Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1 Краткие исторические сведения .7
1.2. Характеристика возбудителя 8
1.3. Эпидемиология токсоплазмоза 11
1.3.1.Резервуары и источники возбудителя 11
1.3.2. Пути заражения человека 13
1.3.3. Распространение 15
1.3.4. Заболеваемость и смертность 17
1.4. Клиническая картина 19
1.5. Диагностика токсоплазмоза 21
1.6. Лечение 27
1.7. Профилактика 28
1.8. Токсоплазмоз как оппортунистическая инвазия 31
1.8.1. Токсоплазмоз у реципиентов органов 31
1.8.2. Токсоплазмоз у пациентов с ВИЧ-инфекцией 34
Глава 2. Материалы и методы исследования .41
2.1. Материалы исследования .41
2.2. Методы исследования .43
2.2.1. Паразитологические методы исследования 43
2.2.2. Гистологические методы исследования .44
2.2.3. Иммунологические методы исследования 44
2.2.4. Молекулярно-биологические методы исследования 46
2.2.5. Статистические методы исследования 47
Глава 3. Результаты собственных исследований 49
3.1. Оценка распространения токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией .49
3.1.1. Оценка распространения токсоплазменной инвазии среди пациентов с ВИЧ-инфекцией 49
3.1.2. Распространение активных форм токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией .53
3.1.3. Причины активности патологического процесса при токсоплазменной инвазии у пациентов с ВИЧ-инфекцией 60
3.2. Определение эффективности иммунологических и молекулярно-биологических методов лабораторной диагностики токсоплазмоза при ВИЧ-инфекции 62
3.2.1. Диагностическая чувствительность определения показателей реактивации токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией .62
3.2.2. Диагностическая специфичность определения показателей реактивации токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией .68
3.2.3. Диагностическая эффективность определения показателей реактивации токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией .70
3.2.4. Выявление показателей реактивации токсоплазмоза у пациентов на различных стадиях ВИЧ-инфекции 71
3.3. Значение токсоплазмоза в структуре инфекционной патологии у пациентов с ВИЧ-инфекцией 73
3.3.1. Заболеваемость церебральным токсоплазмозом пациентов с ВИЧ-инфекцией 73
3.3.2. Анализ летальных случаев токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией 80
3.3.2.1. Количество летальных исходов от токсоплазмоза и локализация поражений токсоплазменной этиологии 80
3.3.2.2. Анализ причин высокой смертности от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией 84
3.4. Изучение особенностей течения токсоплазменной инвазии на модели in vivo. 89
3.5. Предложения по совершенствованию тактики диагностики и профилактики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией 98
3.5.1. Разработка тактики диагностических мероприятий 98
3.5.2. Разработка тактики профилактических мероприятий 102
Обсуждение результатов и заключение 107
Выводы 113
Список литературы 114
- Эпидемиология токсоплазмоза
- Токсоплазмоз как оппортунистическая инвазия
- Паразитологические методы исследования
- Распространение активных форм токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией
Введение к работе
Актуальность проблемы
Токсоплазмоз – убиквитарная инвазия, широко распространенная среди населения (в мире инвазировано более 2 млрд. человек). Наиболее высокий уровень распространения токсоплазмоза регистрируется в странах Латинской Америки и тропических странах Африки, достигая 80% [Bahia-Oliveira L.M. et al., 2003; Pappas G. et al., 2009]. В России инвазировано 32-37% населения [Гончаров Д.Б. и др., 2006]. Однако показатели заболеваемости населения значительно ниже, так как у 80-90% инвазированных людей токсоплазмоз протекает латентно [Казанцев А.П., 1985].
В последние десятилетия у людей с различными формами нарушения иммунного ответа, в особенности у больных СПИДом, все чаще регистрируют тяжелые клинические формы токсоплазмоза, связанные с реактивацией латентной инвазии, нередко заканчивающиеся летальным исходом, что позволило отнести данное заболевание к числу СПИД-ассоциированных. В различных странах в настоящее время токсоплазмоз занимает 3 – 5 место в структуре СПИД-ассоциированных заболеваний и 1 – 2 место среди инфекционных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) у пациентов с ВИЧ-инфекцией [Bonnet F. et al., 2005; Fragoso Y.D. et al., 1998; Gongora-Rivera F. et al., 2000; Lanjewar D.N. et al., 1998; Mohar A. et al., 1992; Nissapatorn V., 2008; Oliveira J.F. et al., 2006; Satishandra P. et al., 2000].
Клиническая картина токсоплазмоза, развивающаяся при ВИЧ-инфекции, в значительной степени отличается от таковой при врожденном или приобретенном токсоплазмозе у иммунокомпетентных людей. Наиболее частая форма поражения у пациентов с ВИЧ-инфекцией – церебральный токсоплазмоз, клиническая картина которого схожа со многими другими заболеваниями, развивающимися при СПИДе [Покровский В.В. и др., 2003]. Это затрудняет постановку диагноза токсоплазмоза и выводит на первый план лабораторные методы исследования. В настоящее время для дифференциальной диагностики церебрального токсоплазмоза используются иммунологические и молекулярно-биологические методы, а также методы визуализации, например, магнитно-резонансная томография (МРТ). Несмотря на широкий спектр применяемых лабораторных исследований, единый алгоритм диагностики до сих пор не разработан, а роль иммунологических методов часто недооценивается.
В России, начиная с середины 1996 года, отмечено стремительное распространение ВИЧ-инфекции, что во многом связано с резким ростом инъекционной наркомании [Ладная Н.Н. и др., 2008]. В связи с этим возросло значение и СПИД-ассоциированных заболеваний, среди которых токсоплазмоз, по отдельным данным, занимает 3-5 место в структуре летальных исходов [Тишкевич О.А. и др., 2004; Цинзерлинг В.А. и др., 2010]. Данный факт не отражен в официальной статистике, поскольку регистрируют преимущественно первичные случаи инвазии, а учет хронических и латентных форм не ведется. Соответственно, истинные данные о распространении инвазии, заболеваемости и смертности от токсоплазмоза в России отсутствуют, а мероприятия по совершенствованию диагностики и профилактики токсоплазмоза при ВИЧ-инфекции не проводятся.
Цель исследования: оценить значение токсоплазмоза для больных СПИДом и усовершенствовать тактику диагностики и профилактики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией.
Задачи исследования
-
Провести оценку широты распространения токсоплазменной инвазии у пациентов с ВИЧ-инфекцией.
-
Определить диагностическую эффективность иммунологических и молекулярно-биологических методов диагностики токсоплазмоза на фоне ВИЧ-инфекции.
-
Оценить заболеваемость и летальность от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией.
-
Изучить особенности течения токсоплазменной инвазии при заражении лабораторных животных (мышей) штаммом от пациента с ВИЧ-инфекцией.
-
Разработать тактику диагностических и профилактических мероприятий в отношении токсоплазмоза как СПИД-ассоциированного заболевания.
Научная новизна работы
Впервые проведена оценка широты распространения токсоплазменной инвазии среди пациентов с ВИЧ-инфекцией в Москве. Лабораторно подтверждено, что заболевание развивается в результате реактивации латентно протекающей инвазии, определен риск реактивации с учетом современной эпидемической ситуации.
Впервые в России для диагностики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией использован широкий спектр иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования: определение антител классов IgG (количественный анализ), IgM и IgA к Toxoplasma gondii в сыворотке крови и специфических IgG в образцах спинномозговой жидкости (СМЖ), а также ДНК T.gondii в том же биологическом материале. Проведена оценка диагностической эффективности каждого метода в отдельности, а также их различных комбинаций. Определен оптимальный комплекс лабораторных исследований для подтверждения факта реактивации инвазии и постановки диагноза токсоплазмоза.
На основе применения разработанного алгоритма диагностики, анализа историй болезни и данных патологоанатомических исследований определен уровень заболеваемости и летальности от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией.
Впервые в России изучены свойства штамма T.gondii, выделенного от пациента с ВИЧ-инфекцией, при заражении им лабораторных животных.
Практическая значимость работы
На основании полученных данных разработаны мероприятия по совершенствованию тактики диагностики и профилактики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией, обоснована необходимость их внедрения в практическую медицину.
Разработанный алгоритм диагностики апробирован в ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ. Показано, что проведение лабораторных исследований в соответствии с разработанным алгоритмом позволило почти вдвое сократить количество летальных исходов от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией.
Внедрение в практику. Разработаны методические рекомендации «Диагностика и профилактика токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией» (одобрены на «Совете по внедрению научных достижений в практику» ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России: протокол № 28 от 13 марта 2014г.). Полученные результаты используются в работе врачами специализированных отделений для лечения больных ВИЧ-инфекцией в ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ (Акт внедрения от 25.02.2014г.).
Апробация работы: Материалы работы доложены на VI Международной научно-практической конференции «Паразитарные болезни человека, животных и растений» (г. Витебск) в 2008 году, на VII Международной научно-практической конференции «Современные аспекты патогенеза, клиники, диагностики, лечения и профилактики протозоозов, гельминтозов и арахноэнтомозов человека, животных и растений» (г. Витебск) в 2010 году, IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва) в 2012 году, на XIX Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (г. Санкт- Петербург) в 2013 году и на VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва) в 2014 году. Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела эпидемиологии и отдела природно-очаговых инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России 20 декабря 2013г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 9 в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.
Структура и объем диссертации: диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 210 источников, из которых 69 отечественных и 141 зарубежных. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 17 рисунками.
Эпидемиология токсоплазмоза
Резервуарами токсоплазменной инвазии являются дикие, домашние и сельскохозяйственные животные [8; 24; 41]. Все эти резервуары могут стать при определенных условиях и источниками инвазии для человека, однако эпидемическое значение их неравнозначно.
Дикие животные – резервуар возбудителя токсоплазмоза в природе. К настоящему времени токсоплазмы были обнаружены более чем у 400 видов млекопитающих и птиц, большинство из которых являются обитателями дикой природы [8; 24; 29; 32; 44; 83; 98; 100; 114; 127; 131; 146; 150; 167; 177; 184]. Также токсоплазмоз был доказан для большинства видов представителей семейства кошачьих [156; 184], которые являются дефинитивными хозяевами токсоплазм.
Распространение инвазии среди обитателей дикой природы зависит от совокупности многих факторов среды их обитания, а также вида животного [8; 44; 184]. Во-первых, это наличие в данном ареале обитания представителей семейства кошачьих, от чего зависит загрязнение окружающей среды ооцистами. Во-вторых, это климатические особенности, так как именно они влияют на длительность сохранения ооцист в окружающей среде. Так сухой и жаркий климат неблагоприятен для внешней стадии развития токсоплазм, а самый высокий уровень распространения токсоплазменной инвазии регистрируется в тропических странах с теплым и влажным климатом. В-третьих, это пищевые повадки различных видов животных. Так за счет перезаражения промежуточных хозяев токсоплазм по пищевым цепям уровень инвазированности травоядных животных часто ниже, чем плотоядных или всеядных [29; 44]. В-четвертых, на инвазированность влияет восприимчивость данного вида организма к возбудителю [8; 24; 32; 44; 127]. От этого также зависит, остро или латентно будет протекать у них инвазия. Острая инвазия может наблюдаться у таких высокочувствительных животных, как мышевидные грызуны или зайцы [8; 24; 29; 127]. Плотоядные животные более резистентны к токсоплазмам и чаще являются латентными носителями инвазии в природе [24; 44]. Также на распространение инвазии среди диких животных влияют особенности ландшафта, среды обитания, образа жизни животного, миграция животных (и птиц) и многие другие факторы [8; 41; 67; 69; 151; 184].
Распространение токсоплазмоза среди представителей семейства кошачьих также может сильно варьировать [8; 70]. Так как кошка заражается преимущественно при поедании инвазированной токсоплазмами жертвы, то ее инвазированность будет зависеть от характера питания жертвы и риска ее заражения в данной среде обитания. Так, например, зараженность пум (ягуаров) в Канаде достигает 92% [73].
Токсоплазмоз широко распространен также и среди сельскохозяйственных животных. Инвазия выявлена у свиней, крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, верблюдов, домашних оленей, ослов, буйволов, зебу, пушных зверей (норок, песцов, лисиц, кроликов), а также у разных видов домашних птиц (кур, гусей, цесарок, индеек) [8; 9; 32; 41; 44; 69; 83; 98; 127; 167; 194]. Однако их инвазированность T.gondii сильно варьируется. К примеру, по данным научной литературы распространение токсоплазмоза среди крупного рогатого скота варьируется от 2 до 92%, овец – от 17 до 89%, коз – от 4 до 82% [41; 83; 98; 102; 130; 184; 194]. Это связано с напряженностью природного очага токсоплазмоза в регионе, а также условиями содержания животных. Так, на закрытых фермах с соблюдением всех санитарных правил инвазированность T.gondii может сильно сокращаться по сравнению с фермами открытого типа [8; 44; 184; 194]. Значительные результаты по снижению инвазированности разводимых животных были достигнуты рядом стран на свино- и птицефермах. Так, уровень инвазированности снизился для свиней с 20-50% до 0,5-5% [41; 83; 184], а для кур с 80-100% практически до 0% [98; 184].
Токсоплазмоз у животных приводит к абортам, гибели молодняка, а также взрослых животных. При остром течении токсоплазмоза больные животные выделяют возбудителя с молоком, слюной, что способствует дальнейшему заражению животных, а также работников ферм. Мясо зараженных животных содержит цисты токсоплазм, а, значит, является источником инвазии для людей. Все это наносит значительный экономический ущерб животноводству, поэтому токсоплазмоз сельскохозяйственных животных приобрел важное самостоятельное значение как проблема ветеринарии [8; 41].
Важное эпидемическое значение как источника заражения людей отводится домашним животным – собакам и кошкам.
У собак чаще регистрируют хронические формы токсоплазмоза или длительное бессимптомное носительство. Однако у них возможны и случаи острого токсоплазмоза, особенно у молодых животных. Степень зараженности собак токсоплазмами составляет от 4 до 53,6% [11; 42; 43; 58; 98; 194]. Значение собаки в эпидемическом процессе неоднозначно: многими авторами оспаривается возможность заражения человека от собаки, однако в острой стадии инфекции в выделениях больных собак удавалось обнаружить возбудителя [114]. Также доказано, что собаки часто пассивно переносят ооцисты токсоплазм на лапах и шерсти с улицы в дом [11].
Гораздо большее эпидемическое значение имеет кошка – окончательный хозяин токсоплазм. Это обусловлено выделением большого количества ооцист в течение 2-4 недель после заражения животного и чрезвычайной их устойчивостью во внешней среде на протяжении длительного времени. Зараженность кошек также может сильно варьировать в зависимости от условий обитания и рациона [11; 60]. В разных странах она составляет от 17 до 80% [11; 42; 43; 58; 60; 73; 98; 114; 194; 205].
Подводя итог, можно сказать, что ведущая эпидемическая роль среди различных источников токсоплазменной инвазии для людей принадлежит домашним кошкам и сельскохозяйственным животным [9; 12; 58]. Дикие теплокровные животные имеют ограниченное значение как непосредственные источники токсоплазмозной инвазии для людей, но они, несомненно, являются важнейшим резервуаром инвазии в природе.
Как уже было сказано, основными инвазивными стадиями токсоплазм являются ооциста со спорозоитами и тканевая циста с брадизоитами. Попадание этих форм паразита, а также тахизоитов, в организм человека при реализации различных путей передачи приводит к заражению людей.
Для токсоплазмоза принято выделять четыре основных пути заражения: пероральный или алиментарный, контактный или перкутанный, трансплацентарный и трансплантационный. Основной путь передачи паразита – алиментарный. Он может реализоваться через употребление в пищу как цист токсоплазм, так и ооцист. Цисты паразита попадают в организм человека с инвазированным токсоплазмами мясом животных и птиц, не прошедшим достаточную термическую обработку. Реализация этого пути передачи зависит от многих факторов. Во-первых, это уровень инвазированности потребляемого мяса, который зависит от вида животного или птицы (баранина, говядина, свинина, курица и т.д.) [139], а также напряженности природного очага в конкретном регионе или ферме, откуда производится забор животных. На выбор разводимых и употребляемых в пищу животных могут также влиять географические, религиозные и другие факторы [144]. Во-вторых, это степень термической обработки, которой подвергается мясо. Как известно, цисты токсоплазм погибают при глубокой заморозке (менее -12С) в течение нескольких дней или при нагревании свыше 60-70С, однако они могут сохранять свою жизнеспособность в охлажденном мясе до 3 недель, а также в течение различного времени готовки при невысоких температурах [102; 103]. В-третьих, это традиции и привычки людей. В национальных кухнях ряда стран, таких как Франция, Германия и др., присутствуют блюда из сырого мяса, а также традиция употреблять в пищу мясо разной степени прожарки, мясо с кровью и замороженное мясо [81; 96; 144; 152]. Немаловажной является и привычка многих хозяек пробовать на вкус сырой мясной фарш [96; 139]. По данным ряда исследователей на долю этого пути заражения приходится около 30-63% случаев, также он считается основным источником инвазии в западных странах [96; 105; 144]. Как правило, при реализации этого пути передачи наблюдаются единичные случаи заражения, однако есть описания небольших вспышек токсоплазмоза при употреблении в пищу недоваренного мяса. Такие вспышки обычно затрагивают не более 20 человек [92; 158].
Реализация передачи токсоплазм с помощью ооцист связана с загрязнением окружающей среды: овощей, фруктов, воды, почвы, бытовых предметов и рук [114; 168; 194; 197]. Как известно, зрелые ооцисты при благоприятных условиях (влажный и теплый климат) могут сохраняться в окружающей среде до года и более [184] и вместе с элементами окружающей среды попадать в организм человека. Борьба с ооцистами затруднена, так как они устойчивы к нагреванию (при температуре 35-40С они могут сохранять жизнеспособность в течение месяца), различным дезинфектантам, в том числе и используемым для обеззараживания воды в централизованных системах водоснабжения [184]. Следовательно, реализации этого пути передачи способствуют благоприятные климатические условия, низкий социально-экономический уровень жизни населения, отсутствие гигиенических навыков (употребление сырой воды, немытых овощей и фруктов), а также наличие в доме и на прилегающей территории кошек [12; 58; 74; 79; 81; 96; 144; 152; 194; 195; 197]. Этот путь заражения более распространен в развивающихся тропических странах, с низким социально-экономическим уровнем жизни, таких как страны Южной Америки и Африки. В ряде стран, Канаде, Панаме и Бразилии, были зарегистрированы крупные водные вспышки токсоплазмоза [74; 79; 168; 197]. Также это один из основных путей заражения детского населения, в полной мере не овладевшего гигиеническими навыками [114; 190; 195]. Стоит отметить, что непосредственно от кошки человек заражается редко [114], именно рассеянные в окружающей среде ооцисты представляют опасность для людей.
Еще одним способом алиментарного заражения токсоплазмами является употребление свежего, непастеризованного молока, чаще козьего [8; 96; 131; 139; 188]. Этот путь заражения связан с попаданием в организм человека тахизоитов с молоком инвазированного животного [204].
Токсоплазмоз как оппортунистическая инвазия
В связи с распространением иммунодефицитных состояний большое значение приобретают оппортунистические инфекции (ЦМВИ и другие герпесвирусы) [48]. Важное значение среди них имеет и возбудитель T.gondii, что объясняется его широким распространением среди человеческой популяции. В настоящее время выделяют две основные группы людей, для которых риск развития токсоплазмоза, связанный со снижением иммунитета, наиболее высок. К ним относят реципиентов органов и больных ВИЧ-инфекцией.
Токсоплазмоз после трансплантации органов может развиваться в 2 случаях. Во-первых – в результате реактивации латентно протекающего токсоплазмоза у реципиента на фоне иммуносупрессивной терапии, назначаемой при пересадке органов [116; 128]. Во-вторых – в результате пересадки зараженного токсоплазмами донорского органа (сердца, печени, почки и др.) серонегативному к T.gondii реципиенту – трансплантационный путь (проведение иммуносупрессивной терапии так же способствует развитию острого приобретенного токсоплазмоза) [116; 117; 124; 128; 154; 160].
При пересадке зараженного органа токсоплазмоз, как правило, развивается в первые 1,5 месяца после трансплантации [128; 160; 162; 192, 209], хотя может наблюдаться и в более поздние сроки – до года [162; 209]. Реактивация латентной инвазии чаще происходит в более отдаленные сроки (в среднем на 3-4 месяце) и возможна на протяжении 7 лет после трансплантационных мероприятий [162; 170; 209]. Нередко токсоплазмоз развивается после отмены препаратов, назначаемых в течение нескольких месяцев для профилактики других оппортунистических заболеваний (пневмоцистной пневмонии) [209].
Наиболее частые клинические проявления инвазии при трансплантации – это токсоплазменный энцефалит, пневмония и хориоретинит, поражение сердца и диссеминированный токсоплазмоз [95; 115; 116; 124; 160; 162; 199; 209]. В ряде случаев отмечены необычные клинические формы заболевания (например, гемофагоцитарный синдром) [145; 192].
Среди реципиентов различных органов развитие токсоплазмоза часто заканчивается летально, например, у реципиентов костного мозга этот показатель достигает 66% [162], у реципиентов почки – 65% [209]. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, это время развития токсоплазмоза после трансплантации. Наиболее плохой прогноз отмечен при развитии заболевания в период с 1 по 4 месяц [162]. Во-вторых, это тяжесть клинической картины. Например, токсоплазменный энцефалит легче поддается лечению, чем диссеминированный токсоплазмоз [124; 160; 162; 199]. В-третьих, это выраженность иммуносупрессии под действием лечебных мероприятий (химиотерапия, облучение). В-четвертых, это сложность диагностики токсоплазмоза у этих больных, особенно острого приобретенного токсоплазмоза в ранние сроки заболевания, так как IgM и IgG к T.gondii еще не успевают образоваться [160; 209]. Также диагностику осложняет развитие атипичной картины заболевания [145; 192]. Диагноз у таких больных ставится часто только посмертно [160]. Для реципиентов почки процент недиагностированного токсоплазмоза достигает 43% [209]. В-пятых, развитие токсоплазмоза может способствовать отторжению пересаженного органа у реципиента, что также может приводить к летальному исходу [76].
Наиболее часто токсоплазмоз выявляют при пересадке сердца (в 9-13% случаев) [128]. Некоторые авторы утверждают, что вероятность развития токсоплазмоза у таких больных в результате свежего инвазирования от донорского органа больше, нежели от реактивации латентной инвазии, так как проведение лекарственной профилактики у этой группы пациентов является обязательным [78; 116; 128; 154; 160]. Однако различного рода осложнения при трансплантации сердца возникают чаще именно у серопозитивных пациентов с хроническим течением токсоплазмоза, что приводит к гибели реципиента [76].
Несколько реже токсоплазмоз встречается при пересадке печени. При выборе препаратов для лечения и профилактики инвазии необходимо учитывать гепатотоксичность некоторых их них, например, бисептола.
Токсоплазмоз при пересадке почки встречается достаточно редко: клинически выраженное заболевание наблюдалось не более чем у 1,5-2% реципиентов [200, 209], однако асимптоматичное течение, выражающееся в росте уровня IgG к T.gondii, отмечено примерно у 10-14% пациентов [209]. Сложность лечения и профилактики токсоплазмоза у этих больных может быть связана с тем, что выведение лекарственных препаратов, в том числе и сульфаниламидов, осуществляется через почки. В работе Guitard et al описан случай, когда на фоне антитоксоплазменной терапии у реципиента почки развилась острая почечная недостаточность, вызванная образованием камней, содержащих N-ацетилсульфадиазиновые кристаллы [126].
Развитие токсоплазмоза у реципиентов костного мозга наблюдается в 0,3-5% случаев. Для этой группы реципиентов вероятнее реактивация латентного токсоплазмоза, хотя случаи острого приобретенного токсоплазмоза от донора также были зарегистрированы [162]. Сложность лечения этих больных заключается в миелотоксичности фансидара и невозможности приема препарата в раннем посттрансплантационном периоде [162].
Даже при своевременной диагностике токсоплазмоза и проведении этиотропной терапии, выздоровление наступает лишь в 60% случаев [128; 162], а поражение глаз (хориоретинит) часто заканчивается снижением зрения или слепотой [95; 209]. В связи с этим, важным является не только диагностика, но и профилактика токсоплазмоза при пересадке органов [78]. Одним из важных этапов профилактики является обследование реципиентов и их доноров на наличие IgG к T.gondii перед трансплантацией. Эти исследования необходимы для выявления риска заболевания: серопозитивность реципиента следует рассматривать как угрозу реактивации, а серонегативность реципиента при наличии IgG к T.gondii у донора говорит о возможности развития острого приобретенного токсоплазмоза [128; 160; 209]. Следующим этапом является лекарственная профилактика для реципиентов с риском развития токсоплазмоза. Срок лекарственной профилактики, по мнению некоторых авторов, должен достигать 8 месяцев [78].
В настоящее время в структуре СПИД-ассоциированных заболеваний у больных ВИЧ-инфекцией во всем мире токсоплазмоз занимает одно из ведущих мест, как по заболеваемости, так и по смертности. В большинстве стран мира токсоплазмозу отводиться 4-5 место после ЦМВИ, туберкулеза, пневмоцистной пневмонии и криптококкоза. К ним можно отнести Францию, Мексику, страны Южной Азии [87; 165; 172]. Однако в ряде стран, например в Бразилии, токсоплазмоз занимает первое место в структуре СПИД-ассоциированных заболеваний, что является отражением географических и социально-экономических факторов этого региона [91]. Токсоплазмоз также является одной из самых распространенных причин инфекционных заболеваний ЦНС у больных СПИДом во многих странах мира, особенно развивающихся, таких как Бразилия, Мексика, Индия, страны Южной Азии [112; 123; 148; 172; 174; 193], уступая лишь в ряде стран криптококкозу и туберкулезу [191]. Однако, несмотря на общую тенденцию, данные статистики для этих стран сильно разняться, так по данным Fragoso Y.D. et al. токсоплазмоз является причиной поражений ЦНС в 68% случаев [112], а по данным Lanjewar D.N. et al. лишь в 13% случаев [148]. Среди представителей простейших, вызывающих поражения у больных ВИЧ-инфекцией, токсоплазма также занимает одно из первых мест [87; 123], уступая лишь возбудителю криптоспоридиоза на эндемичных территориях [172].
Практически во всех случаях развитие клинических форм токсоплазмоза у больных ВИЧ-инфекцией связано с реактивацией латентной инвазии на фоне выраженного снижения иммунитета. Чаще реактивация токсоплазмоза происходит при уровне CD4-лимфоцитов менее 0,1109/л [22; 23; 48; 174; 207]. Поэтому своевременное применение высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) служит профилактикой развития заболевания у этих больных. Однако реактивация токсоплазмоза возможна и при более высоком уровне CD4-лимфоцитов (более 0,2109/л), и на фоне приема ВААРТ [22; 50; 173].
Паразитологические методы исследования
Для экспериментального заражения мышей использовали суспензию из фрагментов мозга умерших больных/мышей, содержащих цисты T.gondii. Для этого к растертым в ступке фрагментам мозга, размешивая, добавляли стерильный изотонический раствор хлорида натрия до получения однородной массы и антибиотик из расчета 1000 ЕД пенициллина на 1 мл взвеси (для подавления развития посторонней микрофлоры) [25].
Для обнаружения цист T.gondii были приготовлены мазки из различных тканей и органов мышей (внутрибрюшинный экссудат и мозг – равномерное распределение капли/суспензии; печень, селезенка и почки – мазки-отпечатки), а также препаратов мозга людей. Мазки окрашивали по Романовскому-Гимзе. Для этого их высушивали и фиксировали ацетоном, далее мазки окрашивали 20-25 минут при комнатной температуре. После этого мазки промывали в проточной воде и сушили на воздухе. Мазки просматривали через масляную иммерсию с объективом 100 и увеличением окуляра 10 на микроскопе Olympus (Япония). На фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе препаратах цитоплазма токсоплазм голубовато-серого цвета, а расположенное ближе к заднему краю ядро – красно-фиолетового. Цисты имеют вид округлых крупнозернистых образований за счет преимущественной окраски ядер паразита [24].
Для более детального изучения головного мозга мыши на наличие цист просматривали его гистологические срезы. Для приготовления гистологических срезов головной мозг фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Далее его дегидратировали в спиртах восходящей концентрации и ксилоле, заливали в парафиновые блоки и готовили срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ гистологических препаратов проводили с помощью микроскопа Axiostar PLUS (Carl Zeiss, Германия) с набором объективов 40, 100 и увеличением окуляра 10.
Для определения антител классов IgG, IgM и IgA к T,gondii у людей и авидности специфических антител класса IgG использовали лицензированные наборы реагентов. Постановку реакций проводили в строгом соответствии с инструкциями.
Тест-систему «ТоксоФлюоСкрин» (ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», Москва) использовали для выявления антител класса IgG к антигенам T.gondii в сыворотке крови и пробах СМЖ (основана на РНИФ). Для реакции использовали разведения исследуемых и контрольных сывороток (К+ и К-), а также проб СМЖ, 1:16, 1:32 и 1:64, при необходимости 1:128, 1:256, 1:512 и т.д. Результаты учитывались с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И1 (объектив 60, окуляр 7). Порядок расположения фильтров в микроскопе для водной иммерсии (от лампы): БС-8-3, СЗС-24-4, ФС-1-4 и запирающий ЖС-18+19 №1. Оценку результатов проводили в соответствии с требованиями инструкции: титром сыворотки считается разведение, при котором наблюдается слабое, но явное зеленое свечение периферии клетки не менее 50% токсоплазм в поле зрения, причем оболочка клетки должна светиться полностью.
Тест-систему «ТоксоплаСтрип М» (ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», Москва) использовали для выявления антител класса IgM против T.gondii в сыворотках крови и пробах СМЖ. Тест-система аналогична «ТоксоплаСтрип». Для определения антител класса IgM исследуемые и контрольные сыворотки (К+ и К-), а также пробы СМЖ, использовались в разведение 1:400. Положительный результат превышал (1).
Набор реагентов «ВектоТоксо-IgA» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) использовали для иммуноферментного выявления антител класса IgA к T.gondii в сыворотке крови. Метод определения основан на двухстадийном твердофазном ИФА с применением антигена T.gondii и моноклональных антител против антител класса IgA человека, меченных пероксидазой хрена. Рабочим разведением сывороток было 1:100; контрольные образцы (К-, К+слаб. и К+) не требовали дополнительного разведения. Учет результатов проводился при длине волны 450 нм и длине волны сравнения 630 нм с использованием фотометра MPR-2100.
Набор реагентов «ВектоТоксо-IgG-авидность» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) использовали для определения индекса авидности (ИА) иммуноглобулинов класса IgG к T.gondii в сыворотке крови. Метод определения основан на трехстадийном твердофазном ИФА с применением антигена T.gondii, белок-диссоциирующего агента и моноклональных антител против антител класса IgG человека с пероксидазой хрена. Рабочим разведением сывороток было 1:100; контрольные образцы (КО1, КО2 и К+ВА, К+НА) не требовали дополнительного разведения. Учет результатов проводился при длине волны 450 нм и длине волны сравнения 630 нм с использованием фотометра MPR-2100. ИА вычислялся только для положительных образцов и рассчитывался как отношение ОП, полученной в лунках в присутствии диссоциирующего агента, к ОП, полученной при анализе без диссоциирующего агента и выражается в %.
Для определения антител классов IgG и IgA к T.gondii, а также изотипов IgG1 и IgG2 к T.gondii у мышей использовали реакцию ИФА, за основу которой была взята тест-система «ТоксоплаСтрип» (ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», Москва). Для определения антител у мышей использовалось разведение исследуемых и контрольных (К+ и К-) сывороток 1:100. В качестве конъюгата использовали меченые пероксидазой суммарные антитела к IgG мыши производства «Медгамал» (Россия), результаты выявляли 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидином (ТМБ) с перекисью водорода. Для определения антител класса IgA и изотипов IgG1, IgG2 к T.gondii использовали меченые фосфатазой моноклональные антитела («Caltag», США). Результат проявляли бромохлороиндолилфосфат (нитротетразол голубой в диметилформамиде; консервант – 0,01% метилизотиазолон) 0,1% хлорацетамидом в течение 30 мин. Учет результатов проводили при длине волны 450 нм с длиной сравнения 630 нм на фотометре MPR-2100.
Идентификацию ДНК T.gondii в образцах клинического материала проводили методом ПЦР с гибридизационно–флуоресцентной детекцией при помощи набора реагентов «АмплиСенс Toxoplasma gondii – FL» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва). Диагностическая мишень: неструктурный ген размером 529 п.о., повторяющийся в геноме T.gondii от 200 до 300 раз, функция которого неизвестна [137]. Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия) в соответствии с инструкцией производителя.
Для определения ДНК T.gondii в материале от мышей использовали комплект реагентов для выделения ДНК «ДНК-ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ «Литех», Россия) и комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК для последующей детекции методом гель-электрофореза (формат «Форез») производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия). Выделение ДНК и ПЦР-амплификация проводились в соответствии с инструкциями. В реакционную смесь добавляли по 5 мкл выделенного из образца препарата ДНК. Для ПЦР-амплификации использовался многоканальный амплификатор «Терцик» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) в режиме «Точный». Результаты анализировались методом горизонтального гель-электрофореза. Продукт амплификации виден в ультрафиолетовом свете при длине волн 254 нм или 310 нм в виде светящейся полосы ДНК красно-оранжевого цвета на уровне положительного контрольного образца (и еще одна полоса ДНК внутреннего контроля).
Распространение активных форм токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией
Как известно, показатель заболеваемости населения токсоплазмозом сильно отличается от показателя распространения инвазии. Так у 80-90% инвазированных людей токсоплазменная инвазия протекает латентно [27; 184]. Длительное (пожизненное) носительство, как правило, сопровождается определением низкого (порогового) уровня IgG к T.gondii в сыворотке крови. Поэтому проведения только оценки наличия/отсутствия IgG к T.gondii в сыворотке крови недостаточно для выявления заболевания. Оценка уровня IgG к T.gondii в сыворотке крови позволяет выявить период недавнего заражения или клинически выраженных форм болезни. Более высокий уровень специфических антител в сыворотке крови определяется в период активного размножения токсоплазм в организме и указывает на наличие патологического процесса. В связи с этим, следующим этапом работы было установление диагностического уровня специфических антител и выявление среди обследуемых групп (население Москвы и Московской области и пациенты с ВИЧ-инфекцией) диагностического уровня IgG к T.gondii.
Возможность использовать определение уровня специфических IgG для разграничения острой инвазии и латентной была проанализирована на группе доноров – условно здоровом населении. Для этого были проанализированы образцы сывороток крови от 351 донора, предоставленные ГНЦ РАМН.
Среди обследованных доноров IgG к T.gondii были выявлены у 133 человек из 351, что составило 37,9±2,6%. Полученный процент инвазированности T.gondii в группе доноров больше по сравнению со средним показателем в популяции – 28,95±1,37%, что связано с различиями возрастного состава исследуемых групп. Оценка уровня специфических антител выявила следующую картину. Уровень специфических IgG, соответствующий 1:64 в РНИФ и 1:6400 в ИФА, наблюдался только у 1 человека, что составило менее 1% инвазированных доноров. Число лиц с уровнем IgG к T.gondii, соответствующий 1:32 и выше в РНИФ и 1:3200 и выше в ИФА, составило 9 человек – 6,8% инвазированных доноров. Количество лиц с уровнем специфических IgG 1:32 и выше в РНИФ и 1:1600 и выше в ИФА составило уже 34 человека, что соответствует 25,6% инвазированных доноров. Так как диагностический уровень IgG к T.gondii не должен выявляться у здоровых людей, то уровень антител, соответствующий 1:32 в РНИФ и 1:1600-1:3200 в ИФА, не может рассматриваться в качестве диагностического. Таким образом, за диагностический уровень IgG к T.gondii, который с большой долей вероятности может свидетельствовать об активности патологического процесса, был принят уровень, соответствующий титру 1:64 и выше в РНИФ и 1:6400 и выше в ИФА, который практически не наблюдался у здоровых людей.
На основании принятого разделения на диагностические (высокие) и недиагностические (низкие) уровни антител были проанализированы обе исследуемые группы – жители Москвы и Московской области и пациенты с ВИЧ-инфекцией, проживающие на данной территории.
Важным показателем недавнего заражения, а также активности инвазивного процесса, используемым в практической медицине, является определение IgM к T.gondii. Так как IgM к T.gondii определяются лишь в период активности токсоплазменной инвазии и, как правило, исчезают в течение нескольких месяцев, то используется только определение наличия/отсутствия IgM к T.gondii.
Среди обследованных нами 1095 человек, IgM к T.gondii определялись только в 6 случаях (0,55±0,22% случаев). Из них в 2 случаях специфические IgM определялись наряду с высоким уровнем IgG к T.gondii. В 4 случаях определялись только IgM к T.gondii. Все 6 случаев определения специфических IgM наблюдались у лиц до 20 лет (из них четверо – дети в возрасте до 10 лет). Это еще раз подтверждает, что больший процент заражений T.gondii приходится на детский и юношеский возраст.
Результаты данного исследования, представленные на рисунке 3, не противоречат ранее описанным закономерностям распространения токсоплазменной инвазии среди людей [24; 27; 184]. Важно отметить, что с учетом принятого разделения на высокие и низкие уровни IgG, активность инвазивного процесса наблюдалась только у 10% населения.
Следующий этап работы – сравнение результатов исследования по выявлению высокого уровня IgG к T.gondii у населения Москвы и Московской области и пациентов с ВИЧ-инфекцией, проживающих на данной территории. Так как среди пациентов с ВИЧ-инфекцией не было лиц моложе 20 лет, то в качестве среднего показателя активности патологического процесса в популяции использовался средний показатель для групп 20 – 29 лет, 30 – 39 лет, 40 – 49 лет и 50 лет и старше, который составил 5,7±1,54% (Таб. 4). Результаты сравнения представлены на рисунке 4 и в таблице 6.
Стоит отметить, что IgM к T.gondii у пациентов с ВИЧ-инфекцией чаще выявляются в возрастных группах, где и показатель инвазированности значительно превышает уровень инвазированности населения Москвы и Московской области (Таб. 3 и Рис. 2): 20 – 29 лет и 30 – 39 лет. Это подтверждает, что группа пациентов с ВИЧ-инфекцией действительно может быть отнесена к группе риска в отношении заражения токсоплазмами.
Из представленных в таблице 7 данных видно, что IgM к T.gondii определяются как у пациентов без специфических IgG (4,05±1,06%), свидетельствуя о недавнем заражении, так и у пациентов с IgG к T.gondii. При этом наиболее часто IgM к T.gondii наблюдаются на фоне высокого уровня специфических IgG – 6,6±2,41%, подтверждая активность патологического процесса. Выявление в 4,46±1,38% случаев IgM к T.gondii на фоне низкого уровня специфических IgG может говорить о недавно перенесенной инвазии или начале реактивации, а также об описанном в научной литературе отсутствии увеличения уровня антител при развитии заболевания у пациентов с ВИЧ-инфекцией, и требует дальнейшего изучения.
Следовательно, учитывая широкое распространение токсоплазменной инвазии среди пациентов с ВИЧ-инфекцией и возможность реактивации латентно протекающей инвазии, почти 50% пациентов с ВИЧ-инфекцией, проживающих в Москве и Московской области, могут быть отнесены к группе риска в отношении реактивации и развития заболевания.
