Введение к работе
iSS І
--^'-'"''''йиУЦльность проблемы. Пролиферативныя статус опухолевых клеток является комплексной характеристикой злокачественного процесса. Результаты его оценки важны как для классификации и, следовательно, диагностики новообразований любого генеза и локализации, так и для выбора их наиболее рациональной терапии. Классификации гемоОластозов в настоящее время подвергаются значительному пересмотру. Это прежде всего связано с разработкой и применением программной терапии злокачественных заболеваний системы крови, ответ на которую во многом определяется морфологическим типом малигнизирозанных клеток [А.И.Воробьев и М.Д.Бриллиант, 1985; Г.И.Козинец и соавт., 1986].
До недавнего времени способность к нерегулируемому, безграничному делению считалась самым главным свойством опухолевой клетки. Однако изучение могеку-лярных механизмов процессов делания и дифференцировки клеток поставило под сомнение эту концепцию туморогенеза [А.К.Белоусова, 1987]. Оказалось, что клеточный цикл находится под контролем белковых продуктов соответствующих генов (cdc -гены контроля клеточного цикла) и регулируется как на транскрипционном, так и на посттрансляционном уровнях [Lewin, 1990]. Более того, все циклоспецифические морфологические изменения клеток являются следствием взаимодействия белковых транскриптов по принципу "энзим - субстрат". Опухоль может отличаться от нормы появлением специфических опухолевых белков, антигенов злокачественной пролиферации [Hall & Woods, 1990]. Внося существенные изменения в клеточную кинетику, опухолевые белки приводят к возникновению морфологической атипии клеток, которая может быть отражением степени злокачественности опухолевого процесса.
На современном уровне знаний проблема градации опухоли на степени злокачественности остается нерешенной. Von Hansemann первым пришел к выводу (1890), что морфология опухолевых клеток создает представление о их биологии и коррелирует с клиническими проявлениями заболевания [Underwood, 1990]. Как известно, классификации, дифференциальная диагностика и прогнозирование течения гемо-бластозов в первую очередь обоснованы морфо-цитохимическими особенностями лейкозных клеток. Преимущества методов количественной цитологии для их выявления все более очевидны: стандартный подход к исследуемому материалу, объективизация, повышение воспроизводимости получаемых результатов, вывод решающего правила, автоматизация сложных процессов измерения и машинная классификация клеток {Bartels, 1980]. Уже накоплена информация, открывающая принципиально новые возможности решения вопросов теоретической и практической гематологии.
Так, обнадеживающие в плане автоматической классификации властных клеток результаты получены при многомерной оценке данных анализа изображения клеток костного мозга больных рефрактерной анемией и острым лимфобластным лейкозом [Seigneurin et а!.. 1986; Tosi et а!., 1987). Морфометрические характеристики лим-
фоидных клеток в тонких срезах опухоли оказались пригодными для субклассифи-кации неходжкинских лимфом [Crocker, 1984]. Отмечена положительная корреляция цитометрических характеристик лимфоцитов больных хроническим лимфолей-козом с прогностическими факторами течения заболевания [Lanza et а!., 1935].
Без глубокого изучения гемопоэтических клеток нельзя думать о теории, которая с современных позиций могла бы обьяснить строение и функцию клеток нормального гемопоэза или их неоплазироаанных аналогов при различных гемобластозах. Теперь ясно, что морфология клетки по-существу определяется разнообразием структурных (гистоновьк и негистоновых) белков, энзимов, включая ДНК- и РНК-полимеразы, и целый ряд других макромолекулярных соединений [Busch, 1990]. Например, структура, размеры (обьем) и количество ядрышек отражают транскрипцию рибосомных генов, которая зависит от типа ткани, интенсивности клеточного метаболизма, степени клеточной дифференцировки и стадий клеточного цикла [Kamel et ai., 1990]. В этой связи нуклеолярный аппарат клетки с конца прошлого столетия привлекает к себе внимание исследователей.
Ядрышко является функцией рибосомных генов, локализованных в спутничной нити, т.е. в ядрышкообразующих районах (ЯОР), акроцентрических хромосом групп D и G набора клеток человека. Отсюда, акроцентрические хромосомы считаются ядркш-кообразующими. Они формируют новое ядрышко, т.е. участвуют в нуклеологенезе сразу же после выхода клетки из митоза. В последние годы показано, что транс-крипционно активные ЯОР могут быть выявлены при световой микроскопии после обработки препаратов метафазных хромосом или интерфазных клеток 50% раствором нитрата серебра (Ag-ЯОР реакция) [Goodpasture & Bloom, 1975; Howell & Black, 1980; Plotoneta!., 1986].
В природе реакции лежит специфика связывания ионов металла нуклеолярными кислыми негистоновыми белками, по-видимому, принимающими участие в транскрипции и процессинге пре-рибосомной РНК, осуществляющими транспорт прерибо-сомных частиц в цитоплазму и, таким образом, структурирующими ядрышко в интерфазе [Wing et а!., 1980; Lapeyre et al., 1987; Aris & Blobel, 1983; Borer et a!., 1989; Caizergues-Ferrer et al., 1990]. По своей сути реакция является цитохимической. На практике в нормальных интерфазных клетках, например, в Go-лимфоцитах периферической крови, Ag-ЯОР обычно плотно агрегируют внутри одного или двух кольцевидных ядрышек. Их число, как и форма, количество и размеры нуклеол, в стимулированных митогеном in vitro клетках увеличивается только с повышением уровня активности рибосомного хроматина и пролиферации клеток [Wachtler et al., 1990). В метафазе митоза последующих делений при этом отмечается уменьшение частоты сателлитных ассоциаций акроцентрических хромосом, среднего количества ассоциированных хромосом на клетку и среднего количества хромосом в одной ассоциации. In vivo для клеток другого типа, например, этритроидных или гранулоцитарных предшественников, аналогичная картина, по крайней мере для интерфазных ЯОР, имеет место только на ранних стадиях дифференцировки и вызревания [Smetana &
Ukovsky,1986]. Таким образом, в норме такие параметры нуклеологенеза, как количество, размеры и распределение ядрышек и Ag-ЯОР являются отражением активности рибосомного хромаматина.
Как показали предварительные данные, в злокачественных клетках, з том числе гемопоэтических, количество ядрышек достоверно увеличивается, причем зз счет доли (%) гомогенных [Н.Н.Талеленова и И.А.Быкова, 1973; Г.И.Козинец и соавт., І979]. Отмечена положительная корреляция частоты Ag-ЯОР и доли морфологически атипичных клеток [Н.Н.Мамаев и соазт., 1930; 1984; 1935; Kchno et al., 1979; Zankl et зі., 1982; Reeves et al., 19S2; Brasch et al., 1934]. Можно заключить, что, нуклерлогенез в злокачественных клетках существенно изменен. Более того, оказалось, что Ад-ЯСР реакция пригодна для градации степени злокачесттвенности опухоли [Crocker, 1990]. Однако до сих пор вопрос о том, сопровождается ли злокачественная трансформация клеток какой-то общей закономерностью изменений нуклеологенеза остается открытым.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Оценить особенности нуклеологенеза лимфоидных клеток в норме, при лимфосаркомах и остром лимфобластном лейкозе.
1: Разработать критерии количественной оценки, включая компьютерную морфо-метрию, особенностей нуклеологенеза в лимфоидных клетках практически здоровых людей.
2: Дать сравнительную характеристику нуклеологенеза по мере дифференш-ровки гранулоцитарного ростка кроветворения в нормальном костном мозге человека, а также в условиях хронического воздействия циклофосфаном в эксперименте на крысах.
3: Определить информативность нуклеолярных параметров для машинной дискриминации клеток лимфоидной опухоли:
при хроническом лимфолейкозе, лимфоцитоме и гистологических вариантах лимфосарком;
при остром лимфобластном лейкозе;
4: Оценить нуклеолярные параметры властных клеток костного мозга больных острыми лимфобластным и нелимфоцитарными (миелобластном и миеломо-нобластном) лейкозами.
5: Сравнить морфологические показатели нуклеологенеза с параметрами пролиферации злокачественных лимфоидных клеток и оценить их прогностическую значимость.
6: Сформулировать тесоетическую концепцию о нуклеологенезе в злокачественных лимфоидных клетках.
Новизна исследования. Получена комплексная характеристика нуклеологенеза в злокачественных лимфоидных клетках. На основе современных методов количест-
венной цитологии с использованием компьютерной техники расширен набор диф-ференциально-диагностических признаков гемооластозов и сделаны важные дополнения к существующим морфологическим классификациям злокачественных заболеваний системы крови.
Раработан метод объективной регистрации морфологических особенностей нук-леологенеза в клетках крови при нормальном гемопоэзе человека и экспериментальных животных с помощью полуколичественных показателей интерфазной активности ядрышкообразующих районов хромосом и морфометрической оценки площади нуклеол. Подтверждено снижение интерфазной активности рибосомных генов по мере вызревания клеток нормального гемопоэза. Выявлены и охарактеризованы различия нуклеологенеза в лимфоцитах при хроническом лимфолейкозе, в пролим-фоцитах, лимфобластах и иммунооластах периферической крови и срезов лимфои-дной опухоли, в властных клетках при лимфобластном и миелобластном вариантах острого лейкоза. Доказана прямая связь аргентофильности, количества и размеров нуклеол с морфометрически идентифицированным типом злокачественных клеток. На основе многомерного анализа результатов морфометрии злокачественных клеток выбраны комбинации информативных параметров и дискриминантные функции для атоматической классификации мапигнизированных лимфоидных элементов. Модель нуклеологенеза обоснована собственными экспериментальные данными, клиническим материалом и современными представлениями о необычной активации клеточных протоонкогенов при злокачественных заболеваниях крови. Показано, что патология нуклеолярного аппарата клеток играет существенную роль в генезе и прогрессии гемобластозов.
Теоретическое и практическое значение работы Проведенные клинические и экспериментальные исследования расширяют существующие представления о нуклео-логенезе в нормальных и малигнизированных клетках системы крови.
Полученные сведения могут Сыть использованы для решения вопросов патогенеза, классификации и прогнозирования течения гемобластозов.
Реализация результатов исследования. (1) В 1986 г. получено удостоверение на рационализаторское предложение отраслевого значения:
"Использование метода оценки иммунологической реактивности лимфоцитов периферической крови методом импрегнации азотнокислым серебром для прогнозирования рецидивов и формирования хронического бактерионосительства при брюш-но-тифозной инфекции", No. 0-2443.
-
Получена серебряная медаль за экспонат: "Компьютерная морфометрия у больных гемобластозами", ВДНХ, 1988) (Постановление Главного комитета ВДНХ СССР от 25/XI-88 г. No. 958-Н).
-
Глава "Цитогенетическая и кинетическая характеристика лимфоцитов при лимфопролиферативных заболеваниях" в книге: "Иммунологические аспекты лим-фопролиферативных заболеваний" (Под ред.: В.П.Лозового и Г.З.Шубинского), Новосибирск, Иэ-во "Наука", 1987, с. 70-86.
(4) Публикации результатов: 37 работ, из которых 32 в центральной печати РФ и 5 за рубежом.
Положения, выносимые на зашиту. (1) Динамика изменений морфологии нуклео-лярного аппарата специфична и определяется принадлежностью клеток к лимфоид-ному ростку кроветворения, уровнем их дафференцировки и пролиферации.
-
Интерактивная компьютерная морфометрия является объективным методом исследования гетерогенных популяций злокачественных клеток в мазках периферической крови и костного мозга, отпечатках и срезах ткани и пригодна для регистрации особенностей опухолевой трансформации.
-
Характеристики нуклеолярного аппарата с учетом параметров ядра (площадь, индекс формы) могут быть положены в основу дискриминации злокачественных лим-фоидных клеток, выделения преимущественного морфотипа лимфоидной опухоли и градации степени ее злокачественности.
-
Выявленные при лимфоидных гемобластозах особенности нуклеологенеза связаны со степенью злокачественности и прогрессии заболевания, могут быть использованы для прогнозирования их течения.
Апробация работы. Выступления с докладами на научных съездах, конференциях, заседаниях научных обществ, на Всесоюзном совещании "Биофизика рака" (1987), на двух Всесоюзных школах (1987, 1S83), на 3-ей республиканской конференции (1988), на 6-ой научно-практической конференции ЦОЛИУВ (1988), на Ш Всесоюзном сьеэде гематологов и трансфузиологов (1991), на IY Всесоюзном съезде специалистов по клинической лабораторной диагностике (1991), на YII Всесоюзном совещании по проблемам автоматизации анализа изображений микроструктур (1991) и на международных совещаниях: "11th Nuclear Workshop" (Суздаль, 1989); "Applied Cell Biophysics" (Rostock, 1990).
Выступления с лекциями и подготовка специалистов, включая зарубежных, лечебных и научных учреждений гематологического профиля на рабочих местах.
Структура и обьем работы. Работа представлена на 250 стр. машинописного текста, иллюстрирована 45 таблицами и 40 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, 5 глаз изложения и обсуждения результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 70 отечественных и 150 иностранных источников. Диссертация выполнена по плану научно-исследовательских работ ВГНЦ "Разработка системы цитологического мониторинга для прогнозирования заболе-левания и индивидуализации лечения больных гемобластозами (регистрационный No. 01850073917) и входит в научно-техническую программу 0.69.05 "Лейкозы человека и животных".
![Особенности субпопуляции цитокинопродуцирующих клеток (INF\Nc#2+#1 и IL-4#2+#1) при атопической и смешанной формах бронхиальной астмы [Электронный ресурс]](/i/i/4272/204990.png "Особенности субпопуляции цитокинопродуцирующих клеток (INF\Nc#2+#1 и IL-4#2+#1) при атопической и смешанной формах бронхиальной астмы [Электронный ресурс] Удалова Валентина Александровна")