Введение к работе
А к туальность проблемы. Бруцеллёз от-йя к антролозоонозшм инфекциям, поражающим как людей, так ьскохозяйственных животных, что обусловливает огромный
причиняемый им здоровью населения и народному хозяйству, тоншеє время во многих регионах страйк, в тем числе в Ста-льском крае, сохраняются активные очаги бруцеллёза. Работа
оздоровлению включает иммунологический мониторинг с при-ием различных серологических методов лабораторной диагнос-
из которых наиболее перспективным является иммунофермент-нализ (ИФА), обладающий общепризнанными высокой специфич-и и чувствительностью. Однако, наряду с достоинствами, ИФА
применяемых вариантах не лишен и ряда недостатков, зачас-.репятствующих широкому применению метода на практике. К южно отнести необходимость в специальной фотометрической іатуре для учета результатов, относительную трудоемкость лки при отсутствии средств автоматизации, потенциальную ірогенность и мутагенность некоторых субстратов, вероятность шоложительных результатов, обусловленных присутствием фер->в-маркеров в исследуемом биологическом материале, отсутст-ши труднодоступность стандартных диагностических препара-і др. Одним из возможных направлений усовершенствования ИФА )тся поиск новых, более совершенных ферментных маркеров и ?рат-индикаторных систем. Большой интерес в этом плане пред-іяет уже нашедший применение в ИФА высокоактивный фермент гриального происхождения пекициллиназа, полностью отсутст-та в тканях и биологических жидкостях человека и теплокров-швотных. К достоинствам пенициллиназы относительно распро-іенних ферментных маркеров (в т.ч. пероксидазы хрена) сле-отнести ее доступность и дешевизну, высокую (в 30 раз вы-їєм пероксидазы) ферментативную активность. Кроме того, ком-яты субстрат-индикаторной системы для аенициллиназы доступ-удобны в обращении и безвредны для здоровья экспериментато-субстратом является пенициллин, а хромогеном - готовый ап-ай препарат йодинол темно-синего цвета, по обесцвечиванию рого под действием продуктов гидролиза субстрата судят о
2. результатах анализа.
Цель работы заключается в разработке и усове шенствовании высокочувствительных и специфичных иымунофермент ных тест-систем с применением пенициллиназы в качестве фермен та-маркера для определения антител к возбудителю бруцеллёза.
Задачи исследования:
-
Разработать методику приготовления антивидошх кммуно пенициллиназных конъюгатов и их применения в ИФА.
-
Разработать тест-систему ИФА диагностическую антивидо вую пеницкллиназную для определения антител при бруцеллёзе у людей.
-
Изучить диагностическую ценность и сопоставить основи характеристики иммунопенициллиназной тест-системы ИФА для одр деления антител при бруцеллёзе у людей с аналогичной кошерчєі кой пероксидазной тест-системой, а также с традиционными серологическими методами.
-
Разработать тест-систему ИФА диагностическую антивидовую пенициллиназну;; для определения антител при бруцеллёзе у мелкого рогатого скота (МРС).
-
Изучить диагностическую ценность и сопоставить основні характеристики иммунопенициллиназной тест-системы ИФА для onpt деления антител при бруцеллёзе у МРС с традициошшми серологическими методами.
G. Разработать тест-систему ИФА диагностическую антивидо-вую пенициллиназную для определения антител ігри бруцеллёзе у крупного рогатого скота (КРС).
-
Изучить диагностическую ценность и сопоставить основнь характеристики иммунопенициллиназной тест-системы ИФА для опре деления антител при бруцеллёзе у КРС с традиционными серологическими методами.
-
Разработать тест-систему ИФА диагностическую пенициллг. назную на основе стафилококкового белка А (СБА), сопоставить е основные характеристики при определении ггротивобруцеллёзных ал тител с анткьидовими пенициллиназными тест-сист.--..ами ИФА, а
3.
кже с традиционными серологическими методами.
9. Изучить возможность и разработать методику применения пенициллиназной ИФА для определения антител при бруцеллёзе лиакрилонитрильного волокна в качестве твердофазного носи-ж.
Научная новизна. В результате проведенных следований впервые определены оптимальные параметры приготоЕ-яия и применения иммуноферментных диагностических препаратов, эщих в основе антивидовые иммуноглобулины, меченные ферменті пенициллиназой. Отработаны оптимальные условия проведения яициллиназного ИФА при определении антител к возбудителю щеллёза. Впервые разработаны тест-системы ИФА диагностичес-з антивидовые пенициллиназные для определения антител при щеллёзе у людей, МРС и КРС. Впервые сопоставлены основные рактеристики ИФА при использовании антивидовых пенициллиназ-х; и аналогичных коммерческих пероксидазных конъюгатов, а так-пенициллиназного ИФА с традиционными серологическими метода-определения антител при бруцеллёзе. Впервые проведена апро-л,ия тест-систем ИФА диагностических иммунопенициллиназных fi определения антител при бруцеллёзе в полевых условиях при оведении эпидемиологического и эпизоотологического обследо-яия активных очагов бруцеллёза. Впервые разработана методика нготовления и применения в ИФА денищшшназшх конъюгатов на нове СБА, определены основные характеристики пенициллиназной ст-системы ИФА на основе СБА. Впервые разработана методика сведения пенициллиназного ИФА с использованием полиакрилсни-ильного волокна в качестве твердофазного носителя.
Практическая значимость. Иммунофер-нтный метод определения антител к.возбудителю бруцеллёзной Секции с использованием фермента пешщиллиназы обладает викой чувствительностью, специфичностью, экономичностью, про-зодительностью и воспроизводимостью результатов. Метод поз-ляет определять антитола к возбудителю бруцеллёза как на ргн-х стадиях заболевания, тате и при хроническом течении инфек-к. Ввиду отсутствия фермента-маркера в исследуемом материале ккоположитольнне результаты анализа исключаются. Пеницилли-
4.
назные диагностические препараты стабильны и стандартизованы, методика постановки пенициллиназного ИФА проста, не требует специальной регистрирующей аппаратуры для учета результатов и может быть освоена практическими работниками медицинских и ветеринарных лабораторий. В полевых условиях показана возможное?] и целесообразность использования пенициллиназного ИФА в практике эпидобследования населения неблагополучных по бруцеллёзу хозяйств, что значительно повысит качество эпидемиологического мониторинга. Результаты наших разработок могут быть использованы в качестве технологической схемы производства различных вариантов диагностических наборов пенициллиназного ИФА для диагностики бруцеллёзной инфекции.
Апробация работы и внедрение в практику. Разработанные диагностические пеницилли-назные гест-системы ИФА апробированы при проведении эпидобследования активных очагов бруцеллёза Ставропольского края и КЇА0 в 1987-1989 гг., а также при проведении испытаний в НПО "Аллерген".
Материалы диссертационной работы представлены на:
институтских и межлабораторных конференциях Научно-исследовательского противочумного института Кавказа и Закавказья в 1987-1990 гг.;
6-й краевой научной конференции "Особо опасные инфекции на Кавказе", Ставрополь, 1987 г.;
ХУШ съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова, Алма-Ата, сентябрь 1989 г.;
областной научной конференции молодых ученых "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций", Ростов-на-Дону, 17-20 октября 1989 г.;
отраслевом совещании "Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенск, 1-2 ноября 1989 г.;
всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллёза и организации медицинской помощи больным", Новосибирск, 24-25 ноября 1989 г.
5.
С учетом результатов исследования материалы представлены:
-
"Методическими рекомендациями по приготовлению антиви-jx шлмунбпенициллиназныхконъюгатов и их. применению для ко-гственного определения антител к возбудителю бруцеллёза и і",
-
"Инструкцией по изготовлению и контролю тест-системы гнопенициллиназной моноклональнои для идентификации капсуль-) антигена Ф-І возбудителя чумы",
-
положительным решением от 22.06.1990 г. на изобретение луносорбент для твердофазного иммуноферментного анализа" пзка 4474530/ІЗ-І26І53-І988 г.),
-
"Экспериментально-производственным регламентом на тост-гему иммуноферментную пешщиллиназнун для выявления антител
бруцеллёзе у людей",
5) "Временной фармакопейной статьей на тест-систему имму-
эрментную пенициллиназную для выявления антител при бруцел-
з у людей",
6) "Инструкцией по применению тест-системы иммунофермент-пенициллиназной для выявления антител при бруцеллёзе у лю-
-
"Временной Фармакопейной статьей на конъюгат для имму-ерментного анализа пенициллиназный антивидовой (антитела гностические против иммуноглобулинов человека, меченные ициллиназой)",
-
"Инструкцией по применению ко'ныогата для иммунофермент-о анализа пенициллиназного антивидового (антитела диагности-кие против иммуноглобулинов человека, меченные пенициллина-)",
-
"Экспериментально-производственным регламентом на тест-тему иммуноферментную для выявления противолептоспироздах ител",
-
"Временной фармакопейной статьей на тест-систему имму-ерментную для выявления противолептоспирозных антител",
-
"Инструкцией по применению тест-системы иммуноферчент-
6.
ной для выявления противолептосшрозшх антител",
-
рационализаторским предложением И 36/225 "Применение йодинола в качестве хромогенного индикатора в иммуноферментноь анализе",
-
рационализаторским предложением И 14/88 "Приспособление для промывки ниток в процессе ИФА",
-
рационализаторским предложением Я 15/88 "Усовершенствование методики постановки твердофазного ИФА",
-
рационализаторским предложением іі 12/42 "Приспособление для мерного концентрирования жидкости".
Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 опубликованных статьях.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), собственных исследований (6 глав), заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объем диссертации 201 страни ца машинописи, включая 17 таблиц и 20 рисунков. Список литературы содержит 361 источник, из них на иностранных языках 236.
Положен и-я диссертации, выносимые на защиту.
-
Разработанные и оптимизированные методики приготовлени и применения в тест-системах ИФА для определения антител при бруцеллёзе различных иммуноферментвых конъюгатов с пенициллина зой в качестве фермента-маркера.
-
Преимущества диагностических пенициллиназных тест-систем ИФА перед другими серологическими методами.
-
Возможность и целесообразность применения разработанных диагностических пенициллиназных тест-систем ИФА в практике эпидемиологического и эпизоотологического обследования активных очагов бруцеллёза.
-
Возможность, методические приемы и преимущества исполь зования в пеницшшшазном ИФА полиакрилонитрильного волокна в качестве твердой фазы.
7.
