Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 10.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 26.
/. /. Вирусные гепатиты: общее и особенное 26.
1.2. Иммуноферментный анализ а диагностике гепатита С 31.
1.3. Различные варианты течения HCV-иифещии и дифференциально-диагностические критерии 39.
1.4. Гепатит D 44.
1.5. Исследование ВГЛ-инфекции с помощью синтетических пептидов...49.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52.
2.1. Методы компьютерного анализа белковых последовательностей 52.
2.2. Твердофазный синтез пептидов 52.
2.3. Серологическое исследование опитопов белка NS5 вируса гепатита С 57.
2.4. Спектр антител к различным антигенам HCV при различных вариантах течения хронической HCV-иифекции 59.
2.5. Исследование сероконверсии антител у больных ГС с использованием синтетических пептидов, моделирующих иммуиодоминантные антигенные детерминанты ВГС 61.
2.6. Исследование сероконверсии антител у больных ГС на основе моделирования антигенов ВГС с использованием синтетических пептидов и гениоинжеиериых полипептидов 62.
2.7. Выявление типоспецифических anli-HCNS4 антител у больных гепатитом С методом иммуиоферментного анализа 63.
2.8. Серологическое исследование иммуиодоминантного участка нуклео капсидиого белка вируса гепатита дельта 66.
з
2.9. Исследование антигенных свойств пептидов, соответствующих фрагментам последовательности белка нуклеокапсида IIDV различных генотипов 70.
2.10. Разработка новых иммунофермеитных тест-систем для диагностики гепатита D на основе синтетических пептидов 78.
2.11. Исследование особенностей взаимодействия антиген - антитело при использовании линейных синтетических пептидов и мультипептидного антигена, моделирующих антигенные детерминанты вируса гепатита А 82.
2.12. Статистический анализ 90.
Глава 3. СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭПИТОПОВ БЕЛКА NS5 ВИРУСА ГЕПАТИТА С И РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ЧЕТВЁРТОГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ANTI-IICV 91.
Глава 4. СПЕКТР АНТИТЕЛ К РАЗЛИЧНЫМ АНТИГЕНАМ HCV ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ HCV-ИНФЕК ЦИИ 106.
Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ СЕРОКОПВЕРСИИ АНТИТЕЛ У БОЛЬНЫХ ГС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ, МОДЕЛИРУЮЩИХ ИММУНОДОМИНАНТНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ВГС 111.
Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЕ СЕРОКОНВЕРСИИ АНТИТЕЛ У БОЛЬНЫХ
ГС НА ОСНОВЕ МОДЕЛИРОВАНИЯ АНТИГЕНОВ ВГС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И ГЕИМОИНЖЕНЕРНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ 128.
Глава 7. ВЫЯВЛЕНИЕ ТИНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ANTI-HCNS4 АНТИ
ТЕЛ У БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕІІТНОГО
АНАЛИЗА 135.
Введение к работе
Гепатиты С и дельта являются актуальными проблемами для здравоохранения Российской Федерации в связи с высокими показателями инвалидизации и смертности в результате этих заболеваний и их последствий. Не менее 10.000 человек в год умирает в России в результате заболеваний парентеральными гепатитами и их отдалённых последствий, и есть все основания ожидать роста этого показателя в дальнейшем [17]. Проблема гепатита А (ГА) актуальна в связи с периодическими подъёмами заболеваемости этой инфекцией. Согласно официально регистрируемым данным за период с 1995 по 2005 годы заболеваемость ГА в Российской Федерации находилась в пределах от 28,3 до 123,5 заболевших на 100.000 населения в целом по стране.
В основе диагностики вирусных гепатитов лежит выявление маркёров этих инфекций высокочувствительным методом иммуноферментного анализа. Однако достижение высокой чувствительности современных иммунофермеитных тест-систем сопряжено с некоторыми проблемами в обеспечении специфичности, что может приводить к появлению ложноноложительпых результатов, а также расхождений в результатах исследований при использовании тест-систем различных фирм-производителей. Кроме того, генетическая вариабельность вирусов - этиологических агентов гепатитов, также может приводить к различиям в детекции маркёров этих вирусов. Поэтому одним из путей создания эффективных диагностических препаратов является использование синтетических пептидов, моделирующих конкретные антигенные детерминанты вирусных белков. Знание особенностей строения, предопределяющих активность и специфичность этих участков, позволяет более точно ориентироваться при поиске В-эпитопов в аминокислотной последовательности белка, а также формирует подходы к пониманию патогенеза и саногенеза вирусных инфекций, связанных со сложным взаимодействием между вирусом и иммунной системой человеческого организма.
Трудности анализа антигенных детерминант вируса гепатита А (ВГЛ) обусловлены их конформациониой структурой. В связи с этим перспективным представляется использование более сложных нелинейных синтетических пептидов, втом числе и являющихся гетерогенными антигенами.
Для диагностики ГС в настоящее время в клинической практике используются иммуноферментные тест-системы Ш и IV поколений, позволяющие выявлять антитела классов G и М к ВГС. Однако эти тест-системы не позволяют оценить уровень иммунного ответа по отношению к отдельным белкам ВГС и к отдельным эпитопам этих белков. Выявление нуклеиновой кислоты вируса методом полимеразной цепной реакции (ГІІДТ) весьма информативно при проведении эпидемиологических исследований, однако будучи отдельно взятым, этот метод недостаточно информативен при оценке течения заболевания у конкретного больного. Таким образом, подход к диагностике ГС в настоящее время принципиально отличается от серологического обследования больных гепатитом В (ГВ) например, которое носит гораздо более комплексный характер. Серологическое обследование больного ГВ - это но сути своей мониторинг различных маркёров, каждый из которых несёт свою информационную нагрузку (IIBsAg, anti-HBcor Ig М, anti-HBcor Ig G, anti-HBs, HBeAg/anti-HBe). Предлагаемый нами комплексный подход к серологическому обследованию актуален для больных ГС не менее, чем для больных ГВ, прежде всего потому, что заболевание ГС значительно чаще переходит в хроническую форму, следовательно, патологический процесс носит более сложи ЕЛИ, более комплексный характер.
Применение пептидных моделей позволяет определять роль отдельных аминокислотных остатков в составе белков, соответствующих различным генотипам вируса гепатита С (ВГС). Ряд авторов указывает на то, что выявление антител к отдельным антигенным детерминантам (белки и отдельные эиитопы) ВГС коррелирует с определенной фазой течения заболевания и позволяет оценить активность патологического процесса [3, 6, 41, 177]. Однако такие исследования, как правило, либо ограничивались сопоставлением частоты выявления Ig G к core- и NS4-6ejiKa\t, либо их титров у различных групп больных, либо проводилось аналогичное сравнительное исследование частоты выявления Ig G и их уровня к отдельным фрагментам из последовательности структурных белков ВГС. В ходе проведения нашего исследования была сопоставлена частота выявления антител (как класса G, так и класса М) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных, в том числе было также проведено исследование спектра антител в динамике у больных ГС с различными исходами заболевания.
Специфическая серологическая диагностика вирусного гепатита дельта является актуальной проблемой здравоохранения. Первоначально в соответствующих диагностикумах использовался вирусный антиген, выделяемый из ткани печени умерших от TD. Более эффективным и безопасным является использование гепноинженерных препаратов или синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные эиитопы HDAg. Однако использование рекомбинантного HDAg имеет свои недостатки. Рекомбинантные белки состоят из целевого протеина и дополнительных полинептидов, из-за которых иммуиоферментная реакция иногда дает
ложноположительные результаты. Поэтому одним из путей создания
эффективных тест-систем для диагностики дельта-инфекции является
использование синтетических пептидов, моделирующих конкретные
антигенные детерминанты белка вирусного пуклеокапсида. Кроме того,
синтетические пептиды легче и дешевле очистить, чем гспиоинжепсрные
препараты.
В настоящее время известны нуклеотидные последовательности РНК HDV и
аминокислотные последовательности HDAg, полученные из различных
географических регионов [53, 57, 58,84,94, 96,97,107,144, 157,169,178]. В
соответствии с принятой классификацией, большинство таких
последовательностей принадлежит к первому типу HDV. Второй тип, наряду с первым, встречается в Азии. HDV третьего типа циркулирует в Южной Америке. Данные о генотипах HDV, циркулирующих на территории РФ очень ограничены и противоречивы.
По одним данным, расшифрованная нуклеотидная последовательность генома российского изолята HDV наиболее близка к последовательностям молдавских и болгарского изолятов, относящихся к генотипу IB [146]. По другим - нуклеотидные последовательности геномов HDV, кодирующих С-концевую часть HDAg и циркулирующих в Северо-Западном регионе России, относятся к IA генотипу IIDV [29].
Вышеизложенные факты свидетельствуют, таким образом, об актуальности использования синтетических пептидов для дальнейшего исследования дельта-инфекции, в том числе - для разработки соответствующих диагностических препаратов. В диссертации представлены результаты серотипирования HDV, циркулирующего па территории России, с помощью синтетических пептидов, моделирующих аминокислотные последовательности иммунодоминаитного и
вариабельного участков IIDAg, соответствующих трём известным типам HDV.
ЦЕЛЬЮ диссертационной работы является совершенствование
серологической диагностики гепатитов А, С и дельта на основе исследования особенностей гуморального иммунного ответа но отношению к различным антигенным детерминантам соответствующих вирусов.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1. Исследовать антигенную структуру белков вирусов гепатитов А, С и дельта с помощью пептидных моделей фрагментов аминокислотной последовательности соответствующих вирусных белков.
2. Разработать модификацию иммуноферментного анализа для определения спектра anti-IICV антител и исследовать особенности сероконверсии антител к антигенным детерминантам структурных и неструктурных белков вируса гепатита С у больных с различными исходами острого гепатита С.
3. Разработать модификацию ИФА для выявления типоспецифических anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С.
4. Разработать новый вариант ИФА для диагностики гепатита D на основе синтетических пептидных антигенов.
5. Оценить целесообразность использования гетерогенных тетрамерных
мультииептидных антигенов при разработке новых тест-систем для выявления
серологических маркёров ВГА. Методами, позволяющими реализовать поставленные задачи, являются:
моделирование консервативных иммунодоминантных, а также
вариабельных типоспецифических эпитопов вирусных белков с помощью
синтетических пептидов;
- тестирование серологического материала на маркёры гепатитов Л, В, С и дельта;
- иммупоферментное исследование антигенной активности пептидов с помощью сывороток больных различными вирусными гепатитами;
- метод множественного пептидного исследования (Multiple Peptide Assay [179]);
- исследование корреляции между спектром антител к различным
вирусным белкам, представленным разными антигенными детерминантами и
клинико-биохимическим вариантом течения HCV-инфекции на основе данных
иммуноферментного анализа, общих клинических методик и биохимического
анализа крови обследуемых больных;
- статистический анализ результатов проводился методом оценки
доверительного коэффициента Стыодента - t; различия признавались
достоверными при р 0,05.
