Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 5
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: 7
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 7
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ 8
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 9
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
2.1. ИНДУКЦИЯ СИНТЕЗА IGE ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ 11
2.1.1. Механизм перестройки генов иммуноглобулинов на синтез IgE 12
2.1.2. Механизмы регуляции синтеза IgE in situ 16
2.1.3. Участие регуляторних Т—клеток в механизмах переключения изотипов 18
2.2. АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ 20
2.2.1. Роль ИЛ-13 в регуляции эозинофилъного воспаления 21
2.2.2. Роль ИЛ-13 в развитии субэпителиального фиброза 22
2.2.3. Роль ИЛ-13 в регуляции гиперпродукции слизи 22
2.2.4. Роль ИЛ-13 в развитии гиперреактивности бронхов 23
2.3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ 26
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
3.1. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ 33
3.2. РЕАГЕНТЫ и ТЕСТ-СИСТЕМЫ 34
3.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.3.1. Выделение ДНК. 35
3.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 36
3.3.3. Определение полиморфизма методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) 37
3.3.4. Определение полиморфизма масс-спектрометрическим методом 38
3.3.5. Твёрдофазый иммуноферментный анализ. (ELISA) 41
3.3.6. Оценка интерферонового статуса 41
3.3.7. Статистические методы 41
ГЛАВА 4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
4.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУПП БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ НА ОСНОВАНИИ КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 43
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ИЛ-13 и ИЛ-4ЯА
4.2.1. Ассоциация исследуемых SNP с заболеваемостью атопической бронхиальной астмой 52
4.2.2. Ассоциация генетического полиморфизма ИЛ-13 и ИЛ4Яа с повышенным содержанием общего IgE 58
4.2.3. Ассоциация генетического полиморфизма ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 64
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 67
ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ 81
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: 83
Введение к работе
Атопическая бронхиальная астма является хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, в основе которого лежит атопия с увеличенным уровнем общего IgE. Это хроническое воспаление ведет к развитию гиперчувствительности дыхательных путей в ответ на различные стимулирующие факторы и сопровождается повторяющимися симптомами обратимой бронхиальной обструкции. Современные представления о генетической предрасположенности предполагают, что для развития клинической формы этого заболевания требуется наличие в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся под действием факторов внешней среды патологическим фенотипом.
Сложность схемы наследования не позволяет точно установить гены, ответственные за развитие данной патологии, и исследования в этой области продолжаются, нося, в основном, накопительный характер. В этой связи интересной выглядит концепция исследования однонуклеотидных замен, известных также как SNP.. SNP - single nucleotide polymorphisms, - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей в соответствующих генах и их сочетания в генотипе индивида являются предрасполагающими к различным заболеваниям, в т. ч. и к астме.
Число генов-кандидатов предрасположенности к бронхиальной астме достаточно велико, однако, исходя из характерных особенностей развития этого заболевания, интересными для исследования являются гены, ответственные за индукцию синтеза IgE - одного из основных иммунологических маркеров данного заболевания. К таким генам относятся гены интерлейкинов (ИЛ) и их рецепторов.
Известно, что центральным цитокином аллергического ответа является ИЛ-4, активирующий транскрипцию генного локуса тяжелой цепи типа є иммуноглобулинов, тем самым, индуцируя переключение изотипов с М на Е в В-клетках. ИЛ-13 - другой, синтезируемый Т-клетками цитокин, который как и ИЛ-4 активирует В-клетки к продукции IgE, независимо от ИЛ-4 [105]. Многочисленные исследования показали, что ИЛ-13 является ключевым цитокином в инициировании астмы у экспериментальных животных [19, 51].
Действие ИЛ-13, осуществляется посредством взаимодействия со своим рецептором на поверхности клеток. Рецептор ИЛ-13 представляет гетеродимерный комплекс, состоящий из а-цепи, общей с рецептором к ИЛ-4 (ИЛ4Ыа) и самостоятельной цепью ИЛІЗКаї. При этом ИЛІЗЯаІ является связывающей, в то время как ИЛ4Яа осуществляет трансдукцию сигнала внутрь клетки [11, 74, 144]. Полиморфизм генов ИЛ-13 и KJI-4Rcc определяет разнообразие фенотипических проявлений функций ИЛ-13 и ассоциирован с атопией и астмой.
Так, первые аллельные варианты были определены в промоторном участке гена ИЛ-13 - С-1055Т [96]. Позднее открыты новые полиморфизмы — два в интронах (G+543C в первом интроне и Т+1922С в третьем) и два в кодирующей части гена (A+2043G и А+2579С в транслируемом и З -нетранслируемом регионе, соотв., четвертого экзона) [11]. Найдена ассоциация генотипа Т/Т в участке --1055 от старт-кодона гена ИЛ-13 и увеличенной продукцией этого цитокина [134]. В японской и европейских популяциях была выявлена ассоциация полиморфизма A+2043G (Argl30Gln - замена 130 аминокислоты ИЛ-13) с атопической астмой и увеличенным уровнем сывороточного IgE [49,50].
Цитоплазматический вариант замены аминокислоты аргинина на глутамин в положении 551(Gln576Arg), обусловленный полиморфизмом +1902 в гене ИЛ4Яа, был обнаружен при изучении индивидуумов с экземой и гипер-IgE синдромом в популяции британцев [90]. В противоположность этому - низкий уровень IgE, ассоциированный с Arg576Gln заменой был обнаружен в популяции немцев [78]. Другой полиморфизм G+398A (аминокислотная замена Ile50Val) в гене HJI4Ra, единственный найденный экстрацеллюлярный вариант рецептора у человека, ассоциирован с бронхиальной астмой, повышенным уровнем общего IgE и IgE-антител к аллергенам клеща домашней пыли [91].
Цель исследования:
Исследовать полиморфизм генов ИЛ-13 (С-1055Т и Argl30Gln) и a-цепи его рецептора KJI4Ra (Ile50Val и Gln576Arg) у больных атопической бронхиальной астмой, выявить их ассоциацию с заболеванием и такими иммунологическими маркерами, как IgE и ИЛ-13.
Задачи исследования:
1. Сформировать группы больных бронхиальной астмой различной степени тяжести, группы здоровых и пациентов с аллергическим ринитом. 2. Определить в сыворотках исследуемых групп содержание общего IgE, ИЛ-13, ИЛ-4, ИЛ-10 и ИНФу.
3. Провести типирование по гену ИЛ-13 относительно замены С на Т в положении -1055 промоторной области и G на А в +2044 положении кодирующей области гена.
4. Провести типирование по гену ИЛ4Яа относительно замен А на G в положениях +398 и +1902 в кодирующей области.
5. Провести анализ связи выявленных полиморфизмов с заболеванием бронхиальной астмой и показателями IgE и ИЛ-13.
Научная новизна и практическая значимость.
Впервые на территории РФ среди жителей г. Москвы проведено исследование генетического полиморфизма, ИЛ-13 и ИЛ4Яа по некоторым однонуклеотидным заменам, а также проанализированы его ассоциации с заболеванием атопической бронхиальной астмой и повышенным содержанием общего IgE.
Показано, что частота встречаемости аллелей в группе больных астмой, характеризующихся сниженными показателями ИФН-а,-у, ИЛ-10 и ИЛ-13 на фоне повышенного содержания ИЛ-4, общего и специфических IgE, не отличается от таковых частот в группе здоровых лиц. Отмечено отсутствие ассоциации отдельных замен (С-1055Т, Argl30Gln, Gln576Arg, Ile50Val) с заболеваемостью и повышенным содержанием общего IgE в исследуемых группах.
Выявлена ассоциация промоторного полиморфизма гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных астмой в сравнении со здоровой группой. Получены данные об ассоциации полиморфных замен С-1055Т и Argl30Gln ИЛ-13 с заболеванием бронхиальной астмой и повышенным содержанием общего IgE. Для изученных вариантов ИЛ4Яа выявлено отсутствие ассоциации комбинации Ile50Val и Gln576Arg с заболеваемостью астмой и повышенным содержанием общего IgE.
Полученные сведения дают информацию как о роли отдельных генов в развитии атопической бронхиальной астмы и содержании общего IgE, так и о гетерогенности данной группы. Кроме того, данные об отсутствии ассоциации отдельных полиморфных замен с заболеванием и повышенным содержанием общего IgE указывают на актуальность дальнейшего анализа комбинаций генотипов различных исследуемых полиморфизмов.
Изучение полиморфных вариантов генов ключевых цитокинов будет способствовать выяснению роли генетической составляющей в развитии данного заболевания и могут быть учтены в создании системы ранней диагностики аллергических и других мультифакторных заболеваний.
Положения, выносимые на защиту:
1. При исследовании генетического полиморфизма в промоторной и кодирующей областях ИЛ-13 у больных атопической бронхиальной астмой выявлена ассоциация комбинации С-1055Т и Argl30Gln с заболеванием и повышенным содержанием общего IgE, тогда как эти отдельные однонуклеотидные замены не связаны с этими признаками. При этом установлена ассоциация промоторного полиморфизма С-1055Т гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных астмой в сравнении со здоровыми лицами.
2. При определении кодирующих полиморфных вариантов гена ИЛ4Яа не выявлено ассоциации отдельных замен (Ile50Val и Gln576Arg) и их комбинаций с заболеваемостью атопической БА и повышенным содержанием общего IgE.
