Содержание к диссертации
Введение
Глава І. БАВ природного происхождения (полисахариды и пептиды) корректоры нарушений иммунитета и гемостаза 18
1.1. Взаимосвязи системы иммунитета и гемостаза 18
1.2. Коррекция нарушений в системе иммунитета и гемостаза полисахаридами природного происхождения 28
1.3. Коррекции нарушений в системе иммунитета и гемостаза пептидами природного происхождения 32
1.4. Применение пептидов и полисахаридов при сепсисе и эндотоксиновом шоке 39
1.5. Применение пептидов и полисахаридов при ХОБЛ... 48
Глава II. Биологическая активность фукоиданов и перспективы их применения в клинике 56
Собственные исследования
Глава III. Материалы и методы 73
Глава IV. Иммуномодулирующая активность фукоиданов, выделенных из разных видов бурых водорослей 97
4.1 .Влияние фукоиданов из Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и Laminaria japonica на факторы врожденного и приобретенного иммунитета
4.1.1. Влияние фукоиданов на гуморальный иммунный ответ 98
4.1.2. Влияние фукоиданов на клеточный иммунный ответ 100
4.1.3. Влияние фукоиданов на функциональную активность нейтрофилов
4.2. Иммуномодулирующая активность фукоидана из F. evanescens и его модифицированных образцов 104
4.3. Иммуномодулирующая активность фукоидана из F. evanescens в сравнении с гепарином 107
з
4.4. Иммуномодулирующая и противовоспалительная активность фукоидана из F. evanescens при разных способах введения ПО
4.5. Влияние фукоидана из F. evanescens на продукцию цитокинов.Л 16
Глава V. Антикоагулянтная и фибринолитическая активность фукоиданов
5.1. Механизмы антикоагуляной активности фукоиданов из F. evanescens и L. cichorioid.es 120
5.1.1. Влияние фукоиданов на систему свертывания крови in vitro и in vivo в базовых коагуляционных тестах 120
5.1.2. Ингибиторная активность фукоиданов по отношению к тромбину (фактору Па) и к фактору Ха 129
5.1.3. Способность фукоиданов к комплексообразованию с протамина сульфатом 134
5.2. Влияние фукоидана из F. evanescens на систему фибринолиза in vitro и in vivo 137
Глава VI. Применение фукоидана из F. evanescens для коррекции нарушений иммунитета и гемостаза на модели эндотоксинемии 141
6.1. Влияние фукоидана на выживаемость животных 141
6.2. Влияние фукоидана на функциональную активность нейтрофилов 142
6.3. Влияние фукоидана на продукцию цитокинов 147
6.4. Влияние фукоидана на систему гемостаза 151
6.5. Влияние фукоидана на состояние внутренних органов и микроциркуляторного русла 155
Глава VII. Антикоагулянтная и фибринолитическая активность тинростима
7.1. Влияние тинростима на систему свертывания крови по внутреннему и внешнему пути in vitro и in vivo 176
7.2. Влияние тинростима на систему фибринолиза in vitro и in vivo...179
7.3. Влияние тинростима на активность протеолитических ферментов трипсина и химотрипсина 7.4. Применение тинростима для коррекции нарушений гемостаза на модели эндотоксинемии 183
Глава VIII. Применение тинростима в комплексном лечении больных ХОБЛ
8.1. Показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных ХОБЛ 189
8.2. Показатели плазменного звена гемостаза у больных ХОБЛ 203
8.3. Клиническая эффективность тинростима в комплексном лечении больных ХОБЛ 206
8.4. Взаимосвязь показателей иммунитета и гемостаза у больных ХОБЛ 208
Заключение 212
Выводы 252
Рекомендации для внедрения в практику и науку 255
Список литературы
- Коррекции нарушений в системе иммунитета и гемостаза пептидами природного происхождения
- Влияние фукоиданов на клеточный иммунный ответ
- Ингибиторная активность фукоиданов по отношению к тромбину (фактору Па) и к фактору Ха
- Влияние фукоидана на продукцию цитокинов
Коррекции нарушений в системе иммунитета и гемостаза пептидами природного происхождения
Система цитокинов осуществляет связь между всеми системами организма (иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной и др.) и служит для их вовлечения в регуляцию единой защитной реакции организма [255, 281]. В последние десятилетия доказана регуляторная роль цитокинов в отношении системы гемостаза. Так, установлено, что провоспалительные цитокины (TNFa, IL-1, IL-6, IL-8) опосредуют дефекты в процессах коагуляции и фибринолиза. Механизм их действия заключается в активации клеток эндотелия, Мн, Мф, Нф, что выражается в усилении экспрессии TF. Это, в свою очередь, приводит к усилению прокоагулянтной активности (или к активации системы гемостаза). Не менее важной является роль этих цитокинов в уменьшении продукции физиологических антикоагулянтов, а также в торможении фибринолиза за счет снижения секреции активатора плазминогена и увеличению концентрации его ингибитора [315, 353, 470, 527]. Этот механизм имеет место в развитии хронического ДВС-синдрома [57,60,316,456].
По данным других авторов, основным цитокином, активирующим процессы коагуляции, является IL-6, который усиливает выработку TF, но не оказывает влияния на процессы фибринолиза, а IL-1 и TNFa действуют опосредованно через IL-6 [431, 456]. В связи с этим Kerr R. et аі. [447] считают необходимым для профилактики тромботических осложнений ослабление синтеза IL-6 или блокирование его действия. Подтверждают это мнение данные о том, что введение животным антител к IL-6 при моделировании нарушений бронхо-альвеолярного гемостаза полностью отменяет гемостатические нарушения, тогда как антитела к TNFa только частично подавляют их. В то же время под действием антител к TNFa наблюдалось восстановление депрессии фибринолиза [375]. В последующих работах этих же авторов было показано, что ингибирование повышенного уровня TNFa также, как и IL-6, приводит к снижению процессов гиперкоагуляции [431].
Этого же мнения относительно IL-1, продуцируемого эндотелиальными клетками, Мн, Мф придерживаются Ю.А. Витковский и др. исследователи [57, 59, 60, 315]. Эти авторы показали также, что под влиянием IL-ip и IL-8 увеличивается продукция и секреция лимфоцитами прокоагулянтной активности, активности антикоагулянтов, активаторов и ингибиторов плазминогена, т.е. IL-1 участвует в регуляции процессов свертывания крови.
Таким образом, потенциальная роль провоспалительных цитокинов (TNFa, IL-1 а и IL-ip, IL-6, IL-8) в патогенезе нарушений иммунитета и гемостаза показана рядом авторов и сделано заключение, что повышенный уровень этих медиаторов увеличивает риск развития ДВС-синдрома и других нарушений в системе свертывания при ряде патологических состояний [25, -57,60,135,-143,431,456] Противовоспалительным цитокинам (IL-4 и IL-10) также, как и провоспалительным, принадлежит важная роль в регуляции системы гемостаза. В экспериментах in vitro показано, что IL-4 и IL-10 тормозят экспрессию TF и вызывают гипокоагуляцию [52, 58]. Эти данные подтверждены клиническими наблюдениями. Ликвидация ДВС-синдрома при ряде патологических процессов (обморожениях, ожогах и др.) во многом определяется увеличением концентрации IL-10, способного замедлять свертывание крови и активировать фибринолиз. Вспомогательную роль в этом процессе может играть IL-4, усиливающий фибринолиз и тем самым способствующий растворению образовавшихся в крови фибриновых сгустков [43, 57, 87].
Связующим звеном между иммуногенезом и гемостазом является система комплемента, которая активируется как при иммунных реакциях, так и при свертывании крови, а ряд компонентов системы гемостаза (фактор Хагемана, тромбин, плазмин и др. растворимые факторы) служат факторами активации классического или альтернативного пути. Компоненты системы комплемента оказывают влияние на процессы активации каскада свертывания крови и фибринолиза. Так, под влиянием СЗ-компонента усиливается производство тканевого тромбопластина и активатора плазминогена, а также простациклина сосудистой стенки. Активация комплемента предшествует тромбоцитарному ответу на фиксированные или циркулирующие иммунные комплексы. Шесть ранних компонентов комплемента (С1-С6) являются обязательными для последующих реакций агрегации тромбоцитов и высвобождения из них ряда факторов свертывания [144, 275, 281]. С участием системы комплемента связывают возникновение гиперкоагуляции при ряде воспалительных процессов (септическом и травматическом шоке, остром гломерулонефрите и других) [37, 144].
О существовании единой клеточно-гуморальной системы защиты организма свидетельствует общность антигенов HLA, кодирующих состояние иммунитета и гемостаза. Так, показаны тесные взаимосвязи между антигенами HLA и системой иммунитета и гемостаза, которые, как правило, имеют отношение к заболеваниям, сопровождающимся развитием иммунной недостаточности [7, 236, 269].
Подтверждением взаимосвязей служит тот факт, что как первичные, так и вторичные иммунодефицитные состояния проявляются клинически не только в виде инфекций, но и часто сочетаются с гемостатическими расстройствами (например, синдром Вискотта-Олдрича) [304].
В целом, приведенные нами данные свидетельствуют о том, что человеческий организм функционирует как единая клеточно-гуморальная система защиты, включающая факторы врожденного и приобретенного иммунитета и систему гемостаза.
Влияние фукоиданов на клеточный иммунный ответ
Разные виды бурых водорослей значительно различаются по содержанию и составу фукоиданов. Процентный выход фукоидана варьирует от 4 до 88%, что также зависит и от способа получения [195, 556]. Наиболее богатым источником фукоиданов являются представители порядка Fucales [308]. Представитель этого порядка Fucus vesiculosis является сырьем для получения коммерческого препарата фукоидана фирмы «Sigma». Доступными источниками фукоиданов также являются бурые водоросли рода Laminaria, относящиеся к объектам промышленного промысла [479].
Анализ многочисленных данных литературы свидетельствует, что структура фукоиданов характеризуется большим разнообразием. Основными параметрами, по которым различаются фукоиданы, можно считать молекулярную массу (м.м.) (от 10 до 1000 кДа, при этом м.м. наиболее активных фукоиданов находится в диапазоне 30 — 100 кДа), моносахаридный состав (помимо фукозы в их структуре могут присутствовать галактоза, ксилоза, манноза, арабиноза, рамноза, глюкуроновая кислота), степень сульфатирования (остатки фукозы могут иметь 1 или 2 остатка серной кислоты, либо вообще не иметь сульфатов), а также тип связи между остатками фукозы [а-(1—-в), (1— 2), (1— 4)], либо их сочетание и структуру боковых цепей [324, 489, 493].
Именно сложность и гетерогенность структуры фукоиданов служат объяснением противоречивых данных по их структурным особенностям. Т. Zvyagintseva et al. [556] установили, что структурные особенности фукоиданов, а также их содержание в бурых водорослях (F. evanescens, L. cichorioides, L. japonica ) варьируют в зависимости от места произрастания, от возраста водоросли и от времени ее добычи. Существует мнение, что структурные особенности фукоиданов зависят от вида и рода бурой водоросли [352]. Так, представители порядков Chordariales и Laminariales (Phaeosporophyceae) могут иметь ПС с линейной структурой, построенной из (1—»3) связанных а - L-фукопиранозных остатков с ответвлениями от основного скелета в виде остатков фукозы. И, наоборот, фукоиданы из порядка Fucales (Cyclosporophyceae) имеют скелет, построенный преимущественно из чередующихся (1— 3) и (1— 4) связанных a-L-фукопиранозных остатков. Эти данные позволяют считать, что различия в структуре являются отражением фундаментальных различий в биосинтезе фукоиданов у двух разных классов бурых водорослей Phaeosporophyceae и Cyclosporophyceae [352].
Таким образом, анализ структуры фукоиданов затруднен в связи с тем, что это высокомолекулярные соединения, содержащие различные составляющие сахара и множество боковых цепей, а также отличающиеся по расположению сульфатных групп. Четкое установление структуры в сочетании с заданной биологической активностью является необходимым условием для разработки на основе фукоиданов как лекарственных средств, так и стандартных препаратов для научно-исследовательских целей.
Взаимозависимость между структурой и биологическими свойствами фукоиданов до настоящего времени остается малоизученным и сложным аспектом проблемы. Изучение этого вопроса важно с точки зрения практического использования. Например, нативные фукоиданы имеют ограничение для применения в медицине вследствие высокой м.м. и плохой растворимости, а также в силу наличия остаточных протеинов, что чревато риском иммунных осложнений. При этом следует отметить, что большинство исследователей приводят данные о биологической активности нативного фукоидана, в связи с чем трудно судить о взаимосвязи структуры и функции. Фукоиданы обладают широким спектром биологической активности, основными проявлениями которой можно считать антикоагулянтную и антитромботическую. Немаловажное значение имеют также их иммуномодулирующая, про- и противовоспалительная, противоопухолевая, антибактериальная, антивирусная, антиоксидантная, гиполипидемическая, антигипертензивная и другие. Антикоагулянтная и антитромботическая активность фукоиданов Особый интерес вызывают антикоагулянтная и антитромботическая активность, которые были обнаружены одними из первых в спектре свойств фукоиданов. Впервые антикоагулянтная активность была выявлена G. Springer et al. [443] у фукоидана из бурой водоросли F. vesiculosus.
Описание антикоагулянтных свойств занимает преобладающее место в спектре биологической активности фукоиданов, их изучение проводилось, в основном, в связи со структурными особенностями фукоиданов. В ряде работ показана связь между молекулярной массой и антикоагулянтной активностью. Ряд исследователей считают, что антикоагулянтная активность фукоиданов связана с высокой м.м. [367, 548]. Другие нижним пределом этой активности считают 20 кДа [493]. Но в целом авторы заключают, что разные фракции фукоиданов имеют свой оптимум м.м. для проявления антикоагулянтной активности [489, 493].
Установлено также, что антикоагулянтная активность фукоиданов коррелирует с содержанием сульфатов. Так, V. Grauffel et al. [489] исследовали эту корреляцию в отношении фукоиданов из F. vesiculosus и Pelvetia canaliculata и установили, что, например, антитромбиновая активность фукоиданов возрастала с увеличением содержания сульфатов. Рядом авторов подтверждена эта связь на хорошо изученных фукоиданах с различным содержанием сульфатов и показано, что десульфатированные фракции фукоиданов были неактивны в коагулологических тестах [449, 490, 491, 539]. Результаты, полученные этими авторами, свидетельствуют также, что фракции, обогащенные сульфатами, но бедные по содержанию уроновых
Ингибиторная активность фукоиданов по отношению к тромбину (фактору Па) и к фактору Ха
Эффективность торможения активности сериновых протеиназ исследовали по изменению амидазной активности трипсина и эстеразной активности химотрипсина. Для определения активности трипсина и химотрипсина использовали метод [533] и модификацию этого метода, предложенную [421]. В качестве субстратов использовали ацетилтирозин этиловый эфир (АТЭЭ) и №а-бензоил-Ь-аргинин-р-нитроанилид (БАрНА) производства «Sigma».
Принцип метода состоит в том, что под действием испытуемого ферментного раствора происходит расщепление субстрата с образованием спирта (или нитроанилида) и производных аминокислот, которые имеют более высокое, чем исходный эфир значение оптической плотности при известных длинах волн (237 нм или 405 нм).
Кинетические константы ферментного гидролиза субстратов Км и Vmax и тип ингибирования определяли по методу Лайнуивера-Берка по графикам двойных обратных величин [85, 138].
В качестве положительного контроля ингибиторной активности использовался апротинин - коммерческий препарат («Sigma»), представляющий собой полипептид, выделенный из легких млекопитающих.
Для оценки токсичности использовали неинбредных мышей-самцов массой 14-16 г. Мышам (по 10 особей в группе) вводили раствор фукоидана однократно внутрибрюшинно (в/б) в дозах от 5 мг/кг до 100 мг/кг в 0,85% растворе NaCl в объеме 0,5 мл либо 10-кратно per os в дозах до 250 мг/кг в дистиллированной воде в объеме 0,025 мл. Контрольные животные получали соответствующую аликвоту растворителя (0,85% раствор NaCl либо вода). Срок наблюдения составил 21 день. Изучали следующие показатели: выживаемость, масса тела, общее состояние.
Эндотоксинемию воспроизводили путем внутрибрюшинного введения неинбредным мышам или мышам BALB/c LDioo (6,25±0,5 мг/кг) ЛПС (эндотоксина) Yersinia pseudotuberculosis штамм № 598 IB сероварианта. LDioo рассчитывали по формуле Кербера в модификации И.П. Ашмарина [15]. Наблюдение за животными и учет гибели проводили в течение 120 часов.
Защитный эффект фукоидана изучали по интегральным показателям, характеризующим состояние факторов врожденного иммунитета: выживаемости мышей, получивших ЛПС в дозе LDioo, и средней продолжительности жизни. Процент (%) выживаемости, вычисляли по формуле: (число выживших мышей / суммарное число выживших и погибших мышей) х100%; среднюю продолжительность жизни (СПЖ) по формуле: сумма продолжительности жизни всех мышей / число мышей в группе [15]. Группы животных для изучения выживаемости включали по 8-10 мышей. Эксперименты повторяли от 4 до 6 раз.
Уровень IL-la, IL-6, TNFa в сыворотке крови мышей BALB/c определяли ИФА с использованием наборов BD Biosciences (BD OptEIA Set Mouse; USA) в соответствии с прилагаемой к наборам инструкцией. Результаты регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 450 nm на Multiscan RC «Labsystems». Коагуляционное звено гемостаза мышей BALB/c исследовали в АПТВ-, ПВ-, ТВ-тестах, а также по уровню фибриногена (ФГ) в плазме крови с использованием реактивов фирмы «Технология-Стандарт» (г. Барнаул). Фибринолиз оценивали по спонтанному эуглобулиновому лизису сгустка (ФА). Образцы сыворотки и плазмы крови получали от группы из 10-15 животных, исследования повторяли 5-6-кратно.
Исследование патоморфологических изменений в органах мышей с экспериментальной эндотоксинемией под действием фукоидана (исследования выполнены совместно с лабораторией патоморфологии и электронной микроскопии ГУ НИИЭМ СО РАМН; руководитель - д.м.н. Сомова Л.М.) Мышей выводили из опыта с использованием эфирного наркоза в разные сроки (через 4, 7, 17, 24 часов) после введения ЛПС. Иссекали образцы миокарда, печени, почек, легких. Изучение экспериментального материала проводили с помощью гистологического и гистохимического методов. Образцы органов фиксировали в 10% нейтральном растворе забуференного параформальдегида (формалина). Проводку в гистологическом автомате и заливку в парафин осуществляли стандартным методом. Из каждого образца готовили 3-5 срезов, которые окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином [167]. Для выявления отложений фибрина производили окраску по Шуенинову [167]. Просмотр препаратов и микрофотосъемку проводили на микроскопе марки Amplime (Германия).
Влияние фукоидана на продукцию цитокинов
Для конструирования таблетированной лекарственной формы или БАД важным является оценка иммунного ответа при пероральном способе введения препарата в организм, который является самым простым, адекватным и психологически привлекательным [66]. Однако, при пероральном способе введения необходимо иметь в виду влияние многочисленных факторов и физиологических особенностей ЖКТ на вводимое вещество и процесс его поступления во внутреннюю среду организма, доставку к соответствующим органам и тканям.
В связи с этим перед нами стояла задача исследовать эффекты фукоидана на организм при парентеральном и пероральном способах введения.
Прежде всего, была проведена оценка острой токсичности фукоидана при парентеральном и пероральном способах его введения. В экспериментах по оценке токсичности все мыши, получившие фукоидан в диапазоне доз от 5 до 100 мг/кг однократно внутрибрюшинно, оставались живыми в течение срока наблюдения (3 недели). То же наблюдалось при однократном введении фукоидана per os в диапазоне доз от 5 до 250 мг/кг, Наблюдение в динамике за общим состоянием и массой тела мышей, получивших фукоидан, не выявило различий по сравнению с животными контрольной группы. Показатели массы тела в опытных группах (животные, получившие Ill фукоидан) не отличались статистически значимо от таковых в контрольной группе (табл. 6).
Примечание: показатели массы М±т; использован параметрический t-критерий Стьюдента для независимых выборок; все значения р 0,05 (различия не являются статистически значимыми по отношению к контролю); п=10.
Полученные результаты демонстрируют, что фукоидан не токсичен в исследуемом диапазоне доз от 5 до 250 мг/кг при парентеральном введении и при условии применения per OS.
В следующей серии экспериментов исследовали эффект продолжительного (в течение 4-х недель) введения фукоидана мышам в оптимальных дозах: 5 мг/кг внутрибрюшинно (в/б) или 50 мг/кг перорально (п/о). В течение наблюдаемого периода все мыши, получавшие фукоидан, оставались живыми, существенных изменений в поведении и двигательной активности не было отмечено. Продолжительное введение фукоидана per os способствовало улучшению состояния волосяного покрова (шерсть животных становилась более густой и приобретала блеск).
Далее мы оценивали влияние фукоидана при разных способах введения на гуморальное звено иммунного ответа. Парентеральное однократное введение фукоидана в оптимальной дозе 5 мг/кг как в индуктивную, так и продуктивную фазу антителогенеза, приводило к статистически значимому увеличению абсолютного количество АОК в селезенке (ИС составил 1,69, р=0,004 и 1,48, р=0,008 соответственно), а также титров ГА (ИС составил 1,20 при р=0,004) и ГЛ (ИС=1,32 при р=0,005) в сыворотке крови мышей линии (CBAxC57BL/6)Fj, иммунизированных ЭБ (табл. 7). Пероральное введение фукоидана в течение 2-х недель также значимо стимулировало формирование АОК в селезенке (ИС составил 1,8 при р=0,000) и приводило к возрастанию титров ГА (ИС=1,27, р=0,000) и ГЛ (ИС=1,3, р=0,000) в сыворотке крови (табл. 7 ).
При изучении влияния фукоидана на реакции, опосредованные Т-клетками на модели индукции ГЗТ к ЭБ мышам линии (CBAxC57BL/6)Fi препарат вводили в дозе 5 мг/кг до сенсибилизации и перед разрешающей инъекцией ЭБ. Было выявлено статистически значимое усиление интенсивности этой реакции, не зависящее от сроков введения препарата относительно сенсибилизирующей (ИС равен 1,57, р=0,001) и разрешающей (ИС равен 1,45, р=0,019) доз антигена (табл. 7). При пероральном введении фукоидана в дозе 50 мг/кг также отмечалось статистически значимое усиление интенсивности реакции (ИС составил 1,37, р=0,009) (табл. 7).
Таким образом, фукоидан усиливает гуморальный иммунный ответ и интенсивность реакции ГЗТ к ЭБ как при парентеральном, так и при пероральном введении.
В следующей серии экспериментов было проведено исследование функциональной активности Нф при разных способах введения фукоидана. При парентеральном (внутрибрюшинном) введении фукоидана мышам в дозе 5 мг/кг наблюдалось усиление функциональной активности Нф, что выражалось статистически значимым увеличением ФП и ФЧ в отношении культуры S. aureus (ИС составили 1,23 и 1,19, р=0,03 и р=0,015 соответственно), показателей микробицидной активности в спонтанном НСТ-тесте (ИС=1,37, р=0,000) и адгезивной активности (ИС=1,62, р=0,000).
