Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эпидемиологические особенности бруцеллеза в период социально-экономических преобразований на территории Российской Федерации в 1997-2006 гг. ...15
1.1. Экология и биологические свойства возбудителя бруцеллеза и их влияние на эпидемические проявления 15
1.2. Распространение бруцеллеза за рубежом и на территории бывшего СССР 25
1.3.Эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация по бруцеллезу в Российской Федерации в период социально-экономических преобразований (1997-2006 гг.). 30
1.4.Состояние диспансеризации больных бруцеллезом и трудовой прогноз 76
1.5.Состояние специфической вакцино профилактики бруцеллеза у профессиональных контингентов населения 79
1.6.B.canis — новый возбудитель бруцеллеза на территории России и его эпидемиологическая значимость 85
Глава 2. Иммунологические методы детекции бруцелл и их растворимых антигенов 105
2.1. Прямой вариант реакции иммунофлуоресценции для индикации бруцелл 106
2.2. Определение бруцеллезных антигенов с помощью ФИАВР . 108
2.3. Реакции, основанные на феномене пассивной гемагглютинации (РПГА, РНАт и РАГА), для индикации бруцелл 112
2.4. Использование реакции Ко-агглютинации для индикации бруцелл и их растворимых антигенов 115
2.5. Иммунорадиометрический анализ (ИРМА) для индикации возбудителя бруцеллеза 119
2.6. Выявление антигенов возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом (ИФА) 126
2.7. Использование иммунологических методов (РИФ и ИФА) для оценки антибиотикочувствительности бруцелл 134
2.7.1. Определение антибиотикочувствительности бруцелл с использованием РИФ. 135
2.7.2. Разработка экспресс-метода определения антибиотикочувствительности бруцелл с помощью ИФА 142
Глава 3. Значение ПЦР в системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией .. 152
3.1. Чувствительность и специфичность тест-системы ПЦР при идентификации и индикации бруцелл 156
3.2. Диагностическая ценность ПЦР в клинической практике ...158
3.3. Значение ПЦР в эпидемиологической практике 161
Глава 4. Лабораторные методы для оценки иммунного ответа при бруцеллезной инфекции 167
4.1. Динамика синтеза специфических иммуноглобулинов при экспериментальном бруцеллезе 167
4.2. Специфические иммуноглобулины разных классов (G, А, М) при бруцеллезе у людей 172
4.2.1. Отработка оптимальных условий проведения ИФА для выявления специфических антител 174
4.2.2. Оценка уровня специфических IgG, А, М-антител при различных формах бруцеллеза у людей с помощью ИФА 182
4.3. Оценка уровня общих и специфических циркулирующих иммуноглобулинов IgE при бруцеллезной инфекции 194
4.4. Влияние различных методов иммунотерапии больных бруцеллезом на синтез специфических антител разных классов 201
4.4.1. Динамика уровня специфических IgG, А, М, Е в процессе лечения больных острой и подострой форм бруцеллеза 202
4.4.2. Динамика уровня специфических JgG, А, М, Е при лечении больных хроническим бруцеллезом 205
Глава 5. Особенности персистенции бруцелл при инфекционном и вакцинальном процессах 212
5.1.Изучение антигенемии в динамике инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе 213
5.2.Использование ПЦР для оценки персистенции возбудителя бруцеллеза у людей 218
Заключение 222
Выводы 232
Список литературы 236
- Распространение бруцеллеза за рубежом и на территории бывшего СССР
- Определение бруцеллезных антигенов с помощью ФИАВР
- Диагностическая ценность ПЦР в клинической практике
- Специфические иммуноглобулины разных классов (G, А, М) при бруцеллезе у людей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бруцеллез — особо опасная и социально значимая инфекция, приносящая значительный экономический ущерб и обусловливающая высокий уровень инвалидизации больных (18,29).
Естественным резервуаром бруцелл в природе являются животные. Соответственно, эпидемиология бруцеллеза целиком определяется его эпизоотологией, а инфекция является типичным зоонозом.
Бруцеллез представляет собой мировую проблему для медицинского и ветеринарного здравоохранения (196, 215).
По данным Объединенного комитета экспертов ВОЗ по бруцеллезу (1986), эта болезнь среди животных регистрируется в 155 странах мира. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Юга и Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки (112,183,224,235,254,302).
Вместе с тем ряд стран, особенно в Европе (Англия, Дания, Германия, Финляндия, Швеция, Норвегия, Швейцария, Чехия, Словакия, Румыния), а также Япония добились практически полной ликвидации этой болезни среди животных и людей (182,192,223,259,301,315,333). Успешно проводится борьба с бруцеллезом в Болгарии, государствах бывшей Югославии, где регистрируются единичные случаи болезни в отдельных регионах (249,290).
В 90-е годы истекшего столетия резко обострилась эпизоотическая и эпидемическая ситуация по бруцеллезу в странах СНГ и России в результате социально-экономических преобразований, в частности, интенсивного процесса приватизации в сельском хозяйстве. В немалой степени этому способствовали и экономические трудности, равно как и ослабление санитарно-ветеринарного надзора за животными индивидуальных хозяйств (69,109,137,156,334)
Возросшая в последние два десятилетия миграция населения,
недостаточный ветеринарно-санитарный контроль за ввозом животных из стран неблагополучных по бруцеллезу, включая сопредельные государства СНГ,
способны в настоящее время осложнить и без того напряженную эпизоотическую и эпидемическую ситуацию по этой инфекции.
Последнее диктует необходимость совершенствования эпиднадзора, долгосрочного прогнозирования динамики и интенсивности эпизоотического процесса и его эпидемических проявлений с целью своевременного осуществления адекватных профилактических мероприятий (111,120).
Несмотря на невысокий уровень официально регистрируемой
заболеваемости людей бруцеллезом на протяжении последних 10-15 лет в Российской Федерации (0,3 - 0,4, не выше 0,5 на 100 тыс. населения), истинные показатели гораздо выше. При этом, регистрируют только впервые диагностированные (свежие) случаи, в то время как учет хронических форм не ведется. Соответственно, отсутствуют данные об истинной распространенности бруцеллеза среди населения России. Неполная информация о заболеваемости связана не только со снижением обращаемости сельских жителей за медицинской помощью, уменьшением объемов плановых диспансерных обследований людей, работающих в животноводстве, в том числе владельцев скота, но и с несовершенством лабораторной диагностики бруцеллеза, особенно его хронических форм (17,52,61,155). Вместе с тем, быстро и правильно поставленный диагноз, а также своевременно начатое лечение, значительно сокращают частоту хронизации инфекционного процесса и инвалидизации больных.
До начала наших исследований лабораторная диагностика бруцеллеза осуществлялась с помощью трудоемкого бактериологического и недостаточно чувствительных и специфичных серологических тестов, рекомендованных инструктивно-методическими материалами (МУ №28-1/6,1980). Это ставило важную научно-практическую задачу - разработать и внедрить в практическое здравоохранение комплекс современных методов и препаратов, направленных на эффективное выявление бруцеллезных антител и антигенов у людей на различных стадиях инфекционного процесса.
Решение этой задачи во многом определяется уровнем знаний об
этиопатогенезе бруцеллезной инфекции. Особый интерес с практической точки
зрения представляет изучение длительности персистенции возбудителя
бруцеллеза, динамики синтеза специфических антител разных классов
иммуноглобулинов (G,A,M) при инфекционном и вакцинальном процессах в
эксперименте и при различных клинических формах бруцеллеза у людей.
Расширение диагностического арсенала за счет новых методов иммуно- и
генодиагностики позволит получить новые сведения об особенностях
инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе.
Цель исследования
Оценка влияния социально-экономических преобразований в Российской Федерации на эпизоотолого-эпидемические проявления бруцеллеза и тенденции их развития в современный период. Разработка и внедрение в практику здравоохранения современных методов иммуно- и генодиагностики бруцеллеза.
Задачами работы являлись:
-анализ эпизоотолого-эпидемической ситуации по бруцеллезу и причин ее осложнения в современный период (1997-2006гг.);
-идентификация бруцелл, впервые выделенных на территории РФ от собак, оценка эпидемиологической значимости Brucella canis;
-разработка и сравнительная оценка диагностической значимости иммунологических методов индикации бруцелл, их растворимых антигенов, а также определения специфических бруцеллезных антител;
-создание чувствительных и специфичных диагностических тест-систем и их внедрение в практическое здравоохранение в виде коммерческих препаратов;
-оценка диагностической эффективности ПЦР при исследовании материала их различных очагов бруцеллезной инфекции;
-определение диагностической значимости антител различной физико-химической природы для оценки активности течения бруцеллеза и эффективности проводимой терапии;
-определение длительности персистенции возбудителя в динамике инфекционного и вакцинального процессов с помощью разработанных методов и тест-систем при экспериментальном бруцеллезе и различных формах заболевания у людей.
Научная новизна
Впервые проведен анализ современной эпизоотолого-эпидемической ситуации по бруцеллезу в РФ, который позволил научно обосновать влияние социально-экономических факторов на эпидемические проявления бруцеллеза на конкретных территориях.
Установлено, что основное эпизоотолого-эпидемиологическое
неблагополучие по бруцеллезу за период 1997-20,06 гг. определяли Южный (Республики Дагестан, Калмыкия, Северная Осетия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская и Ставропольский край) и Сибирский (Р.Тыва) Федеральные Округа, на которые приходится 72,7% больных людей бруцеллезом (впервые установленным), и большая часть пунктов, неблагополучных по бруцеллезу животных: 96,7% по бруцеллезу крупного- и 98,4% мелкого рогатого скота.
Выявлены особенности эпидемического проявления бруцеллеза в РФ, связанные с социально-экономическими преобразованиями в стране в 90-е годы, в том числе приватизацией в животноводстве, а также неадекватно проводимыми противобруцеллезными мероприятиями, которые выражаются в:
- росте числа больных людей с неустановленным источником инфекции на 25 территориях (28,4%) субъектов РФ. Последнее указывает на то, что больной бруцеллезом человек, по-прежнему, является «индикатором» эпизоотического неблагополучия территории;
- увеличении в 1,6 раза числа территорий, где регистрируется бруцеллез
людей - с 33 (37,1%) в период 199Ы996гг до 52 (58,4%) в 1997-2006гг;
изменении в социальной и возрастной структуре заболевших: увеличение доли городских жителей (до 24,9%), в том числе детей и подростков (до 27,1%), а также больных, профессионально не связанных с общественным животноводством (до 70,7%) , включая безработных;
росте числа больных с неблагоприятным трудовым прогнозом с 2003 по 2006гг в 1,5 раза, что составило 25,9% от общего числа больных хроническим бруцеллезом;
расширении спектра эпидемически значимых резервуаров и источников бруцеллезной инфекции, вызываемой B.melitensis (козье-овечий тип), вследствии интенсификации миграции возбудителя на неспецифических хозяев (крупный рогатый скот);
Впервые на территории РФ, совместно с ветеринарными специалистами, выявлена циркуляция двух биоваров бруцелл вида canis среди собак. Получены эпизоотические и микробиологические данные, свидетельствующие о завозе В.canis из-за рубежа с собаками- компаньонами.
Впервые обоснована эффективность ИФА для лабораторной диагностики бруцеллеза в эпидемиологической и клинической практике, позволяющей выявлять бруцеллезный антиген и специфические антитела различных классов иммуноглобулинов. Применение только одного ИФА при обследовании людей в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота повысило эффективность диагностики бруцеллеза в 11,9 раз по сравнению с реакцией агглютинации, в 6 раз - реакцией Хеддльсона, в 1,2 раза— антиглобулиновой пробой Кумбса (РК). У больных хроническим бруцеллезом с большой давностью заболевания (более 5 лет) ИФА превосходила диагностические возможности реакции агглютинации в 2,33 раза, РПГА - в 7 раз, РК - в 1,4 раза.
Установлено, что при диагностике бруцеллезной инфекции у людей ПЦР позволяет регистрировать активность инфекционного процесса при большой давности заболевания (60 мес. и более).
В эпидемиологической практике широкое использование ПЦР ограничено вероятностью выявления ДНК бруцелл у лиц без клинических проявлений, имеющих контакт не только с полевыми, но и с живыми вакцинными штаммами, применяемыми для иммунопрофилактики бруцеллеза животных.
С помощью современных методов детекции специфических антигенов и антител в эксперименте и клинике подтверждена длительная персистенция возбудителя бруцеллеза в макроорганизме и выявлены ранее неизвестные стороны патогенеза инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе. Установлено, что в так называемую «стерильную» фазу инфекционного процесса, когда возбудитель бруцеллеза уже не выделяется (12 мес. от начала заражения вирулентной культурой бруцелл), наступает пик циркуляции специфического антигена и антител тестируемые в ИФА, продолжительностью до 23 мес. (срок наблюдения). При бруцеллезе у людей специфические антиген и ДНК выявляли также в течение длительного срока заболевания (более 5 лет).
Практическая ценность работы:
- разработаны, апробированы и рекомендованы к практическому использованию современные методы микроанализа: иммуно-радиометрический (ИРМА), иммуноферментный (ИФА), реакция нейтрализации антител РНАт, латексагглютинации, иммунофлуоресценции, флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением, ПЦР. Определены основные параметры указанных тестов и их диагностическая значимость для идентификации, индикации и иммунологической диагностики бруцеллеза;
внедрены в,производство и используются в практике здравоохранения:
-тест-система иммуноферментная для определения бруцеллезных антител ( ЭПР №185-89 от 2.06.1989; ФСП 42-214ВС-89 от 2.06.1989),
-тест-система иммуноферментная для определения бруцеллезного антигена (ЭПР №25-86 от 13.11.1986; ВФС 42-51ВС-86 от 24.11.1986),
-иммуноглобулины диагностические бруцеллезные люминесцирующие, сухие (РП №247-82 и ТУ 42.14-290-82.- 1982г),
-иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие R-бруцеллезные, сухие (ВФС 42/Д-018 ВС-95 от 10.05.1995; ЭПР №513-095 от 02.03.1995),
-диагностикум бруцеллезный жидкий для реакции агглютинации ( РП №1277-02 от 28.12.2002; ФСП 42-0180-4778-03 от 06.07.2004),
-вакцина бруцеллезная химическая жидкая (ФСП 42-0433376002.- 2002 РП №1175-02),
изготовлен и передан для практического использования в ГИСК им.Тарасевича:
-стандартный образец сыворотки бруцеллезной агглютинирующей сухой ОСО 42-28-6-88П,
-стандартный образец антигена бруцеллезного жидкого ОСО 42-28-5-88П, а также разработаны следующие методические материалы:
Бруцеллез (методические рекомендации по диагностике, лечению и реабилитации). М., 1987, С.28
Бруцеллез. СП 3.1.085-96. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сб. сан. и вет. правил. М.1996, С.20-46.
Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей Методические указания (МУ 3.1.7.1189-03) МЗ РФ, М., 2003. С.58
- Бруцеллез в Российской Федерации в 2001-2005 годах. Информационный
бюллетень ФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека. Москва 2007. С. 12
Материалы диссертации используются в лекциях по эпидемиологии и
микробиологии бруцеллеза на кафедрах микробиологии РМАПО и
инфектологии ММА им.И.М.Сеченова, составлено и опубликовано учебное пособие «Лабораторная диагностика бруцеллеза» М.1988, а также учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии» М.2006.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на научных конгрессах, съездах, конференциях: Всесоюзная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций» Ставрополь, 1986;Y съезд гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов. Микробиологов и инфекционистов Узбекистана, Ташкент, 1987;Международный конгресс по зоонозам, Брно,ЧССР, 1988; Всесоюзная конференция «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным», Новосибирск, 1989; Всесоюзная конференция «Применение иммуноферментного анализа в медицине», Харьков,1989; Республиканская конференция «Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы», Алушта, 1990; Всесоюзная научная конференция «Новые методы прогноза патологического процесса.», Курск, 1991; Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций», Москва, 1991; Научная конференция «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций», Ставрополь, 1991; Научно-практическая конференция «Здоровье человека и экологические проблемы», Киров, 1991; Республиканская научно-практическая конференция по курортологии и физиотерапии, Махачкала, 1991; Съезд врачей инфекционистов в г.Суздале, 1992; Научно-практическая конференция «60 лет противочумной службы Кавказа».-«Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний», Ставрополь, 1995; XY международный симпозиум «Salmonellosis-Brucellosis», Кипр, 1997; Совещание зам.главных врачей и заведующих отделами ООН ЦГСЭН в субъектах РФ, начальников противочумных учреждений МЗ РФ.,Москва, 1999; YII, YTII, IX съезды Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997, 2002, 2007г.г.; III международная конференция «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе», Персиановский, 2000; 53 бруцеллезная научная конференция
"Brucellosis 2000", Франция,2000; Девятый Московский международный ветеринарный конгресс, Москва, 2001; Научная конференция «Молекуляно-биологоческие и генетические методы диагностики в инфекционной патологии», Москва,2002; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск,2004; Международное рабочее совещание «Бруцеллез -пограничная инфекция животных и человека, требующая общих усилий разных стран», Серпухов, Мос.обл., 2008; Международная научная конференция «Brucellosis 2008», Лондон 2008.
Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов Медицинской микробиологии, Эпидемиологии и Природноочаговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 12 февраля 2009 г.
По теме диссертации опубликовано 82 работа, в том числе 20 в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. Результаты исследований вошли в 7 научных отчетов по плановым темам НИР, выполненным при участии автора в качестве руководителя, ответственного исполнителя и исполнителя (№№ госрегистрации 79049008, 01840011426, 01860012395, 01840016820, 01930004074, 01970005014, 01200110335). Полученные материалы нашли отражение в двух коллективных монографиях, двух рационализаторских предложениях и 3 патентах на изобретения.
Распространение бруцеллеза за рубежом и на территории бывшего СССР
По данным Объединенного комитета экспертов ВОЗ по бруцеллезу (1986), эта болезнь среди животных распространена практически во всем мире (в 155 странах), в том числе в таких развитых странах как США, Франция, Канада, Австралия, Италия, Испания. В мировом масштабе показатель заболеваемости людей бруцеллезом варьирует от 0,01 до 200 на 100 тыс. населения (196,268). До настоящего времени наиболее широкое распространение бруцеллез имеет в странах Средиземноморья, Малой Азии (Турция, Иран), Юга и Юго-Восточной Азии (Индия, Лаос), Африки, Центральной и Южной Америки (Мексика, Бразилия, Аргентина, Чили, Парагвай, Гватемала, Колумбия) (111,183,187,224,235,236,254,273,302).
Вместе с тем ряд стран, особенно в Европе (Англия, Дания, Германия, Финляндия, Швеция, Норвегия, Швейцария, Чехия, Словакия, Румыния), а также Япония добились практически полной ликвидации этой болезни среди животных и людей (182,192,223,259,301,333). Успешно проводится борьба с бруцеллезом в Болгарии, государствах бывшей Югославии, где регистрируются единичные случаи болезни (217,2252).
Бруцеллез, вызванный B.melitensis, представляет проблему еще и в результате недостаточной эффективности применяемой в ряде эндемичных стран профилактической вакцины для мелкого рогатого скота, изготовленной из коровьего вида бруцелл (В.abortus 19-ВА), не создающей достаточный протективный иммунитет у этого вида животных. В отношении эффективности вакцины B.melitensis Rev.l, также применяемой для иммунопрофилактики мелкого рогатого скота, нет единого мнения из-за небезопасности её для людей в результате высокой остаточной вирулентности.
Овцы и козы и их продукты являются наиболее важным источником инфекции, миграция B.melitensis на крупный рогатый скот представляет большую проблему для некоторых стран юго-востосточной Европы, Израиля, Кювейта и Саудовской Аравии (267).
В странах Северной Америки, Бразилии и Колумбии возбудитель свиного вида бруцелл - B.suis биовар 1 часто мигрирует на крупный рогатый скот (261), что создает эпидемиологическую опасность заражения людей этим достаточно вирулентным возбудителем (185,268). Появились сведения о заболеваемости людей бруцеллезом, вызванной возбудителем В.maris, с тяжелым течением инфекционного процесса - поражением центральной нервной системы (308) и позвоночника - спинальным остеомиелитом (265). Это свидетельствует о высокой вирулентности бруцелл морских животных и расширении экологического радиуса бруцеллеза для людей. Следовательно, бруцеллезная инфекция затрагивает все большие контингент людей (268).
На различных территориях циркулируют разные биовары бруцелл. Так, B.melitensis биовар 1 превалирует на территории Индии (266), Испании (294), СНГ- Казахстан (285), биовар 2 - северо-восточной Греции, а биовар 3 - Турции (194), СНГ-Грузия (334). Изучение бруцеллеза людей (П.Ф.Здродовский) и сельскохозяйственных животных (С.Н.Вышелесский) в нашей стране началось еще в 20-годы прошлого столетия. На 1-ом Всесоюзном съезде микробиологов (1928) П.Ф.Здродовский доложил о распространении бруцеллеза на территории СССР, приводя данные о 207 случаях этого заболевания, а также результатах экспериментальных работ по изучению возбудителя инфекции. В 1936 году по предложению П.Ф.Здродовского в системе здравоохранения союзных республик впервые в Советском Союзе были организованы противобруцеллезные станции, руководство которыми возглавили видные ученые и специалисты Б.П.Первушин, Н.Н.Степанов, П.Ф.Самсонов, Г.А.Баландин, А.А.Гринфельд, М.Н.Перехожева. Новое направление в области клиники и лечения бруцеллеза создали крупные советские ученые Г.П.Руднев, А.Ф.Билибин, Г.Н.Удинцев, О.Д.Соколова-Пономарева, Г.А.Пандиков, Л.К.Коровицкий, Н.Д.Беклемишев, К.В.Бунин и др. В то время научным медицинским центром страны был Всесоюзный институт экспериментальной медицины (ВИЭМ), основанный в Петербурге в 1890 году. В проведении систематических и целенаправленных работ по изучению бруцеллезной инфекции большую роль сыграла, организованная в 1932 году П.Ф.Здродовским, специальная лаборатория в институте экспериментальной медицины в Ленинграде. Лаборатория бруцеллеза, вошедшая затем в состав Всесоюзного института экспериментальной медицины в Москве, была исследовательским и научно-методическим центром по бруцеллезу и выполняет эти функции по настоящее время в составе Института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи. С 1937 года лабораторию возглавляла видный ученый П.А.Вершилова. Академику П.А.Вершиловой и ее ученикам -А.А.Голубевой, Е.И.Кайтмазовой, М.И.Чернышевой, Н.Н. Островской, Е.А.Драновской, Н.А.Грековой и др. принадлежит приоритет в области изучения патогенеза, иммунитета, эпидемиологии, усовершенствования диагностики, способствовавший успешному решению задач по снижению заболеваемости в стране. Одной из ведущих мер, являющейся инициативой академика П.А.Вершиловой, являлась профилактическая иммунизация живой вакциной людей, работающих в очагах козье-овечьего бруцеллеза, чему предшествовали тщательные экспериментальные исследования и изучения на добровольцах. В 1939 году была введена официальная регистрация больных бруцеллезом людей. Учитывая, что для постановки вопроса об иммунопрофилактике людей, необходимо было разработать способ профилактики овечьего бруцеллеза, были организованы экспедиции (1933-1937 гг.) всех сотрудников бруцеллезного отделения ВИЭМ во главе с его научным руководителем П.Ф.Здродовским. В составе экспедиции были научные сотрудники П.А.Вершилова, Б.В.Воскресенский, Е.И.Кайтмазова, Х.С.Котлярова, А.А.Соловьев, И.А.Тарасова, В.А.Штритер, в том числе сотрудники отдела патоморфологии ВИЭМ - А.А.Соловьева, М.Б.Ариель, Ленинградского и Ставропольского НИВИ - А.И.Дмитриев, А.Г.Диэсперов, М.А.Литвинов, Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова-И.И.Рогозин, И.А.Попов.
По мнению большинства исследователей, бруцеллезная инфекция во многие районы бывшего СССР занесена с импортным племенным скотом, другие считают, что бруцеллез на данной территории существовал веками на диких копытных, но не был распознан (104). В России заболеваемость населения бруцеллезом в различных регионах распространена неравномерно. Интенсивность распространения инфекции и длительность эпидемиологического неблагополучия менялись в зависимости от степени пораженности бруцеллезом различных видов животных, интенсивности проведения противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий. В 1950-1953 гг. на территории СССР регистрировалась самая высокая заболеваемость людей — показатель заболеваемости составлял 29,3-30,2 на 100 тыс. населения, источником инфекции выступал преимущественно мелкий рогатый скот. В дальнейшем, в результате комплексных противобруцеллезных мероприятий, заболеваемость с конца 50-х годов значительно снизилась, однако по-прежнему, неблагополучие по данной инфекции определял мелкий рогатый скот. Так, по средним данным за 1961-1965 гг. (31);, на территории России от овец заразилось 73,1% больных, от крупного рогатого скота - 24,8%, коз - 1,4%, свиней - 0,5%, оленей - 0,2%. Мелкий рогатый скот был сосредоточен, главным образом, в Северо-Кавказском, Поволжском, Уральском, Западно-Сибирском и Восточно-Сибирском районах (80,3% всего овцепоголовья). Здесь же имелось наибольшее число заболевших людей (93,5% от числа зарегистрированных в стране). Характерно, что распределение случаев заболеваний людей не было параллельным количеству овцепоголовья. Например, в Уральском районе количество больных овец числилось в 2 раза меньше, чем в Поволжском (11,1% против 21,8%), а больных бруцеллезом людей было в 2 раза больше (29,3% против 16,2%). В большей степени устанавливается зависимость заболеваемости людей не от численности больных животных, а от числа пунктов, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу. Так, в 23 административных районах (из 71 имевшихся в указанные годы) было сосредоточено 99,3% пунктов, неблагополучных по мелкому рогатому скоту, где регистрировалось 91,6% всех заболевших.
Определение бруцеллезных антигенов с помощью ФИАВР
Использование новых флуорохромов с большой продолжительностью флуоресценции позволяет регистрировать специфический сигнал после угасания непродолжительного фонового свечения, что значительно повышает чувствительность анализа.
В диссоционно-усиленном лантанидном флуоресцентном иммуноанализе в качестве метки наиболее часто используют ионы Европия (Ей), тяжелого металла группы лантанидов. Для образования прочной связи с белком и стабильного комплекса с ионом лантанида обычно применяют бифункциональные производные поликарбоновых кислот. На стадии детекции ионы Ей диссоциируют из меченого антитела с поверхности твердой фазы в специальный раствор и образуют новый высоко флуоресциирующий комплекс. Флуориметр " Arcus 1230 " (LKB - Wallac, Finland) регистрирует флуоресценцию Ей в диапазоне 5 х 10"14 - 10"7М. Время измерения одного образца составляет 1 секунду (240). И.В.Пономаревой (121) отработаны оптимальные условия синтеза конъюгата и проведения двухстадийного сэндвич-варианта флуоресцентного иммуноанализа. Совместно с автором нами была разработана тест-система диссоционно-усиленного лантанидного флуоресцентного иммуноанализа для выявления бруцеллезного антигена, определены специфичность и чувствительность ФИАВР.
Специфичность ФИАВР изучена нами в реакции торможения бруцеллезными антителами, а также при исследовании антигенов гетерогенных микроорганизмов. Особое внимание было уделено исследованию антигенов F.tularensis и Y.enterocolitica 0-9, которые, как известно, имеют общие антигенные детерминанты с бруцеллами. Было установлено, что растворимый антиген туляремийного микроба не выявлялся в ФИАВР в концентрации 1000 нг/мл, а корпускулярные антигены не о обнаруживались даже в концентрации 1x10 мкл/мл. Растворимый антиген Y.enterocolitica 0-9 определялся лишь в концентрациях, превышающих чувствительность ФИАВР по отношению гомологичных антигенов, более чем в 50 раз. Корпускулярный антиген Y.enterocolitica 0-9 выявляли в концентрации 5х106мкл/мл. Чувствительность ФИАВР при выявлении растворимого антигена (ЛПС) В.abortus 99 при разведении его в нормальной сыворотке человека составляла ОД нг/мл. В диапазоне концентраций от 0,6 до 250 нг/мл была получена линейная зависимость флуоресцентного сигнала от концентрации антигена в пробе (рис.12)
Каждая точка калибровочной кривой соответствует среднему значению флуоресцентного сигнала, рассчитанному по данным 10 повторных определений. При этом было отмечено, что во всем диапазоне определяемых концентраций были получены высокие соотношения сигнал/фон, следовательно, метод обеспечивал высокую достоверность результатов. Кроме того, чувствительность ФИАВР изучена на 9 штаммах бруцелл в S-форме, относящихся к B.melitensis, abortus и suis. Все микроорганизмы этих штаммов выявлялись в концентрации 1,5х104мкл/мл. Штаммы B.abortus 99,19-ВА, В.suis 1330, B.melitensis 565 давали достоверно положительные результаты в концентрации 7,5x10 мкл/мл. Изучена возможность выявления бруцеллезных антигенов с помощью ФИАВР в смеси с гетерогенными микроорганизмами. При этом убитую культуру B.abortus 99 последовательно разводили в суспензии, содержащей 1x10 мкл/мл E.coli 0111. ФИАВР позволял определить бруцеллезный антиген в присутствии избытка гетерологичных микрорганизмов практически без снижения чувствительности (рис.13). Нами были проведены исследования по выявлению бруцеллезного антигена в клиническом материале с помощью ФИАВР. Исследованы 160 сывороток крови людей больных острой и хронической формами бруцеллеза. Результаты ФИАВР сравнивали с результатами ИФА. Анализы выполняли в один и тот же день, чтобы избежать расхождения результатов. В ИФА для определения антигенов в высоких концентрациях требовалось разведение образцов или сокращение времени проведения ферментативной реакции с последующей интерполяцией результатов к стандартному времени реакции. В ФИАВР, вследствие широкого динамического диапазона, исследования клинических образцов проводили без дополнительного разведения, что упрощало процедуру исследования и позволяло избежать ошибки, возможной при разведении образцов. Как видно из таблицы, совпадение, положительных результатов ФИАВР и ИФА установлено в 91,2%, при этом отмечалась хорошая корреляционная зависимость между ними (г = 0,94).
Таким образом, проведенные исследования показали, что ФИАВР обладает высокой чувствительностью при определении как растворимого, так и корпускулярного специфических антигенов. Анализ имеет высокую специфичность и позволяет выявлять бруцеллезные антигены в смеси с гетерологичными микроорганизмами без снижения чувствительности. ФИАВР может быть использован как в эпидемиологической, так и клинической практике. Однако ФИАВР имеет ряд недостатков, основными из которых являются - необходимость высокой чистоты проведения анализа и специального импортного оборудования для учета реакции.
Диагностическая ценность ПЦР в клинической практике
В современных условиях диагностика большинства инфекционных заболеваний, в том числе и бруцеллеза, ввиду их выраженного клинического полиморфизма невозможна без объективного лабораторного подтверждения. Оценку эффективности ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза в клинической практике осуществляли при исследовании 231 образца сывороток крови людей больных различными формами бруцеллеза.
При тестировании сывороток крови людей, больных острой (I группа), подострой (II группа) и хронической формой (III группа) бруцеллеза с помощью ПЦР были получены положительные результаты практически у всех обследованных больных (96,3±3,7%, 100% и 95,9±1,6% соответственно). Следует отметить, что все больные находились на стационарном лечении и были обследованы в период активного течения инфекционного процесса с выраженными клиническими проявлениями. Частота положительных ответов в серологических реакциях при этих формах заболевания подтверждали это.Наиболее эффективными серологическими тестами при диагностике всех форм заболевания явились реакция Кумбса и ИФА, с помощью которых бруцеллезные антитела были выявлены в 97,1-100% случаев при подострой и острой и 79,3-82,2%) при хронической формах бруцеллеза (соответственно).
Важным разделом нашей работы было определение возможности использования ПЦР для проведения эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией и оценка информативности различных методов лабораторной диагностики при обследовании лиц, относящихся к группам риска заражения бруцеллезом. Результаты этого раздела работы суммированы в таблице 42. Всего было обследовано 440 человек (таблица 41), из них:1 группа -сотрудники специализированной лаборатории (9 человек), П группа - работники биокомбината (79 человек), Ш группа - мясокомбината (200 человек), IV -молочно-товарной фермы (20 человек), а также V группа - контактные лица в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота (104 человека) и VI - крупного рогатого скота (20 человек).
При обследовании сотрудников лаборатории (табл.42), постоянно контактирующих с живыми культурами бруцелл (I группа), выявили наличие ДНК бруцелл во всех образцах. Все сотрудники лаборатории были ранее вакцинированы живой бруцеллезной вакциной из штамма В.abortus 19ВА, а один сотрудник болен хронической формой бруцеллеза.
При обследовании этой группы лиц ДНК с помощью ПЦР определяли одновременно в образцах цельной крови, сыворотке и моче. ДНК была выявлена во всех образцах цельной крови и сыворотке и ни в одной из проб мочи (выделение ДНК из мочи проводили по специальной методике). Однако, следует отметить, что при учете результатов наиболее четкие линии преципитации в электрофорезе получены при исследовании образцов сыворотки, а не цельной крови. Это согласуется с данными других исследователей (294,296,335), которые рекомендуют для диагностики бруцеллеза использовать образцы сыворотки крови.
Нами также были обследованы работники Щелковского биокомбината Московской области (группа II), на котором изготавливают живые бруцеллезные вакцины из штаммов В. abortus 19 и 82, используемые в ветеринарной практике. Сотрудники биокомбината не были вакцинированы против бруцеллеза и в плановом порядке никогда ранее не обследовались на бруцеллез. Несмотря на непрерывный закрытый процесс выращивания бактериальной массы в ферментерах, не исключалась возможность прямого контакта персонала производства с живыми культурами бруцелл вакцинных штаммов, в том числе с 82 штаммом, имеющим высокую остаточную вирулентность. Этим можно объяснить столь частые находки ДНК бруцелл в ПЦР, а также результатов серологических реакций и ИФА. Так, в 91,1±3,2% случаев была положительной ПЦР, 89,9±3,6% - ИФА, 77,2±4,8% - РПГА, 74,7±4,9% - РК. Наиболее информативным тестом оказался ИФА, который выявлял специфические антитела в 89,9% случаев в высоком титре (1:4000).
Полученные данные свидетельствуют об инфицированности сотрудников вакцинными штаммами. При клиническом обследовании этой группы у большинства были выявлены различные очаговые проявления аллергического характера (бурситы, тендовагиниты, фиброзиты), однако только два сотрудника из числа обследованных находились на диспансерном учете с диагнозом хронический бруцеллез. По-видимому, больных бруцеллезом среди обследованного контингента гораздо больше, но отсутствие диспансеризации этой категории работников не позволяет осуществлять диагностику данного заболевания.
В системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией важное место занимает плановое серологическое обследование профессиональных групп, являющихся группами риска заболевания бруцеллезом. В этой связи нами были обследованы сотрудники мясокомбината, который является современным высоко технологичным предприятием, работающим на привозном, замороженном сырье и где забой скота не производится (группа III). Из таблицы 40 видно, что у четырех обследованных (2,0±1,0%) в сыворотке, крови была выявлена ДНК бруцелл, а также специфические антитела. При последующем тщательном клиническом обследовании этих сотрудников был диагностирован бруцеллез в хронической форме.
Обследование сотрудников молочно-товарной фермы (группа IV), на которой животные были вакцинированы живой бруцеллезной вакциной B.abortus 82 (Оренбургская область), позволило выявить ДНК бруцелл в образцах сывороток крови с помощью ПЦР в 89,3±5,9% случаев. Специфические антитела были выявлены в сыворотках крови только у 42,9±9,5% обследованных. При этом клинические проявления бруцеллеза у сотрудников фермы не были выявлены. Следовательно, присутствие ДНК бруцелл в крови обследованных сотрудников МТФ при отсутствии клинических проявлений бруцеллеза свидетельствуют о их «проэпидемичивании» их в результате попадания во внешнюю среду вакцинного штамма 82. В этих случаях ПЦР не имеет диагностической ценности, а лишь демонстрирует наличие ДНК вакцинного штамма в организме персонала МТФ.
Следует отметить, что в большинстве случаев обострение эпидемиологической ситуации по бруцеллезу на благополучных территориях связано с бесконтрольным завозом больных животных из регионов неблагополучных по бруцеллезу сельскохозяйственных животных. Так, в 2003 г были зарегистрированы случаи заболевания людей бруцеллезом в Зоопитомнике Московского зоопарка, расположенным в Московской области. При обследовании очага инфекции и изучении эпизоотологической обстановки было выявлено, что источником заражения людей бруцеллезом оказались овцы гиссарскои породы (6 голов), привезенные в 2002 году из Таджикистана. Лабораторное обследование с помощью серологических тестов и ПЦР всех сотрудников Зоопитомника и подсобного хозяйства позволило выявить 36 лиц, инфицированных возбудителем бруцеллеза, в 6 (16,6±6,3%) из них - верифицировать диагноз бруцеллеза. ГЩР была положительной у 32,7±4,6% обследованных, в двух случаях при положительном результате в реакции Хеддльсона ПЦР была отрицательной ( группа Y).
В группе лиц (группа YI), обследованных в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота (частный сектор), у всех контактировавших с больным животным ПЦР была положительной. Ни в одном случае не выявлены специфические антитела и клинические проявления бруцеллезной инфекции, что можно объяснить слабой вирулентностью бруцелл коровьего вида. Следует отметить, что частный скот не был вакцинирован против бруцеллеза.
Специфические иммуноглобулины разных классов (G, А, М) при бруцеллезе у людей
Ранее нами была изучена физико-химическая природа специфических антител у людей, больных бруцеллезом, в различные фазы инфекционного процесса с помощью 2 МЭ-теста. Синтез IgM и IgG антител определяли в динамике заболевания (в течение 48 недель). Показано, что в первые недели развития инфекционного процесса выявляются, главным образом, агглютинины класса IgM. Неполные антитела синтезируются уже в ранние сроки и относятся к IgG-антителам. Выраженная клиническая картина у обследованных больных позволяет сделать заключение, что неполные антитела в большей мере, чем агглютинины и гемагглютинины, отражают продолжающийся инфекционный процесс (165).
У людей в острой стадии заболевания с бактериологически подтвержденным диагнозом в сыворотке крови, как правило, выявляются специфические IgG антитела (55,298). Выявление IgG антител авторы связывают с наличием в организме живого возбудителя и, как следствие этого, с усиленной антигенной стимуляцией. У выздоравливающих и у лиц, имевших лишь контакт с возбудителем, по мнению авторов, преобладают IgM антитела. Следовательно, наличие IgG антител в сыворотке крови, по-видимому, может указывать на наличие активности инфекционного процесса (200). Это положение было подтверждено данными других авторов (55,80). У больных острым бруцеллезом в 100% случаев были обнаружены цистеинрезистентные IgG антитела. При хронической форме с давностью заболевания от 3 до 20 лет IgG антитела выявляли в пределах 10% случаев, главным образом, с тяжелым клиническим течением острого бруцеллеза и при декомпенсации хронического (55). В сыворотках крови больных с резидуальным бруцеллезом, а также у лиц со стойким клиническим излечением после острой формы бруцеллеза, IgG антитела, как правило, не выявлялись (53,55,79,177).
Таким образом, острая и подострая форма заболевания характеризуются наличием специфических IgG антител, что может явиться показателем активности инфекционного процесса и косвенно свидетельствовать о наличии возбудителя или его растворимых антигенов в организме. Обнаружение IgG антител в сыворотках больных хронической формой бруцеллеза может быть связано с рецидивом заболевания или суперинфицированием.
Анализируя результаты изучения физико-химической природы специфических антител, выявляемых с помощью обработки сывороток редуцирующими веществами с последующим исследованием их в серологических реакциях, следует отметить, что этот метод позволяет конкретно судить только о синтезе IgG и косвенно - IgM антител. Данный тест не позволяет выявить специфические антитела, относящиеся к IgA и в связи с этим долгое время функция этого класса иммуноглобулинов оставалась не изученной, автоматически считалось, что специфические IgA антитела не играют какой-либо роли при бруцеллезной инфекции (255).
Наиболее информативным методом выявления специфических антител разных классов является метод адсорбции сыворотками (анти- IgG, IgA, IgM) с последующим исследованием в серологических тестах. Используя этот метод удалось выявить не только специфические антитела классов IgM и IgG, но и IgA (328). Однако этот тест технически сложный и оказался непригодным для массовых исследований в системе эпидемиологического надзора за бруцеллезом.
В последние годы большое внимание уделялось иммуноферментному анализу (ИФА) и возможности его использования для диагностики бруцеллеза у животных и людей (119,186,290), а также выявления с его помощью специфических иммуноглобулинов разных классов (IgG,IgA,IgM,IgE). В первую очередь нами были отработаны оптимальные условия ИФА для выявления специфических антител при бруцеллезе у людей и изучена его чувствительность и специфичность.
В данном разделе работы проведены исследования по отработке оптимальных условий ИФА и сравнительное изучение специфичности и чувствительности при различных клинических формах бруцеллеза.
В качестве твердофазного носителя применяли отечественные планшеты для иммунологических реакций (ТУ-64-2-278-79). Для сенсибилизации полистирола испытывали следующие растворимые антигены: 1 — антиген Буавена из штамма В. abortus 19 - ВА; 2 - ЛПС из штамма В. abortus 99; 3 -солевой антиген из штамма В. abortus 99, полученный по методу М. Jones (250).
Для получения пероксидазного конъюгата использовали кроличьи сыворотки против IgG (Н + L) человека с титром реакции преципитации в геле 1:32. Иммуноглобулиновую фракцию, полученную по методу A. Poison с соавт. (293), конъюгировали с пероксидазой хрена типа A, Rz 3,0 (НПО «Биохимреактив», г. Олайне) методом периодатном окислении по М. В. Wilson и соавт. (329) с очисткой конъюгата от свободной пероксидазы на колонке с сефарозой 6В. Концентрация белка в конъюгате 1,2 мг/кг, Rz - отношение оптических плотностей при длинах волн 403 и 280 нм-0,5. Конъюгаты стабилизировали добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) до концентрации 10 мг/мл, разливали в ампулы и лиофилизировали.
Оптимальную концентрацию антигена, обеспечивающую наибольшую чувствительность реакции, и рабочее разведение конъюгата определяли опытным путем - титрованием положительных и отрицательных сывороток с разными дозами антигена на сорбенте и при разных разведениях конъюгата в шахматном порядке.
Для постановки реакции растворы антигенов в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,4 и в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 в разных концентрации (0,1-100 мкл) вносили в лунки полистироловых пластин в объеме 200мкл. Иммобилизацию проводили 2 ч при 37С или 16 ч при 4 С.
Несвязавшийся антиген удаляли и после 3-4 кратной промывки ФСБ с 0,05% твин-20 в лунки вносили 2-кратные разведения опытных и контрольных сывороток в том же буфере начиная с разведения 1:50. Реакцию взаимодействия антиген-антитело проводили 1ч при 37С с последующей промывкой.
Конъюгат разводили в 50% нормальной бычьей сыворотке в ФСБ. Инкубация с конъюгатом 1ч при 37С. После 4-5 — кратной промывки ФСБ с 0,05%о твин-20 вносили субстрат-индикаторный раствор (0,04%о 0-фенилен-диамина в 0,05М цитратно-фосфатном буфере рН 6,0 с 0,04% Н2Ог) в том же объеме. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл Ш. раствора серной кислоты.
При постановке реакции ставили контроли субстрата, сорбции коньюгата на сенсибилизированный антигеном полистирол, реакции с положительной контрольной сывороткой, реакции с отрицательной контрольной сывороткой, специфичности - реакция торможения специфическим антигеном. Результаты учитывали на фотометре фирмы «Flow Laboratories» при длине волны 492 нм. Положительным считали результат, более чем в 2 раза превышающий оптическую плотность (ОП) в лунках с отрицательными контролями, но не ниже 0,2.
При изучении зависимости чувствительности иммуноферментной тест-системы от природы антигена и физико-химических условий его адсорбции принципиальных различий выявлено не было. Все исследуемые антигены полнее адсорбировались в ФСБ рН 7,4, но при одинаковом времени адсорбции оптимальная концентрация для солевого антигена составляла 1-10 мкг/мл, а для антигена Буавена-не менее 10 мкг/мл.
![Природная очаговость, эпидемиология, лабораторная диагностика туляремии в Краснодарском крае [Электронный ресурс]](/i/i/4306/179557.png "Природная очаговость, эпидемиология, лабораторная диагностика туляремии в Краснодарском крае [Электронный ресурс] Антонов Андрей Васильевич")
