Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления о хроническом лимфолейкозе 10
1.2. Генетические маркеры хронического лимфолейкоза 28
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Клинико-гематологическая характеристика больных 36
2.2. Методы исследования
2.2.1. Лабораторные методы исследования 40
2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 42
2.3. Статистический анализ 46
Глава 3. Клинико-иммунологическая характерис тика больных хроническим лимфолейкозом 52
Глава 4. Генетические исследования у больных хроническим лимфолейкозом
4.1. Полиморфизм локуса -174G->C промоторной области гена интерл кина-6 59
4.2. Полиморфизм локуса -308G-»A гена фактора некроза опухоли-А 62
4.3. Полиморфизм локуса +252A->G гена фактора некроза опухоли-Р 65
4.4. Анализ комбинаций генотипов по локусам фактора некроза опухоли -а и ~Р у больных хроническим лимфолейкозом 67
4.5. Полиморфизм гена глутатион S-трансферазы Ml 73
Заключение 76
Выводы 84
Практические рекомендации 85
Список литературы 86
- Генетические маркеры хронического лимфолейкоза
- Молекулярно-генетические методы исследования
- Клинико-иммунологическая характерис тика больных хроническим лимфолейкозом
- Анализ комбинаций генотипов по локусам фактора некроза опухоли -а и ~Р у больных хроническим лимфолейкозом
Генетические маркеры хронического лимфолейкоза
Одна из причин недостаточного ответа В-клеток хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) ко многим химиотерапевтическим агентам может лежать в биологических особенностях: В-ХЛЛ - заболевание нарушенной клеточной смерти или апоптоза [46].
Известно, что клетки В-ХЛЛ аккумулируются не потому, что они делятся с ускоренной частотой, а потому что их выживаемость имеет ненормально длительное время. Тем не менее, генетические механизмы основного данного феномена остаются в значительной степени не известными.
Лучшее понимание генетической этиологии В-ХЛЛ, то есть идентификация и функциональная характеристика генов пораженных наиболее простыми хромосомными аномалиями при В-ХЛЛ, несомненно, обеспечат нас важными ключами к клиническому течению В-ХЛЛ и новыми мишенями для эффективной терапии.
Установлено, что неслучайные хромосомные аберрации обнаруживаются более чем у 60% больных ХЛЛ [201]. Гены, предохраняющие нормальные клетки от перехода в опухолевые, называются генами-супрессорами опухолевого роста. Считается, что хромосомные участки, утрачиваемые в опухолевых клетках, содержат гены-супрессоры опухолевого роста. В настоящее время известно, что ХЛЛ сопровождается целым спектром цитоге-нетических нарушений.
Чаще всего выявляются трисомия хромосомы 12, делеции длинного плеча хромосомы 6 и 13, различные перестройки длинного плеча хромосомы 11. Установлено, что распределение хромосомных аберраций зависит от стадии болезни. Трисомия хромосомы 12 проявляется более, чем в 20% случаев В-ХЛЛ, коррелирует с атипичными морфологическими вариантами ХЛЛ и ассоциирована с неблагоприятным прогнозом. [63, 158, 31, 189, 71, 186, 188, 131]. Средняя продолжительность жизни при ХЛЛ с трисомией составляет 5,4 года, а при нормальном кариотипе - 14 лет. Данные разных авторов [143, 189, 145] свидетельствуют о том, что трисомия 12 - не первичное событие при ХЛЛ, а возникает в ходе развития опухоли.
Примерно у 50% больных ХЛЛ обнаруживается делеция участка хромосомы 13, содержащего, по видимому, тумор-супрессорный ген, учавст-вующий в патогенезе ХЛЛ. Делеция 13q при ХЛЛ прогностически благоприятнее других хромосомных аберраций. Средняя продолжительность жизни больных только с делецией 13q сопоставима с выживаемостью больных с нормальным кариотипом [71].
Делеция llq. Немецкая группа Stilgenbauer и соавт. [141] картировала район Hq22.3-q23.1 и определили, что этот район содержит 6 генов и двое (ATM и RDX) из них могут претендовать на роль тумор-супрессорных генов. Делеция llq крайне неблагоприятна в прогностическом отношении [76]. Больные с этими нарушениями более молодые, и у них отмечается выраженный опухолевый рост в периферических, абдоминальных и медиастинальных лимфоузлах [202]. Делеция llq22-23, которая проявляется от 13 до 19 % случаев В-ХЛЛ ассоциирована с прогрессией заболевания и снижает выживаемость пациентов. Медиана выживаемости 64 месяца [63, 132, 202, 76].
Делеция 6q. Структурные нарушения хромосомы 6 могут распологать-ся в различных областях. Offit и соавт. идентифицировали 3 основных района утраты материала на хромосоме 6: 6q25 - 27, 6q21, 6q23 [65]. Finn и соавт. сделали вывод, что делеция 6q при ХЛЛ ассоциирована с плохим прогнозом, когда она вторична и сочетается с другими хромосомными аберрациями.
Делеция 17р. Из структурных нарушений хромосомы 17 при ХЛЛ чаще всего наблюдается делеция 17р13. В этом районе располагается туморсупрессорный ген р54, принимающий участие в индукции апоптоза при повреждении генома клетки.
Структурные нарушения хромосомы 14. Наличие дополнительного хромосомного материала, прикрепленного к дистальной части длинного плеча хромосомы 14-постоянная находка при многих лимфопролифератив-ных заболеваниях. Другое частое нарушение хромосомы 14 при ХЛЛ - деления длинного плеча.
Наследственный ХЛЛ. Из эпидемиологических исследований известно, что риск развития ХЛЛ у родственников больных выше, чем в общей популяции [177, 87]. Исследования Catovsky D. (1997г.) из Великобритании выявили, что для ХЛЛ характерен феномен ожидания, который состоит в том, что в следующем поколении болезнь начинается раньше и протекает более тяжелое.
ФНО — аутокринный ростовой фактор для клеток хронического В-лейкоза. Имеются данные, указывающие на то, что интенсивность синтеза ФНО может быть запрограммирована на генетическом уровне [76, 74, 111, 113, 194]. Гены ФНО-а и ФНО-Р расположены в пределах главного комплекса гистосовместимости III класса на хромосоме 6 в области 6р21.3. Это высокополиморфный участок генома. В гене ФНО-а описано, по меньшей мере, 8 полиморфных сайтов [47, 81, 140]. На линиях В-клеток человека было показано, что генетический полиморфизм, локализованный в положении -308 промоторного участка гена ФНО-а, характеризующийся заменой гуанина на аденин (-308G— А), ассоциирован с повышенной экспрессией гена in vitro: присутствие аллеля G определяет часто встречающийся вариант ФНО-а 1, a присутствие аллеля А - более редкий вариант ФНО-а 2 [50, 81, 82, 190, 194]. Показано, что редкий аллель ФНО-а 2 ассоциирован с повышенной продукцией ФНО-а [48, 100].
Молекулярно-генетические методы исследования
Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови. Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК из лимфоцитов, выделяемых из крови. Кровь набирали в пробирки со стандартным консервантом (1 мл глюгицира) в соотношении 4:1. До выделения ДНК кровь хранили при температуре +4С. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [139]. Для этого к 4 мл крови добавляли 50 мл ли-зирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона X 100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl рН 7,6. Ядра лимфоцитов осаждали центрифугированием при 4С и 4000 об/мин в течение 20 минут; к осадку добавляли 8 мл раствора, содержащего 25 мМ EDTA (рН=8,0), суспендировали, добавляли 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл, затем инкубировали при 42С в течении 16 часов. Очистка ДНК от белков производилась с помощью последовательной эктракции раствора ДНК забуференным фенолом (рН=7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. При этом фенол активно денатурирует белки, смесь фенол-хлороформа полностью ингибирует РНК-азную активность, в результате последней экстракции хлороформом из препарата ДНК удаляют остатки фенола. Экстракцию производили, смешивая раствор ДНК и растворитель до образования эмульсии. Разделение фаз проводили ценрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. Осаждение ДНК производилось добавлением двух объемов охлажденного 96% этанола. Осажденную ДНК дважды промывали 70% этанолом, удаляли этанол из пробирки и подсушенный осадок ДНК растворяли в деионизированной Н20. Раствор ДНК хранили при -20С. Проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфных локусов -174G—»С промоторного участка гена ин-терлейкина 6 (-174IL-6), -308G— А промоторного участка гена фактора некроза опухоли а (-308ФНО-а) и +252А— G интрона 1 гена фактора некроза опухоли Р (+252ФНО-Р), генов глутатион S-трансферазы Ml (GSTM1) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на тер-моциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклеотидных праймеров (табл. 2.2.2.1).
Молекулярно-генетический анализ полиморфизма локуса —174G— С про-моторной области гена IL-6 проводили с помощью метода определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Первоначально осуществляли ПЦР-амплификацию нужного фрагмента в промоторной области гена IL-6. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров были взяты из работы J.M. Fernadez-Real и соавт. (2000) [122]. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0,1-1 мкг геномной ДНК, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтри-фосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 6,7 мМ MgCl2, 16,6мМ (N[4)2804, 0,01 % Tween-20. В каждую пробирку добавляли 1 единицу Tag-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Проводили 32 цикла со следующими параметрами: денатурация 94С — 45 секунд, реассоциация 55С -45 - секунд, полимеризация 72С — 45 секунд.
После 32-го- цикла проводили инкубацию при 72 С в течение 7 минут. Нуклеотидную замену G- C в положении -174 гена IL-6 выявляли рестрикцией полученного ПЦР-продукта размером 198 пн ферментом Hsp92II при 37С (рис. 2.2.2.1).
Полиморфизм —308G- A промоторной области гена ФНО-а выявляли с использованием праймеров, один из которых содержит искусственную одно-нуклеотидную замену для создания сайта рестрикции в нативной последовательности ДЕЖ для рестриктазы Ncol [47]. Условия ПЦР и состав ПЦР-смеси идентичны вышеизложенным. Продукт ПЦР длиной 108 пн подвергали ферментному гидролизу рестриктазой Ncol при температуре 37С. Аллель ФНО-а 22 размером 108 пн (генотип АА) типировался на электрофорезе в 7% ПААГ по отсутствию сайта рестрикции, аллель ФНО-а 11 (генотип GG), содержал сайт рестрикции и идентифицировался по наличию двух фрагментов длиной 88 и 20 пн [47] (рис. 2.2.2.2).
Полиморфизм +252A- G первого интрона гена ФНО-Р выявляли методом ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Условия ПЦР и состав ПЦР-смеси идентичны вышеизложенным. Продукт ПЦР длиной 300 пн подвергали ферментному гидролизу рестриктазой Ncol при температуре 37С. Аллель ФНО 11 размером 300 пн (генотип АА) типировался на электрофорезе в 7% ПААГ по отсутствию сайта рестрикции, тогда как при наличии сайта рестрикции идентифицировался мутантный аллель ФНО-3 22 (генотип GG) (рис. 2.2.2.3).
Амплификация фрагмента гена GSTM1 была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 15 пМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgC12, 6,7 мкМ ЭДТА, ЮмМ мер-каптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1 ед Taq-полимеразы. Режим амплификации был следующим: начальная денатурация (94С, 7 мин), 30 циклов амплификации: денатурация - 94С, 40 сек; отжиг - 55С, 40 сек ; синтез — 72С, 1 мин. При отсутствии делеции формировался фрагмент раз- мером 271 пн, при наличии делеции данный фрагмент отсутствовал. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена CYP1A1 (рис. 2.2.2.4). Проведение электрофореза и визуализация результатов.
Клинико-иммунологическая характерис тика больных хроническим лимфолейкозом
Проведено изучение иммунного статуса у 104 больных хроническим лимфолейкозом. Как видно из данных таблицы 3.1, у всех больных независимо от формы заболевания отмечен абсолютный и относительный лимфо-цитоз по сравнению со здоровыми, заметно снижено относительное содержание Т-лимфоцитов (Е-РОК) в крови (20,3±2,27%, и 64,0±1,7%; рО.001).
Абсолютные значения лимфоцитов с Т-клеточными маркерами, значительно превышающие норму, объяснялись высоким лейкоцитозом у больных хроническим лимфолейкозом.
Иммунофенотипический анализ показал, что содержание CD3+, (зрелые Т-лимфоциты), CD4+, СБ16+-клеток статистически значимо меньше у больных ХЛЛ по сравнению с контрольной группой. Однако при сравнении данных показателей в зависимости от клинических форм, значимых отличий выявлено не было.
У всех больных ХЛЛ во всех стадиях заболевания отмечается резкое повышение содержания В-клеток с рецептором к эритроцитам мыши М-РОК, а так же CD22+ и HLA-DR+.
Определение абсолютного количества СБ20+-клеток у больных с прогрессирующей формой ХЛЛ (табл. 3.2) выявило достоверное увеличение количества СВ20+-клеток по сравнению с контрольной группой (4,92±2,1 и 0,4±0,02, р 0,001). В группе больных с опухолевой формой ХЛЛ отмечается значительное повышение содержания СО20+-клеток по сравнению с прогрессирующей формой ХЛЛ (25,5±2,07 и 4,92±2,1, р 0,001).
Наблюдается значительный рост числа CD22+- клеток, который по сравнению с контролем выше в 4,6 раз (14,0±0,83% и 65,27±2,11%, р 0,001). Высокое относительное и абсолютное содержание HLA-DR+-ioieTOK у больных ХЛЛ является также подтверждением В-клеточного фенотипа лей-козных клеток. Результаты исследования фагоцитарной активности нейтро-филов (табл. 3.3) показали, что у больных ХЛЛ процент активных фагоцитов был статистически значимо ниже (р 0,001), чем у лиц контрольной группы. Индекс фагоцитоза был значимо ниже у больных с опухолевой формой (р 0,05). НСТ-тест, характеризующий метаболическую активность нейтрофилов, также оказался в 2 раза ниже по сравнению с контролем (4,8±0,9% и 11,2±0,05% соответственно, р 0,001). Комплементарная активность у больных ХЛЛ, также как и другие показатели, была меньше по сравнению с контролем, однако значимых отличий не выявлено (62,8±2,9% и 72,0±1,8 р 0,05). Как видно из таблицы 3.4, у больных ХЛЛ выявлено значимое снижение содержания основных классов иммуноглобулинов по сравнению с контролем: у больных с прогрессирующей формой заболевания уровень IgA составил 1,45±0,26 против 3,0±0,2 в контроле, р 0,001, IgG (10,09±1,1 и 14,5±0,7, р 0,001), IgM (1,06±0,1 и 2,0±0,2, р 0,001). У больных с опухолевой формой ХЛЛ иммуноглобулины всех трех классов так же были статистически значимо ниже по сравнению с контролем. Значимое снижение содержания IgG выявлено у больных с опухолевой формой по сравнению с прогрессирующей формой ХЛЛ: (7,92±0,86 и 10,09±1,1, р 0,01). Изменений числа циркулирующих иммунных комплексов при ХЛЛ выявлено не было (47,54±6,19- опухолевая форма заболевания; 46,6±3,5-контрольная группа-). Таким образом, хронический лимфолейкоз сопровождается: - Снижением относительного содержания Т-лимфоцитов (Е-РОК, CD3+-, CD4+- клеток); -увеличением абсолютного числа CD8+- клеток, приводящее к усилению Т супрессорного влияния и, как следствие, дисбалансу субпопуляций Т лифоцитов (CD4+ и С08+-клеток); -увеличением относительного и абсолютного содержания незрелых В лимфоцитов, находящихся на поздней антиген-зависимой стадии дифферен цировки (Ем-РОК, CD22+-, HLA-DR-клетки); - нарушением соотношения Т и В-лимфоцитов; - снижением содержания естественных киллеров (С016+-клеток); - увеличением уровня CD20+-KJieTOK в группе больных с опухолевой формой по сравнению с прогрессирующей формой; -снижением фагоцитарной активности нейтрофилов и угнетением окислительно-восстановительных процессов в них; -снижением концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов G,A,M.
Анализ комбинаций генотипов по локусам фактора некроза опухоли -а и ~Р у больных хроническим лимфолейкозом
Принимая во внимание, что гены ФНО-а и ФНО-р расположены на одной хромосоме в непосредственной близости (6р21.3), целесообразным представлялось изучить особенности комбинаций генотипов по изученным локусам и характер сцепления между ними. Данные по распределению комбинаций генотипов приведены в табл. 4.4.1.
Из представленных в таблице данных видно, что из 9 возможных комбинаций генотипов в контроле встречались все 9 вариантов, у больных хроническим лимфолейкозом - 7 вариантов, (комбинации генотипов TNF 22/LT 11 и TNF 22/LT 12 у больных не встречались). Вариант TNF 11/LT 22, для которого характерно наличие мутации по гену ФНО-р в гомозиготном состоянии и нормальных аллелей по гену ФНО-а, чаще встречается у больных (3,85%), чем у здоровых (1,89%). Существенные различия между больными и контролем установлены по комбинации TNF 22/LT 22, характеризующейся наличием мутаций в генах ФНО-а и ФНО-Р в гомозиготном состоянии. Данный вариант выявлен у 2,88% больных ХЛЛ и только у 0,63% индивидов контрольной группы. Данная комбинация у больных ХЛЛ встречалась в 4,8 раз чаще по сравнению со здоровыми индивидами (OR=4,66).
Исходя из полученных данных, можно сделать заключение о возможности использования в качестве маркеров повышенного риска развития ХЛЛ двух комбинаций генотипов: с нормальным аллельным вариантом по локусу -308ФНО-а в сочетании с мутацией по локусу +252 ФНО-Р в гомозиготном состоянии (вариант TNF 11/LT 22) и комбинацией мутантных генотипов в гомозиготном состоянии по локусам —308ФНО-а и +252 ФНО-Р (вариант TNF 22/LT 22).
Необходимо отметить, что сочетания генотипов TNF 22/LT 11 и TNF 22/LT 12 встречались только в контроле с частотой 1,27 и 0,63%о, соответственно. Между тем, у больных хроническим лимфолейкозом указанные варианты выявлены не были. Показатель OR для комбинации генотипов TNF 22/LT 11 и TNF 22/LT 12 составил 0,30 и 0,50, соответственно, что свидетельствует о протективном значении этих вариантов.
На следующем этапе нами был проведен анализ комбинаций генотипов по локусам -308ФНО-а и +252 ФНО-Р у больных хроническим лимфолейкозом в зависимости от клинической формы заболевания. Результаты анализа представлены в табл. 4.4.2. У больных с прогрессирующей формой заболевания и у больных с опухолевой формой выявлено по 7 комбинаций генотипов. Заслуживает внимания наблюдаемое повышение у больных с прогрессирующей формой комбинации генотипов TNF 11/LT 22 до 5,8% против 2,1% при опухолевой форме ХЛЛ. Показатель OR для этого варианта составил 2,88, указывая на повышенную предрасположенность к прогрессирующему течению заболевания при наличии данной комбинации. Аналогичное заключение можно сделать и для комбинации генотипов TNF 12/LT 12, на долю которого приходится 21,2% при прогрессирующей форме и только 12,5% - при опухолевой форме ХЛЛ. Для данного варианта показатель OR составил 1,88, свидетельствуя о повышенной вероятности развития прогрессирующей формы ХЛЛ у лиц с данным генотипом.
В качестве прогностически неблагоприятных комбинаций генотипов по локусам ФНО-а и ФНО-р следует отметить варианты TNF 22/LT 22 и TNF 12/LT 11, частота которых при опухолевой форме хронического лим-фолейкоза оказалась почти в 2 раза выше, чем при прогрессирующей форме заболевания. Показатели OR в отношении опухолевой формы ХЛЛ составили 2,22 для сочетания TNF 22/LT 22 и 2,27 для комбинации генотипов TNF 12/LT 11. Полученные результаты позволяют использовать данные комбинации генотипов по локусам ФНО-а и Р в качестве возможных генетических маркеров предрасположенности к опухолевой форме ХЛЛ.
