Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Источники интерферона-гамма (IFNy) и мишени 9
Эффекты IFNy 9
Противовирусная активность 10
Действие на пролиферативную активность и контроль апоптоза 11
Влияние на процессинг и представление антигена 12
Влияние IFNy на развитие CD4+ Т-клеток 13
Влияние IFNy на активацию макрофагов 13
Влияние IFNy на гуморальный иммунитет 14
Рецептор интерферона-гамма и сигнальный путь 14
Строение рецептора 14
IFNy - зависимая передача сигнала 15
STAT1 -зависимый сигнальный путь 15
STAT1 -независимая передача сигнала 17
Регуляция передачи сигнала 20
Нарушение продукции IFNy, рецептора IFNy и
сигнального пути у человека 21
Врожденные особенности продукции IFNy 21
Дефекты сигнальных молекул Jak-STAT пути 21
Дефекты субъединиц рецептора 23
Влияние вирусов на систему IFNy 25
Иммунологические нарушения, располагающие к развитию микобактериальных инфекций 27
МАТЕРАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика обследованных групп населения 31
Реактивы и расходные материалы 32
Оборудование 34
Статистическая обработка результатов 34
Забор крови и выделение мононуклеарных клеток 34
Оценка экспрессии CD119 35
Определение CD3+IFNy+-iuieTOK 35
Продукция IFNy и IL12 37
Оценка экспрессии мРНК IFNy в мононуклеарах
периферической крови человека 38
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор методов для оценки системы IFNy и групп больных для проверки целесообразности выбранного комплекса методов 40
Система IFNy у взрослых здоровых добровольцев 43
Система IFNy в группах детей с первичными иммунодефицитами и микобактериальными инфекциями в анамнезе и в период активной
микобактериальной инфекции 45
Экспрессия CD119. 45
Содержание IFNy-продуцирующих лимфоцитов
в периферической крови 46
Продукция IFNy клетками периферической крови 48
Продукция IL12p70 клетками 30%-ной цельной крови и МНК и оценка ответа на IFNy 50
Сравнение группы детей с ПИД и МИ в анамнезе с группой взрослых здоровых добровольцев с целью доказательства правомерности использования группы взрослых доноров в качестве контрольной для детей с активными МИ без признаков ПИД 54
Система IFNy в группах доноров и детей без признаков ПИД и активными
микобактериальными инфекциями 59
Экспрессия CD119 59
Содержание IFNy-продуцирующих лимфоцитов в периферической
крови 59
Продукция IFNy клетками периферической крови 60
Продукция IL12p70 клетками периферической крови и оценка ответа на IFNy 63
Экспрессия MPHKIFNy 66
Клинический пример диагностики нарушений в системе IFNy 68
Корреляционный анализ показателей системы IFNy в группе детей без
признаков ПИД и активными микобактериальными инфекциями и взрослых
здоровых добровольцев 72
Система IFNy у взрослых пациентов с хроническим часто рецидивирующим генитальным герпесом 75
Экспрессия CD119 75
Содержание IFNy-продуцирующих лимфоцитов в периферической крови 75
Продукция IFNy клетками периферической крови 76
Продукция IL12p70 клетками периферической крови и оценка ответа на IFNy 77
ВЫВОДЫ 80
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 82
- Источники интерферона-гамма (IFNy) и мишени
- Характеристика обследованных групп населения
- Выбор методов для оценки системы IFNy и групп больных для проверки целесообразности выбранного комплекса методов
Введение к работе
Важным направлением клинической иммунологии является оценка системы интерферонов, в частности системы интерферона-гамма (IFNy). К функциям этого цитокина относятся противовирусная и антипролиферативная активность, индукция развития ТЫ-клеток, активация макрофагов, контроль апоптоза. Поэтому нарушения в системе IFNy могут иметь самые разные проявления: хронические рецидивирующие вирусные и бактериальные инфекции, онкологические заболевания, заболевания соединительной ткани. Повреждения в системе IFNy могут возникнуть на любом уровне: продукция цитокина, рецепторный аппарат, передача сигнала и, как следствие, нарушение ответа клетки на действие цитокина. Важно определить на каком этапе возникло повреждение, т.к. от этого зависит назначение адекватных терапевтических мероприятий.
В настоящее время в клинической практике используется, в основном, оценка уровня IFNy в сыворотке крови пациентов или продукции IFNy лимфоцитами периферической крови в ответ на неспецифические стимуляторы и не принимаются во внимание другие звенья системы. Однако работы последних лет показывают, что при некоторых вирусных инфекциях (102, 104Х микобактериальных туберкулезных и нетуберкулезных инфекциях (33, 73, 64) нарушена продукция IFNy под влиянием специфических стимуляторов (вирусных или микобактериальных антигенов) и наблюдается снижение ответа клетки на действие IFNy. Кроме того, врожденные дефекты рецептора IFNy также проявляются хроническими инфекциями низковирулентными микобактериями (33, 12). В настоящее время в России практически не используют лабораторные критерии работы системы IFNy для оценки состояния больного и успеха терапии. Поэтому является актуальным внедрение в клинико-диагностическую практику комплекса методов, позволяющего оценивать основные звенья системы IFNy и диагностировать возникающие нарушения.
Цель работы
Целью работы явилось адаптировать для клинического применения комплекс методов для диагностики нарушений в системе IFNy, пригодного для поточных исследований в практике лабораторий клинической иммунологии.
Задачи исследования
Определить комплекс методов, применение которых целесообразно для диагностики нарушений в системе IFNy и выбрать группы больных для проверки работы методов.
Исследовать группу здоровых добровольцев с целью определения интервалов нормальных значений показателей.
Исследовать группу пациентов с предполагаемым нарушением системы IFNy - с микобактериальными инфекциями.
Исследовать группу пациентов с предполагаемым нарушением системы IFNy - с хронической рецидивирующей герпетической инфекцией.
Научная новизна
Впервые предложен и внедрен в клиническую практику комплекс методов, позволяющий оценивать различные звенья системы IFNy: экспрессию рецептора IFNy, продукцию IFNy под влиянием различных стимуляторов, как в цельной крови, так и в мононуклеарных клетках периферической крови, содержание IFNy-продуцирующих клеток, передачу сигнала от рецептора IFNy и ответ клетки на цитокин.
С помощью предложенного комплекса методов исследована система IFNy в норме, определены основные закономерности соотношения параметров системы IFNy.
Продемонстрировано, что при микобактериальных инфекциях наблюдается различный характер нарушений в системе IFNy: снижение продукции IFNy и количества IFNy-продуцирующих лимфоцитов, нарушение ответа на IFNy. У пациентов с хронической герпетической инфекцией, торпидной к стандартной терапии, нарушен ответ МНК на IFNy, а его продукция и количество IFNy-продуцирующих клеток не изменяется.
Практическая значимость работы
С помощью предложенного комплекса методов оценки системы IFNy исследована система IFNy у здоровых добровольцев, определены нормативные показатели, поэтому методы пригодны для применения в любой лаборатории клинической иммунологии, владеющей методами проточной цитофлюориметрии и иммуноферментного анализа.
Источники интерферона-гамма (IFNy) и мишени
IFNy является интерфероном II типа. Молекула человеческого IFNy представляет собой гомодимер, состоящий из двух идентичных N-гликозилированных полипептидных цепей по 17 kDa. Цепи ориентированы антипараллельно, образуя симметричную молекулу. Это свойство позволяет одной молекуле IFNy связываться с двумя молекулами рецептора (28). IFNy кодируется геном, локализующимся в хромосоме 12 (36).
Источниками цитокина служат в основном активированные Т-лимфоциты и NK-клетки (в качестве активаторов выступают антигены, митогены и цитокины) (28), хотя есть данные о продукции IFNy человеческими В-клеточными линиями (118). Среди Т-лимфоцитов продуцентами IFNy являются как цитотоксические CD8+, так и хелперные С04+-клетки, однако при дифференцировке последних на ТЫ и Th2 способность вырабатывать IFNy сохраняют только Thl-клетки (28).
Пик экспрессии гена IFNy приходится на 48 - 72 ч после действия стимуляторов. Продукция IFNy усиливается им самим, а также интерлейкинами 1, 2, 6, 12, 18, факторами роста, эстрогеном (102, 21). Снижение продукции может вызываться глюкокортикоидами, трансформирующим фактором роста р, интерлейкинами 4 и 10 (102,21).
Характеристика обследованных групп населения
С помощью предлагаемого комплекса методов для оценки системы IFNy было обследовано 53 человека. Среди них:
1) Доноры - 16 здоровых добровольцев (7 женщин и 9 мужчин) в возрасте от 18 до 50 лет (М±о, 28,0±6,2),
2) Дети с МИ без ПИД - 20 детей (9 мальчиков и 11 девочек) в возрасте от 0 до 5 лет (М±оу 2,4±1,91) с тяжело протекающими микобактериальными инфекциями (МИ) (M.tuberculosis, M.bovis BCG) без диагностированных ранее признаков первичных иммунодефицитов (ПИД). Среди них 3 пациента с туберкулезной интоксикацией, 2 детей с генерализованной формой туберкулеза, 2 случая осложнения вакцинации BCG, у остальных 13-ти человек - туберкулез внутригрудных лимфоузлов трахеобронхиальной или бронхопульмональной групп. Продолжительность лечения составляла от 6 дней до 18 месяцев и включала антибиотики и витаминотерапию. Все дети находились на стационарном лечении в 7-й клинической туберкулезной больнице г. Москва, врач Ширшов И.В.
3) Дети с ПИД и МИ в анамнезе - 5 детей с первичными иммунодефицитами и МИ (M.tuberculosis, M.bovis BCG) в анамнезе в возрасте от 2 до 7 лет (М±о, 4,7±1,63) среди них 4 пациента с хронической гранулематозной болезнью и 1 с комбинированным неклассифицированным иммунодефицитом. В момент исследования у пациентов не наблюдалось признаков микобактериальной инфекции. Пациенты наблюдались в Республиканской детской клинической больнице, врач Галкина Е.В.
4) Дети с ПИД и острыми МИ - 5 детей с первичными иммунодефицитами и МИ (M.tuberculosis, M.bovis BCG) в остром периоде в возрасте от 2 до 7 лет (М±а, 4,2±2,12) у всех пациентов - хроническая гранулематозная болезнь.. Пациенты находились на стационарном лечении, в Республиканской детской клинической больнице, врач Галкина Е.В.
5) Пациенты с хроническим часто рецидивирующим гениталъным герпесом (ХРГГ) - 7 пациентов в возрасте от 30 до 57 лет (М±а, 39,0±6,3) с хроническим часто рецидивирующим генитальным герпесом (HSV1,2). Частота рецидивов у пациентов более 10 раз в год. Исследование проводилось через 2 недели после окончания рецидива. Все пациенты находились на амбулаторном лечении в Центральной поликлинике Литфонда, врач Черноусов А.Д.
Выбор методов для оценки системы IFNy и групп больных для проверки целесообразности выбранного комплекса методов
При выборе методов для оценки системы IFNy были поставлены следующие условия:
1) комплекс методов должен оценивать все звенья системы IFNy;
2) методы должны быть легко воспроизводимыми с помощью коммерчески доступных реагентов;
3) необходимы количественные параметры оценки различных звеньев системы IFNy.
Были выделены основные звенья системы IFNy: 1) звено продукции IFNy, 2) звено передачи сигнала - рецептор IFNy (лиганд-связывающая цепь CD 119 и проводящая цепь) и сигнальный путь (рис.6).
Звено продукции IFNy включает в себя, в основном, IFNy-продуцирующие лимфоциты. Т.е., уровень IFNy зависит от количества IFNy-продуцирующих лимфоцитов и от их способности синтезировать цитокин в ответ на индуктор. Кроме того, важно учитывать влияние некоторых факторов (цитокины, возможно, другие факторы), которые, действуя на лимфоциты, могут изменять продукцию IFNy. Поэтому было решено использовать 4 параметра для оценки звена продукции IFNy: доля IFNy- продуцирующих клеток, продукция IFNy мононуклеарами периферической крови и клетками цельной крови (для учета влияния факторов плазмы). В случае значительного снижения продукции IFNy для подтверждения нарушения целесообразно исследование экспрессии мРНК IFNy лимфоцитами периферической крови.
Одной из главных мишеней IFNy являются макрофаги и моноциты (рис.6). При наличии нормального рецептора IFNy и полноценного сигнального пути макрофаг активируется и продуцирует IL12p70, который, в свою очередь, индуцирует дифференцировку Thl-клеток. Т.е., продукцию IL12p70 можно считать маркером нормальной работы рецептора и сигнального пути IFNy в макрофагах и моноцитах.
По данным литературы (22) под действием ЛПС МНК способны продуцировать небольшие количества IL12p70, но добавление IFNy должно вызывать существенное повышение продукции IL12p70. Поэтому для оценки звена передачи сигнала было решено использовать разницу продукции IL12p70 под действием ЛПС совместно с IFNy и только ЛПС. Кроме того, необходима проверка наличия лиганд-связывающей цепи.
![Сравнительная эпидемиологическая характеристика некоторых инфекций, возбудители которых передаются половым путем [Электронный ресурс]](/i/i/4491/191885.png "Сравнительная эпидемиологическая характеристика некоторых инфекций, возбудители которых передаются половым путем [Электронный ресурс] Алешина Елена Николаевна")
