрополь). Полученные в работе МкАг используются в научных и диагностических лабораториях ряда учреждений страны, в том числе в: ВМА (Санкт-Петербург), ВЦЭРМ МЧС (Санкт-Петербург), НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург), СПб МАПО, Институте детских инфекций (Санкт-Петерб)рі), СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, ВНЦ МДЛ (Москва), ГУ НИИ вакцин и сывороток (Москва).
Теоретические положения и практические результаты, полученные в настоящей работе, используются при проведении практическою курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Личный вклад автора в проведение исследования. Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все этапы создания гибридом, получения МкАт, изучения их свойств, конструирования систем иммуноанали ja, подіотовки материалов для публикаций и для проведения государственных испытаний МкАт. При получении МкАт против PC вируса, диссертантом выполнены этапы иммунизации, разработки системы скрининга, создания гибридомных штаммов, исследования свойств МкАт и распознаваемых ими эпитопов. Получение препаратов РС-вируса, ею очистку, электронно-микроскопические исследования, а также работу с материалом от пациентов проводили сотрудники лаборатории иммунодиаіносгических препаратов ПИИ гриппа РАМН, руководимой профессором Сомининой А.А.
Апробация работы Материалы работы были представлены на Всесоюзных и международных конференциях и симпозиумах, в том числе: на всесоюзном конгрессе "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований" (Москва, 1989), на конференциях «Современные достижения медицинской радиологии» и «Новые технологии в радиационной медицине» (С-Петербург, 1993 и 1995), на 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов (РААКИ), (Москва, 1997), на 5-м Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), на Всероссийском совещании "Клеточная биология на пороге XXI века" (С-Петербург, 2000), на восьми Всероссийских научных конференциях с международным участием "Дни иммуггологии в Санкт-Петербурге"( 1996-2005), на XI и ХН-м международных совещаниях по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика. Л.А.Орбели (С-Петербург 2001 и 2006), на международных конференциях по медицинской биотехнологии «Иммунизация и СПИД» и «Биотехнология С-Петербург-94» (С-Петербург, 1991 и 1994). Результаты исследования были доложены и обсуждены на международных симпозиумах: «Регуляция и клиническое значение IgE» (Москва, 1990), «Множественная миелома. Достижения в биологии и лечении» (Вена, 1996), «Достижения в клинической вирусологии -IV» (Гамбург, 1998), «Эволюция системы иммунитет» (Йена, 1999), на IV международном симпозиуме по клинической иммунологии (Амстердам, 1997), на Х1-м международном конгрессе по иммунологии (Стокгольм, 2001).
Диссертационная работа прошла апробацию на расширенном совместном заседании проблемных комиссий «Медицинская биотехнология» и «Медицинская радиобиология» ФГУ ЦЫИРРИ, а также на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН.
Публикации. Результаты работы отражены в 4-х авторских свидетельствах на изобретения, в 23-х статьях и 40 тезисах докладов на Международных, Всесоюзных и Всероссийских конференциях, съездах и симпозиумах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, пяти глав, содержащих изложение и обсуждение результатов исследования, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 85 рисунками и 48 таблицами. Список цитированной литературы содержит 350 источников.
![Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс]](/i/i/4438/210884.png "Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс] Вязникова Татьяна Владимировна")