Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на то, что за последние годы была разработана эффективная противовирусная терапия для многих вирусных инфекций, количество вирус-ассоциированных заболеваний остается высоким. Рак шейки матки, связанный с персистирующей инфекцией вирусом папилломы человека (HPV) - один из самых распространенных и опасных видов злокачественных новообразований у женщин во всем мире. По данным ВОЗ каждый год в мире диагностируется около 500 000 новых случаев рака шейки матки, который занимает второе место в мире как причина смерти от рака среди женщин. На сегодняшний день, по крайней мере, 700 миллионов человек являются носителями HPV-инфекции, а количество летальных исходов, связанных c HPV-инфекцией, достигает 280 тысяч в год (Waggoner S., 2003; Кулаков В.И.2000; Киселёв В.И, Киселёв О.И., 2003).
Наиболее частыми, до 90% всех случаев инфекционных заболеваний, являются острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ). В России ежегодно регистрируется от 27,3 до 41,2 млн. случаев этих заболеваний (Балаболкин И.И., 2003).
ОРВИ наносят огромный экономический ущерб за счет затраты больших средств на лечение как самого заболевания, так и вызванных им осложнений, кроме того эти вирусы поражают молодое трудоспособное население.
Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция (РСВ) – одна из главных причин тяжелых заболеваний верхних и нижних дыхательных путей у новорожденных и детей раннего возраста. Ежегодно в мире в результате заболеваний нижних дыхательных путей, связанных с РСВ, умирает несколько миллионов детей младше 5 лет. Кроме того, РСВ инфекция, перенесенная в детском возрасте, приводит к развитию гиперчувствительности дыхательных путей у детей и к развитию бронхиальной астмы в дальнейшей жизни (Johnston S.L., 2005).
Таким образом, цель настоящей работы и основные задачи исследования продиктованы повсеместной распространённостью вирусных инфекций, а также тяжестью заболеваний, ассоциированных с различными вирусами и очевидной необходимостью поиска принципиально новых подходов к конструированию лечебно-профилактических средств для профилактики и лечения вирус-ассоциированных заболеваний.
Цель исследования: разработать новые подходы для создания средств профилактики и лечения вирус-ассоциированных заболеваний.
Задачи исследования:
-
Получение дрожжевых репликативных плазмид, предназначенных для экспрессии белка L1 папилломавируса человека серотипов 16 и 18 в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Отработка протоколов выделения вирусоподобных частиц (ВПЧ) в количестве, необходимом для исследования. Тестирование иммуногенности рекомбинантных белков L1 ВПЧ in vivo на мышах.
-
Идентификация консервативных иммунодоминантных эпитопов белков HPV L1 и E7 серотипов вируса 16, 18 и 31.Синтез и очистка пептидов, имитирующих иммунодоминантные эпитопы белков L1 и E7.Тестирование иммуногенности синтезированных пептидов в опытах на мышах.
-
Конъюгирование и комбинирование полученных пептидов с иммуномодуляторами. Определение уровня иммуногенности созданных комбинаций in vivo.
-
Изучение вирус-индуцированной экспрессии и продукции интерферонов первого и третьего типа in vitro. Выявление основного типа интерферонов, продуцируемых эпителиальными клетками при ОРВИ.
-
Изучение генома респираторного синцитиального вируса.
-
Дизайн siRNA против мРНК белка Р респираторного синцитиального вируса.
-
Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р респираторно-синцитиального вируса in vitro в культуре клеток.
-
Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р респираторно-синцитиального вируса in vivo на мышах.
-
Выявление наиболее эффективных siRNA против мРНК белка Р респираторно-синцитиального вируса.
Научная новизна
Впервые в мире показано, что интерфероны третьего типа являются основными интерферонами, продуцируемыми клетками респираторного эпителия при ОРВИ.
Впервые в Российской Федерации созданы дрожжевые штаммы-продуценты, способные экспрессировать рекомбинантные капсидные белки L1 HPV вирусных серотипов 16, 18 в виде ВПЧ. Впервые разработана технология выделения ВПЧ из дрожжевых экстрактов. Были получены пептиды длиной от 9 до 35 аминокислот, представляющие собой фрагменты трансформирующего белка E7 HPV cеротипов 16 и 31 (Т-эпитопы, как основа терапевтических композиций), а также фрагменты L1 HPV16 (иммунодоминантные В- и Т-эпитопы). Полученные данные свидетельствуют, что рекомбинантные ВПЧ индуцируют высокий уровень гуморального иммунного ответа. Свободные рекомбинантные ВПЧ и пептиды из белка Е7 в сочетании с иммуномодуляторами активировали клеточный иммунный ответ. Таким образом, впервые в Российской Федерации получены препараты имеющий профилактический и терапевтический потенциал в отношении HPV- инфекции.
Впервые в Российской Федерации экспериментально изучена возможность использования средств на основе siRNA против вирусов in vitro и in vivo.
Проведен дизайн siRNA против мРНК белка Р респираторно-синцитиального вируса, были сконструированы 6 уникальных экспериментальных образцов siRNA, получивших рабочие названия si01, si03, si05, si07, si09 и si11, нацеленных к различным участкам мРНК белка Р РСВ в пределах открытой рамки считывания.
На модели РС-инфекции в культуре клеток МА104 была проведена оценка противовирусного действия экспериментальных образцов siRNA. Подобранные специфические siRNA эффективно подавляли репродукцию респираторно-синцитиального вируса в культуре клеток.
Впервые в Российской Федерации экспериментальные образцы siRNA проявили противовирусную активность in vivo. Причём полученные в эксперименте на мышах данные подтвердили данные, полученные в культуре клеток.
Таким образом, впервые в Российской Федерации проведенные исследования in vitro и in vivo продемонстрировали противовирусную активность испытанных экспериментальных образцов препаратов по снижению репликации респираторно-синцитиального вируса, одного из главных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы, что делает возможным создание специфических противовирусных средств на основе механизма интерефернции РНК.
Практическая значимость
На сегодняшний день в мире не существует лекарственных средств для эффективной элиминации вирусов из организма человека и лечения социально-значимых вирус-ассоциированных заболеваний. Для решения этой проблемы в данной работе были показаны различные подходы к созданию лечебно-профилактических противовирусных средств.
Разработка предложенных в работе антивирусных препаратов имеет стратегическое значение для биобезопасности Российской Федерации. Так, в эпоху биотерроризма респираторные вирусы, ввиду своей способности быстро инфицировать большое количество людей и вызывать смертельно опасные заболевания, несут в себе огромную опасность для населения страны. Наличие высокоспецифичных и высокоэффективных противовирусных средств, основанных на миРНК, позволит оптимизировать профилактику и лечение состояний, ассоциированных с РСВ.
Кроме того, крайне перспективным представляется экономический эффект от коммерциализации противовирусных препаратов. По данным журнала “Forbes” в США продажи антивирусных препаратов за 2007 год составили 10,6 миллиарда долларов. По прогнозам экспертов из консалтингового агентства Business Communications рост продаж антивирусных препаратов в ближайшие 3 года должен составить около 40%.
По данным ЦМИ Фармэксперт за 2006 год в России объём продаж системных противовирусных препаратов составил 5,37% (4-ое место) от общего объёма продаж лекарственных средств, а по темпам прироста продаж по сравнению с 2005 годом – 62% занял первое место со значительным отрывом от группы препаратов сердечной терапии.
На сегодняшний день существует потребность в создании эффективной противовирусной терапии для предотвращения и лечения состояний и заболеваний, связанных с вирусной инфекцией. Возможность использования предложенных методик в качестве эффективных специфических противовирусных средств, безусловно, должна реализоваться в разработке надежных, безопасных и не дорогих противовирусных терапевтических препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Отработаны протоколы выделения ВПЧ. Препараты ВПЧ из белков L1 HPV cеротипов 16 и 18 наработаны в количестве, необходимом для анализа. Анализ препаратов методами визуализации в геле, иммуноферментным методом при помощи специфических антител, а также методом электронной микроскопии позволил сделать вывод о соответствии полученных частиц искомым вирусоподобным частицам.
2. Полученные препараты ВПЧ из белков L1 HPV cсеротипов 16 и 18 являются высокоиммуногенными антигенами.
3. Выбранные участки аминокислотных последовательностей внутреннего белка Е7 ВПЧ 16 и 31 соответствуют Т-клеточным эпитопам ВПЧ. Синтезированные пептиды обладают специфическими иммуногенными свойствами при использовании с иммуностимулирующими препаратами.
4. Комбинированное использование полученных вирусоподобных частиц, состоящих из белка L1 с пептидами, имитирующими Т-клеточные эпитопы белка Е7, перспективно в контексте создания лечебно-профилактической вакцины против вируса папилломы человека.
5. ИФН- служит основным фактором противовирусной защиты респираторного эпителия.
6. Белок Р является успешной мишенью для эффективного подавления РСВ при помощи siRNA. siRNA к мРНК белка Р респираторно-синцитиального вируса эффективно снижает репликацию РСВ in vitro и in vivo.
7. siRNA может использоваться в качестве специфического противовирусного средства, не влияющего на нормально протекающие процессы в клетке.
8. siRNA может применяться в качестве противовирусного средства без специальных средств доставки в чистом виде при эндотрахеальном и ингаляционном введении, что может использоваться при создании лечебно-профилактических средств против респираторных вирусов.
9. Описана возможность создания эффективного лекарственного средства против РСВ, одного из основных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы, с использованием механизма интерференции РНК.
Апробация работы
Результаты исследования докладывались: на XXII (Париж, Франция 7-11 июня 2003), XXVI (Гётеборг, Швеция, 9-13 июня 2007г.), XXVII (Барселона, Испания, 7-11 июня 2008г.) конгрессах Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии; на XVIII Конгрессе Всемирной Аллергологической Организации (Ванкувер, Канада, 7-12 сентября 2003); на VIII конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 27-29 июня 2007г.); на 1-м на 2-м Международных конгрессах «Иммунитет и болезни: От теории к терапии» (Москва, Россия, 3-7 октября 2005г.; Москва, Россия, 10-14 сентября 2007г.); на конгрессах Американской Академии Аллергологии, Астмы и Иммунологии (Сан Диего, США, 23-27 февраля 2007 г. и Филадельфия, США, 14-18 марта 2008 г.); на ежегодном съезде Американского Колледжа Аллергологии, Астмы и Иммунологии (Даллас, США, 8-14 ноября 2007 г.).
Часть вошедших в диссертацию материалов представлена в работе, которой присуждена премия Правительства Российской Федерации за 2007 год в области науки и техники.
Основные результаты диссертационной работы отражены в 33 публикациях, в ведущих рецензируемых научных журналах, в том числе в 21 отечественном журнале и 12 зарубежных изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 220 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами, 39 рисунками, включая фотографии. Список использованной литературы включает 250 источников, из них 20 отечественных и 230 зарубежных.
