Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. СТАФИЛОКОККОВЫЕ ИНФЕКЦИИ
1.1.1. НОМЕНКЛАТУРА
1.1.2. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
1.1.3. ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ ST.AUREUS
1.1.4. МИКРОБИОЛОГИЯ
1.1.5. ИММУНОЛОГИЯ
1.1.5.1. Иммунный ответ на St.aureus
1.1.5.2. Уклонение от иммунного ответа
1.2. ГЕРПЕС-ВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ
1.2.1. НОМЕНКЛАТУРА
1.2.2. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
1.2.3. ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ HSV1 и HSV
1.2.4. ВИРУСОЛОГИЯ
1.2.5. ИММУНОЛОГИЯ
1.2.5.1. Иммунный ответ на HSV инфекцию
1.2.5.2. Уклонение от иммунного ответа
1.3. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА
1.3.1. РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ
1.3.1.1. Принцип РТМЛ
1.3.1.2. Клиническое значение РТМЛ
1.4. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА МИГРАЦИЮ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУПП
2.2. РЕАКТИВЫ и РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
2.2.1. РЕАКТИВЫ
2.2.2. РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
2.2.3. ОСНОВНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
2.3. МЕТОДЫ
2.3 .1 . ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ
2.3.2. РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ (МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД)
2.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ ЛЕЙКОЦИТАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
2.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ПРОДУКЦИИ ЛИПОТЕИХОЕВЫХ кислот
2.3.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОТИПА ЛИМФОЦИТОВ с помощью MOIЮКЛОН АЛ ьных АНТИТЕЛ
2.3.6. ОЦЕНКА КОМПОНЕНТОВ ГУМОРАЛЬНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА
2.3.7. ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ
2.4. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА В ГРУППЕ ДОНОРОВ
3.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ
3.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДЕКСА ПОДАВЛЕНИЯ МИГРАЦИИ
3.1.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЦИТОКИНОВ
3.1.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЛИПОТЕИХОЕВЫХ КИСЛОТ
3.2. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА В ГРУППЕ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ПИОДЕРМИЕЙ
3.2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ
3.2.2. ПОКАЗАТЕЛИ ИПМ у ПАЦИЕНТОВ С УЧЕТОМ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПРИ ОБОСТРЕНИИ И В РЕМИССИЮ ПИОДЕРМИИ
3.2.3. АНАЛИЗ КОРРЕЛЯЦИИ ИПМ с ПОКАЗАТЕЛЯМИ ИММУННОГО СТАТУСА
3.2.4. ПОКАЗАТЕЛИ ИПМ с УЧЕТОМ ОТВЕТА НА ST.AUREUS В РТМЛ ПРИ ОБОС ТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ПИОДЕРМИИ
3.2.4.1. Характеристика группы 1.1. и группы
3.2.4.2. Изменение ИПМ у пациентов группы 1.1. и группы
3.2.4.3. Показатели иммунного статуса у пациентов группы 1.1. и группы
3.2.4.4. Изменение ИПМ в динамике у пациентов группы 1,1. и
3.2.5. ПОКАЗАТЕЛИ ИПМ с УЧЕТОМ ОТВЕТА НА ST.AUREUS В РТМЛ в РЕМИССИЮ ХРОНИЧЕСКОЙ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ПИОДЕРМИИ
3.2.5.1. Характеристика группы 2.1. и группы
3.2.5.2. Изменение ИПМ у пациентов группы 2.1. и группы
3.2.5.3. Показатели иммунного статуса у пациентов группы 2.1. и группы
3.2.5.4. Изменение ИПМ в динамике у пациентов группы 2.1. и группы
3.3. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА В ГРУППЕ ПАЦИЕНТОВ с ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
3.3.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ
3.3.2. ПОКАЗАТЕЛИ ИПМ у ПАЦИЕНТОВ С УЧЕТОМ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПРИ ОБОСТРЕНИИ И В РЕМИССИЮ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ S
3.3.3. АНАЛИЗ КОРРЕЛЯЦИИ ИПМ с ПОКАЗАТЕЛЯМИ ИММУННОГО СТАТУСА
3.3.4. ПОКАЗАТЕЛИ ИПМ с УЧЕТОМ О ГВЕТА НА HSV1 и HSV2 в РТМЛ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
3.3.4.1. Характеристика группы 1.1. и группы
3.3.4.2. Изменение ИПМ у пациентов группы 1.1. и группы
3.3.4.3. Показатели иммунного статуса у пациентов группы 1.1. и группы
3.3.5. ПОКАЗАТЕЛИ ИПМ с УЧЕТОМ ОТВЕТА НА HSV1 и HSV2 в РТМЛ в РЕМИССИЮ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
3.3.5.1. Характеристика группы 2.1. и группы
3.3.5.2. Изменение ИПМ у пациентов группы 2.1. и группы
3.3.5.3. Показатели иммунного статуса у пациентов группы 2.1. и группы
3.3.6. ИЗМЕНЕНИЕ ИПМ У ПАЦИЕНТ ОВ С ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ В ДИНАМИКЕ
3.4. ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ ЛЕЙКОЦИТАМИ КРОВИ
3.4.1. ПРОДУКЦИЯ TNF-A
3.4.2. ПРОДУКЦИЯ IFN-GAMMA
3.4.3. ПРОДУКЦИЯ MIF
3.4.4. ПРОДУКЦИЯ IL-
3.4.5. КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РТМЛ и УРОВНЯ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ
3.5. ПРОГНОЗ
3.5.1. ПРОГНОЗ ИЗМЕНЕНИЯ ИПМ для ПАЦИЕНТОВ С ПИОДЕРМИЯМИ
3.5.2. ПРОГНОЗ ИЗМЕНЕНИЯ ИПМ для ПАЦИЕНТОВ с ГЕРПЕСОМ
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ _
4.1. ПИОДЕРМИИ
4.2. ГЕРПЕС-ВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ
ВЫВОДЫ
Введение к работе
Актуальность темы диссертации Главными задачами при оценке иммунного статуса у пациентов с хроническими инфекционными заболеваниями являются выявление нарушенного звена иммунитета, прогноз тяжести течения заболевания и, безусловно, оценка эффективности проводимой терапии (Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, 2001).
Несмотря на успехи в диагностике, определении иммунопатогенеза, фармакотерапии и профилактике таких инфекционных заболеваний как пиодермии и герпес-вирусная инфекция (ГВИ), число случаев появления как первичной, так и обострения хронической инфекции непрерывно растет.
Распространенность генитального герпеса в зависимости от экономического уровня развития страны может колебаться от 2 до 74%. Значительное увеличение в последние 30 лет случаев генитального герпеса среди старших подростков и среди взрослых становиться большой проблемой общества. Поскольку обращаемость к специалистам в России не превышает 15%, то ориентировочное число больных только генитальным герпесом составляет порядка 8-11 млн. человек. Число случаев лабиального или других форм ГВИ на порядок выше. Герпес является причиной смерти в 16% случаев смертей от инфекций (данные WHO, World Health Organization, 2008), также он может увеличить риск передачи и заражения ВИЧ/СПИД. Хронические рецидивирующие пиодермии (ХРП) по данным отечественных и зарубежных исследований занимают до 45% в общей структуре дерматологической патологии (С.В.Масюкова и др., 2004). Значительная доля среди пиодермии принадлежит стафилодермиям, причиной развития которых является St.aureus. По данным WHO (2008) инфекции, вызываемые St.aureus, в 30% приводят к летальному исходу.
Широкое распространение этих групп заболеваний обусловливает тот факт, что с ними сталкиваются врачи практически всех специальностей. Часто обострения пиодермии приводят к временной нетрудоспособности, это так же, как и в случаях с ГВИ, определяет социальную составляющую этих патологий (Fearon D.T. and Locksley R.M., 1996; Hiramatsu К., 2001; Weigel L.M. et al, 2003).
Значительному распространению ХРП и ГВИ способствует их, как правило, хроническое, вялотекущее, с частыми случаями рецидивирования течение, которое трудно поддается этиотропному лечению. Такие инфекции относят к проявлению вторичных иммунодефицитов (Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, 2001). Подсчитано, что более 80% первоначальной и рецидивирующей гениталыюй инфекции не диагностируются, т.к. инфекция обычно бессимптомна или иераспознана (А.Е. Шульженко, 2005). Комплексная терапия ХРП с использованием иммуномодуляторов остается неэффективной в 16-53% случаев (О.А.Щербакова, 2004). Изучению особенностей функционирования иммунной системы при ХРП и ГВИ посвящено множество научных работ, в которых доказана значимость иммунологических нарушений в патогенезе этих инфекций (Л.Н.Савицкая, 1987; Posavad М. et al, 1993, 1994, 1997; Н.Х.Сетдикова, Т.В.Латышева, 2000; Roizman В. et al, 1970, 1992, 2001; Pollara G., 2003, 2004; А.Е.Шульженко и др., 2003, 2005, Langley R. et al, 2005). Одним из них является нарушение подвижности лейкоцитов, что определяет иммунопатогенез этих заболеваний, поскольку лейкоцитам как основным участникам врожденного и адаптивного иммунитета принадлежит ведущая роль в развитии вирусных и бактериальных инфекций (Janeway Ch.A. et al, Очевидно, что одним из успешных критериев эффективной терапии ХРП и ГВИ является своевременная диагностика. С этой точки зрения исследование специфического иммунитета и индивидуальный подбор адекватной терапии являются актуальной проблемой иммунологии (Wagner J.G. and Roth R.A., 2000).
В настоящий момент существует достаточное количество методов для оценки специфического клеточного иммунитета (Wu А., 1988; Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, 1995; А.А.Ярилин, 1999; Williams R.J. et al, 2000; Р.М.Хаитов и др., 2002). Среди наиболее доступных и простых выделяется реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) (А.П.Суслов и др., 1989), которая была усовершенствована и адаптирована для поточных исследований в клиникодиагностических лабораториях (Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, 1995).
Преимуществами данного теста, помимо простоты, быстроты постановки и минимального воздействия на клетки, является также использование микроколичеств тест-клеток, четкость и простота оценки результатов, небольшой разброс параллелей (не более 10%) и использование простого оборудования (штатив «МигроСкрин»), что позволяет тестировать до 150 проб одновременно (А.П.Суслов и др., 1989).
Применение РТМЛ в клинической и экспериментальной практике в качестве одного из чувствительных и информативных тестов на состояние антигенспецифической гиперчувствительности лейкоцитов, а также на активность растворимых факторов, ингибирующих или стимулирующих их миграцию, и, следовательно, возможность эффективной оценки обеих сторон регуляции миграции клеток, должно помочь дальнейшему изучению причин рецидивирования и хронизации пиодермии и герпеса, прогнозированию их течения и подбора адекватной терапии.
Цель работы Целью работы явилось исследование иммунного ответа на специфические микроорганизмы у пациентов с хроническими бактериальными и вирусными инфекциями с помощью модифицированного метода РТМЛ. Задачи исследования
1. Исследовать группу здоровых доноров с помощью метода РТМЛ с целью определения интервалов нормальных значений показателей.
2. Исследовать с помощью метода РТМЛ группы пациентов с ХРП и ГВИ. Оценить динамику ответа в РТМЛ на поликлональный активатор (ФГА) и этиологически значимые микроорганизмы (St. aureus, HSV1, HSV2).
3. Оценить у этих групп пациентов корреляцию между ответом в РТМЛ, клинической картиной и стандартными параметрами иммунного статуса (субпопуляционный состав лимфоцитов крови, фагоцитарная и бактерицидная активность лейкоцитов крови, уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови).
4. Исследовать продукцию цитокииов и хемокинов (TNF-a, IFN-y, MIF, IL-8) у доноров и пациентов с ХРП и ГВИ. Оценить корреляцию между продукцией цито- и хемокинов и ответом в РТМЛ на ФГА, St. aureus и HSV.
5. Определить лабораторные критерии оценки тяжести состояния и прогноза течения заболевания по результатам РТМЛ. Научная новизна Впервые проведена оценка клеточного ответа у больных ХРП и ГВИ с помощью модифицированной реакции торможения миграции лейкоцитов.
Исследован ответ в РТМЛ у данных групп пациентов при стимуляции как специфическими микроорганизмами (St.aureus для пациентов с ХРП и HSV1, HSV2 для пациентов с ГВИ), так и не специфическими (HSV1, HSV2 для пациентов с ХРП и St.aureus для пациентов с ГВИ, соответственно). Продемонстрирована зависимость изменений в РТМЛ от степени тяжести и стадии заболевания у данных групп пациентов. Исследовано изменение ответа в РТМЛ на вышеперечисленные стимулы в динамике на фоне лечения.
Была проведена оценка продукции хемо- и цитокииов (TNF-a, IFN-y, IL-8 и MIF) под действием различных стимулов (ФГА, St.aureus, HSV1, HSV2) у данных групп пациентов и здоровых доноров. Определены основные закономерности соотношения системы хемо- и цитокииов с РТМЛ у пациентов с хроническими рецидивирующими пиодермиями и герпес-вирусной инфекцией. Показан различный характер изменений в продукции хемо- и цитокииов у пациентов с ХРП и ГВИ и его корреляция с РТМЛ. Выявленные изменения продукции IL-8, MIF и IFN-y у пациентов с ХРП и ГВИ могут указывать на возможные нарушения миграции лейкоцитов в воспалительный очаг при данных инфекциях. Также была показана корреляция между ответом в РТМЛ на St.aureus и стафилококк-индуцированной продукцией IL-8 лейкоцитами, а также между ответом в РТМЛ на HSV-1 и HSV-1- индуцированной продукцией IFN-y.
Впервые проведен анализ по определению лабораторных критериев оценки тяжести состояния и прогноза течения заболевания по результатам РТМЛ. Для пациентов с ХРП средиз зданных РТМЛ и иммунограммы значимым параметром, влияющим на степень тяжести заболевания, являлся только ИПМ в ответ на St.aureus. Для пациентов с ГВИ значимого критерия выявлено не было.
Практическая значимость работы С учетом полученных данных модифицированный метод РТМЛ целесообразно применять для комплексной оценки иммунного статуса у больных с ХРП и мониторинга иммунного ответа на специфический возбудитель в ходе лечения. Данные РТМЛ в наибольшей степени отражают степень тяжести заболевания у пациентов с ХРП. Также ИПМ81 может быть использован, как критерий для прогноза динамики заболевания.
Зависимость между ИПМ и продукцией IL-8 и IFN-y, а также отличия в уровне продукции MIF, TNF-a от показателей доноров позволяют говорить о выявленных функциональных нарушениях иммуноцитов, и могут помочь в дальнейшем определении механизмов иммунопатогенеза ХРП и ГВИ. РТМЛ легко воспроизводима в условиях любой клинико-диагностической лаборатории, не требует дорогостоящего оборудования и большого расхода реагентов, адаптирована для поточных исследований, и поэтому может иметь широкое применение на практике.
Кроме того, практикующие врачи получают дополнительные критерии для оценки течения патологического процесса, для подбора адекватной терапии и своевременной ее коррекции. Также результаты работы могут быть использованы в учебном процессе студентов ВУЗов и курсантов последипломного образования.
Метод модифицированной РТМЛ внедрен в практику в лаборатории клинической иммунологии ГП ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России».
