Содержание к диссертации
Список используемых сокращений . 2
Введение . 6
Глава 1. Обзор литературы . 10
1.1. Иммунологические аспекты патогенеза апластической анемии . . 10
1.2. Лечение апластической анемии (АА) - механизмы действия и эффективность препаратов, составляющих программу терапии больных АА . 25
1.3. Дендритные клетки . 35
Глава 2. Материалы и методы исследования . 48
2.1. Характеристика больных, включенных в исследование . . 48
2.2. Методы 53
2.3. Статистический анализ . 62
2.4. Основные понятия . 63
Глава 3. Функциональные особенности дендритных клеток, культивированных из моноцитов периферической крови больных апластической анемией до лечения и на фоне неэффективной иммуносупрессивной терапии 66
3.1. Иммунофенотипическая характеристика дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА . 68
3.2. Секреция интерлейкина-12 дендритными клетками, полученными в результате культивирования моноцитов периферической крови больных АА в дебюте заболевания и у больных рефрактерной формой АА . 74
3.3. Секреция интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными в результате культивирования и активации липополисахаридом моноцитов периферической крови больных АА в дебюте заболевания и больных АА рефрактерной формой заболевания . 82
3.4. Секреция интерлейкина-10 неактивированными лимфоцитами и лимфоцитами после стимуляции фитогемаглютинином у больных АА до программной иммуносупрессивной терапии и у больных рефрактерной АА . . . 88
Глава 4. Функциональные особенности дендритных клеток, культивированных из моноцитов периферической крови больных апластической анемией на фоне программной иммуносупрессивной терапии 91
4.1. Секреция интерлейкина-12 дендритными клетками, полученными в результате культивирования моноцитов периферической крови больных АА на фоне программной иммуносупрессивной терапии. . . . . . 91
4.2. Секреция интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными в результате культивирования моноцитов периферической крови больных АА на фоне программной иммуносупрессивной терапии. . . . . . 101
4.3. Сопоставление показателей секреции ИЛ-10 и ИЛ-12 дендритными клетками, полученными in vitro х из моноцитов периферической крови больных апластической анемией на фоне программной иммуносупрессивной терапии . 111
4.4. Секреция интерлейкина-10 лимфоцитами без стимуляции и после стимуляции фитогемаглютинином у больных апластической анемией на фоне программной иммуносупрессивной терапии. . . . . . 115
Глава 5. Секреция интерлейкина-12 и интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными в результате культивирования мононуклеаров периферической крови больных апластической анемией на поздних этапах программной иммуносупрессивной терапии . . 118
Глава 6. Секреция интерлейкина-12 и интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов периферической крови больных АА после достижения полной ремиссии и отмены иммуносупрессивной терапии . 126
Глава 7. Зависимость достижения клиническиого ответа на иммуносупрессивное лечение от уровня продукции иммунорегуляторных цитокинов дендритными клетками, полученными из моноцитов больных апластической анемией 130
Заключение ... 138
Выводы . 148
Список литературы . . 150
Введение к работе
Актуальность проблемы
Результаты программной иммуносупрессивной терапии (ИСТ) при апластическои анемии (АА), особенно, при рефрактерной форме заболевания требуют улучшения. Общепринятая, устаревшая, классификация апластическои анемии, характеризует состояние гемопоэтической системы в момент установки диагноза, но не отражает глубину нарушений механизмов иммунорегуляции, приводящих к аплазии кроветворения. Следовательно, существующая классификация не позволяет выявить благоприятные или неблагоприятные факторы риска у больных апластическои анемией при манифестации заболевания и разработать дифференцированный подход к иммуносупрессивному лечению конкретных больных с целью достижения оптимального ответа на терапию. Остаются неизученными вопросы, касающиеся необходимого объема и длительности иммуносупрессии в зависимости от выраженности иммунологических нарушений.
Mathe и соавт. 30 лет тому назад высказали предположение иммунологического механизма развития апластическои анемии. Одним из подтверждений этой гипотезы является доказанная эффективность иммуносупрессивной терапии при АА. Кроме того, результаты изучения гипервариабельных регионов Т-клеточных рецепторов показали олигоклональность Т-клеточного ответа. В настоящее время считается доказанным, что у больных апластическои анемией имеет место повышение соотношения активированных CD4+ Т-хелперов I и II типа (Thl/Th2), гиперпродукция миелосупрессивных цитокинов (интерферона-у, фактора некроза опухоли-а) периферическими мононуклеарными клетками, а также дефицит иммунорегуляторных цитокинов, подавляющих продукцию миелосупрессивных цитокинов активированными Т хелперами и Т-цитотоксическими клетками I типа.
Однако, механизмы, определяющие развитие иммунной агрессии, приводящей к развитию апластическои анемии, а именно, роль антигенпрезентирующих клеток остаются неизученными.
Антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки способны путем продукции иммуномодуляторных цитокинов - интерлейкина-10 и интерлейкина-12, определить направленность иммунного ответа. Показано, что именно дендритные клетки способствуют активации HLA-DR2 специфической Т клеточной популяции при апластической анемии. Однако, работы по функциональной характеристике АПК при АА не проводились.
В связи с вышесказанным, изучение функциональных способностей (иммунофенотипических и секреторных особенностей) Антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов больных апластической анемией при манифестации заболевания, на разных этапах ИСТ и в период ремиссии, а также выявление факторов риска с целью разработки дифференцированного подхода к лечению и оптимизации программной иммуносупрессивнои терапии представляет большой интерес.
Данные нерешенные вопросы послужили поводом для проведения настоящего исследования.
Цель исследования:
Изучить иммунофенотипические особенности, а также интерлейкин-10 и интерлейкин-12 продуцирующие способности дендритных клеток больных апластической анемией и определить прогностическую значимость функциональных свойств антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов при апластической анемии.
Задачи исследования:
1. Изучить иммунофенотипические особенности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА до начала иммуносупрессивнои терапии.
2. Оценить способность культивированных дендритных клеток к продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12.
3. Оценить способность активированных лимфоцитов больных апластической анемией к секреции интерлейкина-10.
4. Определить прогностическую значимость уровня продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12 в культурах дендритных клеток больных апластической анемией.
5. Разработать практические рекомендации по анализу функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro (частота проведения исследования, особенности культивирования дендритных клеток).
Научная новизна
В процессе исследования антигенпрезентирующих клеток, полученных из периферической крови больных АА впервые:
• Получены дендритные клетки в in vitro условиях из моноцитов периферической крови больных апластической анемией.
• Изучена экспрессия костимуляторных молекул (CD40, CD80, CD86) и специфического маркера (CD83) зрелых ДК на поверхности культивированных дендритных клеток больных АА.
• Изучена способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией к продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12 до начала иммуносупрессивной терапии и на разных этапах лечения.
• Определена прогностическая значимость интерлейкин-10 и интерлейкин-12 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro у больных апластической анемией.
Практическая ценность:
- Отработана методика культивирования дендритных клеток из моноцитов периферической крови больных апластической анемией, позволяющая изучить функциональные особенности культивированных дендритных клеток.
- Определены неблагоприятные факторы риска для больных апластической анемией, позволяющие разработать дифферецированный подход к терапии больных апластической анемией.
- Разработаны практические рекомендации по анализу функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro (время и частота проведения исследования), в зависимости от предшествующего неадекватного лечения или от этапа программной иммуносупрессивной терапии.
Положения, выносимые на защиту:
1. До начала программной иммуносупессивной терапии значительно повышенный уровень продукции ИЛ-12 культивируемыми дендритными клетками выявляется у 70,8% больных апластической анемией, а низкая способность культивированных дендритных клеток к продукции ИЛ-10 отмечается у 61,6% больных апластической анемией.
2. Программная иммуносупрессивная терапия у 66,7% больных апластической анемией способствует снижению уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками, а также повышению продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками у 64,8% больных АА. Изменения функциональных особенностей дендритных клеток на фоне ИСТ коррелируют с клиническими результатами терапии.
3. Выявление высокой ИЛ-12 и низкой ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных апластической анемией до начала адекватного лечения или на ранних этапах терапии является показанием для более интенсивной и длительной (не менее двух лет) иммуносупрессивной терапии.
4. Отсутствие продукции интерлейкина-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных апластической анемией на фоне адекватной иммуносупрессивной терапии ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение.
