Введение к работе
Актуальность проблемы. Со второй половины XX века для решения многих теоретических и практических задач медицинской науки и здравоохранения начали активно использовать метод мониторинга (Стародубов В И. с соавт, 2003, Щепин О П., 2001, Петров Р В , 1995)
В медицине понятие мониторинг подразумевает систему наблюдений, анализа, оценки и прогноза состояния здоровья населения и среды обитания человека, а также определение причинно следственных связей между состоянием здоровья человека и воздействием факторов среды обитания человека (Стародубов В И с соавт., 2003)
Метод мониторинга широко используется при иммунологических исследованиях на популяционном уровне Петров Р В, Хаитов Р М. и их коллеги (Петров РВ. с соавт, 1992, 1995, Хаитов РМ с соавт., 1995, Орадовская ИВ, 1991, Черешнев В А, 2000) положили начало проводимым в разных регионах России исследованиям в области экологической иммунологии Результаты этих исследований позволят разрабатьшать методы предупреждения критических (неблагоприятных) воздействий разнообразных факторов внешней среды на здоровье людей, проживающих и работающих на территориях разного масштаба (предприятие, город, регион)
По результатам мониторинга, итогом вакцинопрофилактики в последние десятилетия XX века стала ликвидация полиомиелита в России, превращение массовых детских инфекций (дифтерия, коклюш, корь) в спорадические, а также существенное снижение заболеваемости вирусным гепатитом В, краснухой, паротитом (Покровский ВИ, Онищенко ГГ., Черкасский Б.Л, 2003г) Однако проблема инфекционных заболеваний как серьезной угрозы здоровью населения сохраняется и по прогнозам специалистов будет существовать впредь (Онищенко Г Г, 2007)
В последние годы возрастает внимание к условно патогенным микроорганизмам (УПМ), которые являются этиологическими возбудителями заболеваний человека. Так, Ecoli ассоциирована с 80% циститов в России (Страчунский Л С с соавт., 2002) S pneumoniae является возбудителем
внебольничных пневмоний в 30,5% случаев (Щерба Ю В. Гончарова И.В, 2005) По данным официальной статистики в нашей стране ежегодно регистрируется от 30 до 50 тыс случаев внутрибольничных инфекций, возбудителями которых, как правило, являются УПМ (Семина Н А с соавт, 2000, Ясинский А А с соавт, 2005)
В настоящее время хорошо аргументирована связь инфекционного процесса с пуском аутоиммунных реакций (Behar SM, Porcelh SA., 1995, Anders HJ et al, 2005; Fae K.C et al, 2005). Полагают, что условно патогенным микроорганизмам принадлежит существенная роль в индукции многих аутоиммунных состояний (Malkiel S. et al, 2000, Caballero E et al, 2001, Snider LA., Swedo SE, 2003, Gangi E et al, 2004, Newkirk MM. et al, 2005)
В свете изложенного становится очевидным, что мониторинг инфекций, вызываемых условно патогенными микроорганизмами, и исследование вероятности развития при этом аутоиммунных процессов представляет как теоретический, так и практический интерес Однако к началу наших исследований такого рода работы практически не проводились, поскольку не было системы, позволяющей одновременно определять антитела (AT) к широкому спектру УПМ и аутоантигенам основных органов человека Решению сформулированной проблемы посвящена наша работа При этом мы исходили из предположения, что решение такой задачи возможно при использовании твердофазного ИФА с сорбцией на отдельных стрипах полистирольного планшета различных антигенных (АГ) препаратов, что позволяет проводить комплексную оценку уровня антибактериальных антител и аутоантител
Целью исследования явилось создание и оценка эффективности иммуноферментной системы для одновременного мониторинга антител к антигенам условно патогенных бактерий и аутоантител к антигенам основных органов-мишеней и органонеспецифическим антигенам человека
Задачи исследования
1 Сформулировать и обосновать принципы создания скрининговых иммуноферментных тестов для мониторинга специфических IgG антител к
бактериальным и тканевым антигенам
2 Разработать на основе сформулированных принципов
иммуноферментную тест-систему для мониторинга IgG антител к условно
патогенным бактериям
3 Разработать иммуноферментную тест-систему для мониторинга IgG
антител к различным антигенам тканей органов человека и
органонеспецифическим антигенам
4. Провести мониторинг антител к условно патогенным бактериям и тканевым антигенам в различных группах клинически здоровых людей и работающих в экологически неблагоприятных условиях
5 Провести мониторинг антител к условно патогенным бактериям и тканевым антигенам в группах больных различными формами соматической и аутоиммунной патологии
Научная новизна
1 Впервые определены, научно обоснованы и реализованы принципы
разработки иммуноферментной системы для мониторинга широкого спектра
антител.
-использование в едином тесте модулей различной специфичности,
-применение антигенов, обладающих видовой (клеточные стенки условно
патогенных бактерий) и органной (микросомальные субклеточные фракции)
специфичностью,
-применение единого внутреннего контроля;
-применение единого способа выражения и оценки результатов ИФА
Впервые разработана система для мониторинга антител к условно патогенным бактериям и к тканевым антигенам Максимально унифицированная система впервые дает возможность определять специфические IgG антитела в едином тесте к антигенам 14-ти видов условно патогенных бактерий, 4-м органонеспецифическим и 11-ти антигенам органов-мишеней
Продемонстрирована перспективность использования разработанной
системы для мониторинга IgG антител у клинически здоровых людей, лиц,
работающих в экологически неблагоприятных условиях, лиц 65 лет и старше,
пациентов с различными формами соматической, аутоиммунной и эндокринной патологии
4. Впервые определены нормальные уровни IgG антител для каждого из антигенов системы, которым соответствуют показатели разности оптической плотности (ДОП) в сыворотках 90% клинически здоровых людей от -0,1 до +0,1 для тканевых и от -0,2 до +0,2 для бактериальных антигенов Показатели выше нормы были характерны не более чем для 5% лиц этой группы
Впервые показано, что разработанная система может быть использована для оценки влияния экологически неблагоприятных факторов Обследование работников подземных сооружений Московского метрополитена выявило двукратное увеличение частоты обнаружения повышенных уровней IgG антител одновременно к бактериальным и тканевым антигенам (у работников метрополитена 16,4% против 8,2% у доноров, р<0,05)
Впервые дана комплексная характеристика спектра антибактериальных и противотканевых антител при различных видах соматической и аутоиммунной патологии
показано преимущественное наличие повышенных уровней антител к конкретным видам условно патогенных микроорганизмов и/или тканевым антигенам;
выявлено наличие повышенных уровней антител к трем и более бактериальным и/или тканевым антигенам (от 17,0% до 34,4% при различных заболеваниях против 5,2% у здоровых к бактериальным и от 13,3% до 30,2% против 0% у здоровых к тканевым антигенам),
- выявлено наличие одновременно повышенных уровней антител к
бактериальным и тканевым антигенам (35,1% при аутоиммунных заболеваниях
против 8,2% у здоровых)
7 Показано, что аутоиммунные процессы являются составляющей патогенеза многих соматических заболеваний бронхолегочных, желудочно-кишечных, сердечно-сосудистых, мочевыводящей системы При этих заболеваниях наличие аутоантител сочеталось с выявлением антител к условно патогенным бактериям (например у больных колитом определяли антитела к
антигенам тканей толстого кишечника-58,8%, тонкого кишечника-41,2%,
почек-52,9% и клеточным стенкам Ecoh-23,5%, Р aeruginosa-41,2%, Р mirabihs-5%,%%)
8 Разработанная система позволила установить полиорганный характер органоспецифических аутоиммунных заболеваний выявлен высокий уровень аутоантител не только к антигенам органа-мишени, но и к другим органам и тканям
при сахарном диабете I типа- антитела к антигенам микросомальной фракции ткани поджелудочной железы, коллагену, эластину, почек, щитовидной железы, желудку, надпочечников,
при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы — антитела к эластину, коллагену, а также к микросомальным фракциям тканей щитовидной железы, желудка, надпочечников, поджелудочной железы
Практическая ценность
Разработана скрининговая тест-система для определения IgG антител- к антигенам клеточных стенок (КС) 14 представителей условно патогенных бактерий (S aureus, S epidermidis, S saprophyticus, Spneumoniae, Streptococus sp, Mluteus, Ecoli, P vulgaris, Pmirabihs, P aeruginosa, H influenzae, К pneumoniae, Y enterocohtwa, M catarrhahs); к 4 органонеспецифическим антигенам (н-ДНК, д-ДНК, эластин, коллаген), к 11 органоспецифическим антигенам (миокард, легкое, почки, печень, тонкий и толстый кишечник, желудок, гипофиз, щитовидная железа, поджелудочная железа, надпочечник)
Разработанную тест-систему можно использовать для контроля содержания антител к антигенам условно патогенных бактерий в сыворотке крови доноров, для эколого-иммунологического мониторинга лиц, проживающих и работающих в неблагоприятных условиях, выявления неблагополучия в состоянии иммунитета у лиц с различными заболеваниями, для наблюдения за эффективностью проводимого лечения, для выявления распространенности аутоиммунного процесса и его преимущественной направленности, в научных исследованиях в области биологии и медицины
Система прошла экспертизу и контроль в ГИСК им Тарасевича
Рекомендована Комитетом иммунобиологических препаратов к регистрации в
РФ (протокол №10 от 24 12 2003 г) Документация и система полностью готовы к производственному выпуску Лабораторные серии системы использованы для научных исследований в ГУ гематологический научный центр РАМН, ФГУ МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росздрава и др Основные положения, выносимые на зашиту
1 Основными принципами создания систем для мониторинга IgG
антител к бактериальным и тканевым антигенам являются использование
широкого спектра антигенов, позволяющих проводить комплексную оценку
специфического гуморального иммунитета (мультимедийность); применение в
качестве антигенов условно патогенных бактерий клеточных стенок,
содержащих видовые антигены, а в качестве тканевых антигенов -
микросомальных фракций, содержащих основные органоспецифические АГ,
использование единого внутреннего контроля и единого способа выражения
результатов ИФА, позволяющих унифицировать оценку результатов
определения антител любой специфичности
Разработанная иммуноферментная система на основе антигенов 14 представителей условно патогенных бактерий, 4 органонеспецифических и 11 антигенов органов мишеней, обладает высокой чувствительностью (>90%), специфичностью (>95%) и надежностью (коэффициент вариации < 8%)
Мониторинг сывороток клинически здоровых людей свидетельствует, что более 90% сывороток имеют показатели разности оптической плотности (ДОП) от -0,1 до +0,1 для тканевых антигенов, и от -0,2 до +0,2 для бактериальных антигенов, что позволило принять указанный диапазон за норму Повышенный уровень AT к бактериальным, а также к тканевым АГ наблюдается, как правило, не более, чем в 5% случаев
4 Показатели адаптивного иммунитета у людей, больных
различными заболеваниями, достоверно отличаются от таковых у клинически
здоровых по спектру определяемых антител, по существенно меньшей доле
людей с нормальными показателями уровня антител к бактериальным и
тканевым антигенам (от 22,9% до 42,8% у больных и 67,5% у здоровых); по
количеству людей с повышенным уровнем антител к трем и более
бактериальным (от 17,0% до 34,4% у больных и 5,2% у здоровых) или
тканевым антигенам (от 11,6% до 30,2% у больных и 0% у здоровых), по частоте одновременного определения высокого уровня антител к бактериальным и тканевым антигенам (в 35,1% у больных АИЗ и в 8,2% у здоровых).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 51 печатная работа, из них 23 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получены 4 патента РФ на изобретения
Основные результаты работы доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов» (Тбилиси, Грузия, 1999 г.), III съезде иммунологов России (Сочи, 2000 г), заседании секции медицинской микробиологии и химиотерапии в МНИИЭМ им Габричевского (Москва, 2001г); 5-м конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002 г), 3-ем Международном конгрессе по аутоиммунитету (Женева, Швейцария, 2002г); научно-практической конференции «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и охраны здоровья населения центрального региона России» (Смоленск, 2002 г), Российской научно-практической конференции «Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг» (Москва, 2002 г), IV, V и XI Всероссийских научных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С-Петербург, 2002, 2003, 2007гг); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (Пермь, 2003 г), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004 г), 1-ой Международной научной конференции «Донозология 2005» (Санкт-Петербург, 2005 г), 1-ой Московской международной конференции «Естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2005 г), 5-й международной конференции «Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии» (Москва, 2006 г.); 6-м съезде гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь (Минск, 2007 г)
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 239
