Содержание к диссертации
Список использованных сокращений . 4
Введение 5
'* Глава 1. Современное состояние проблемы введения лейкоцитов в
холодовой анабиоз (обзор литературы) 11
-
Организация лейкоцитных клеток 12
-
Методы получения лейкоцитного концентрата 20
-
Функциональные и морфологические изменения лейкоцитов, вызванные воздействием холодового стресса 21
-
Хладоограждающие растворы для лейкоцитов 31
-
Способы оценки физиологической полноценности
различных клеток до введения в криоанабиоз и после выхода из него 33
Глава 2. Материалы и методы исследований 38
Глава 3. Результаты экспериментальных исследований 45
3.1. Оценка влияния экспоненциальной программы замораживания
до -40С и хладоограждающих растворов на функциональное
состояние лейкоцитов при хранении в течение 24 часов 45
3.2. Зависимость функционального состояния нативных и
размороженных лейкоцитов, перенесших суточный анабиоз
при -40С, от длительности экспозиции (1-24 ч)
с хладоограждающим раствором №2 55
3.3. Влияние длительного (в течение 45 суток при +60С)
хранения оптимального хладоограждающего раствора
на его криозащитные свойства 59
& 3.4. Жизнеспособность и функциональная активность
лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз (-40С)
разной длительности с использованием хладоограждающего
раствора №2 и экспоненциальной программы замораживания 60
* 3.5. Оценка в опытах на животных «острой» и
«хронической» токсичности, пирогенности оптимального хладоограждающего раствора и переносимости аутологичных лейкоцитных концентратов после их
хранения в течение 24 ч при -40С с данным раствором 68
Глава 4. Обсуждение результатов экспериментальных исследований 81
Выводы 91
Список использованной литературы 93
Список опубликованных работ по теме диссертации 115
Список использованных сокращений
АТФ - аденозин трифосфат
АФК - активные формы кислорода
ГМБТОЭМ - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина
ГМФШ — гексозомонофосфатный шунт
ГФ - Государственная Фармакопея
ДМАЦ - диметилацетамид
ДМСО— диметилсульфоксид
ЛД 50 - средняя летальная доза
ЛК - лейкоконцентрат
НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат
НСТ — нитросиний тетразолий
ПП — поливинилпирролидон
ПЭО-400 - полиэтиленоксид с молекулярной массой 400
ФАМ - фагоцитарная активность моноцитов
ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов
ФИ - фагоцитарный индекс
ЭДТА Na2 - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
ЭКГ - электрокардиограмма
Введение к работе
Актуальность исследования. В последние десятилетия большое внимание уделяется изучению проблемы влияния холодового анабиоза на биологические объекты различного уровня организации (Mazur Р., 1970; Цуцаева А.А., 1981; Голдовский A.M., 1986; Сведенцов ЕЛ, 2003). Под анабиозом понимают такое состояние живой системы, когда в ней обратимо приостанавливаются или частично затормаживаются метаболические и физиологические процессы (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994).
Показано (Лозина-Лозинский Л.К., 1972), что животные клетки по- разному реагируют на замораживание. Ядросодержащие клетки со сложной внутренней структурой нуждаются в индивидуальном подборе режима <#! замораживания и оттаивания, что особенно справедливо в отношении лейкоцитов, для которых необходимо учитывать процессы, протекающие при кристаллизации воды, изменения их органелл, а также состав хладоограждающего раствора и режима замораживания. Как известно, , потребность в запасах банка лейкоцитов обусловлена их использованием при лечении сепсиса, разлитого перитонита, инфекционного менингита и других заболеваний (Cairo М. et al, 1992; Мельникова В.Н., 1995; ЖибуртЕ.Б., 2002). Многими авторами (Леонтович В.А. и соавт., 1973, 1975; Аграненко В.А. и соавт., 1982; Утемов СВ. и соавт., 1995; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004) предложены технологии замораживания лейкоцитов для их длительного хранения, однако, несмотря на большое количество работ, посвященных изучению этого вопроса и механизмов криоповреждения и криозащиты лейкоцитов крови человека (Абезгауз Н.Н. и соавт., 1966, 1978; * Zhang Q., Tiersch Т., 1995; Svedentsov Е. et al, 1998; Halle P. et al, 2001;
Сведенцов Е.П, и соавт,, 2000, 2003, 2004), проблема сохранения функциональной активности лейкоцитов далека от окончательного разрешения.
В настоящее время наиболее эффективным приемом поддержания жизнеспособности лейкоцитов является глубокий криоанабиоз (-136С+--196 С), при котором наряду с полным снижением метаболизма и замерзанием всех фракций воды сохраняются орбитальные переходы электронов в атомах биомолекул (Цуцаева А.А., 1983; Сведенцов Е.П. и соавт., 2004). Однако использование этой дорогостоящей и небезопасной для персонала жидкоазотной технологии возможно далеко не во всех лечебных учреждениях. Поэтому встает вопрос о создании более доступного и эффективного метода замораживания лейкоцитов крови человека без использования жидкого азота, в частности при умеренно-низких (-30С-г-50С) температурах, при которых внеклеточная, свободная и частично -* связанная внутриклеточные фракции воды замерзают, а фиксированная фракция остается в незамерзшем состоянии, и в клетке наблюдается замедленный метаболизм (Сведенцов Е.П., 2004). Использование для этих технологий электрических морозильников упрощает и удешевляет процесс ^ криоконсервирования лейкоцитов (Сведенцов Е.П. и соавт., 2003). Однако экспериментальных исследований в отношении сохранности функциональных свойств лейкоцитов при умеренно-низких температурах, в частности при -40С, не проводилось. Их результаты могут представлять интерес и для криофизиологии, изучающей механизмы репарации клеток после холодового стресс-воздействия (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994). Все это послужило основой для постановки цели и задач исследования.
Цель исследования - определить сохранность функционального состояния лейкоцитов после их выхода из холодового анабиоза при —40С, введение в который осуществлялось по экспоненциальной программе замораживания с применением нового хладоограждающего раствора.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительную оценку хладоограждающих свойств трех растворов (№1, №2, №3), компонентами которых являются гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ), фумарат натрия и лимонная кислота, и предназначенных для сохранения жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе и хранившихся в условиях холодового стресс-воздействия (-40 С) в течение 24 часов.
2. Изучить жизнеспособность и морфологический состав лейкоцитов, фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и фагоцитарную активность моноцитов, замор'оженных с использованием оптимального хладоограждающего раствора по экспоненциальной программе и хранившихся в условиях холодового «) стресс-воздействия (-40С) в течение 1-60 суток.
3. Оценить в опытах на животных «острую», «хроническую» токсичность, пирогенность оптимального хладоограждающего раствора и исследовать переносимость аутологичных лейкоцитных концентратов, подвергнутых замораживанию и хранению при -40С в течение 24 ч с данным раствором.
Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании впервые изучена жизнеспособность и функциональная активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при —40С, введение в который осуществлялось по экспоненциальной программе замораживания и с применением нового хладоограждающего раствора (патент №2184449 от 10.07.2002), включающего криопротектор - ГМБТОЭМ (в конечной концентрации - 15%), антигипоксант - фумарат натрия (1,4%) и 4 антикоагулянт - лимонную кислоту (0,03%). Установлено, что использование указанной программы и раствора позволяет сохранить на высоком уровне жизнеспособность и функциональную активность лейкоцитов в течение 30 суток холодового анабиоза при -40С, а также избежать разрушения мембран * клеток и их органелл и денатурации клеточных белков.
Научно-практическая значимость работы. Дано научное обоснование криозащитных свойств предложенного хладоограждающего раствора, ингредиентами которого являются вещества отечественного производства -криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ, антигипоксант биоэнергетической направленности — фумарат натрия и антикоагулянт — лимонная кислота. Данный раствор является нетоксичным, апирогенным, хорошо переносимым, при его внутривенном введении, экспериментальными животными, следовательно, не требует отмывания от биообъекта после его отогрева и может быть рекомендован для криобиологической практики и для научных исследований в лабораториях биологического и медицинского профиля.
Доказано, что наиболее предпочтительной, эффективной и легко выполнимой (по сравнению с линейной принудительной программой) является экспоненциальная программа замораживания лейкоцитов, которая позволяет разным видам ядросодержащих клеток входить в холодовой анабиоз постепенно на разных его уровнях, благодаря чему на термограмме не наблюдается явного выброса кристаллизационного тепла и, следовательно, не происходит процессов рекристаллизации, которые выявлены при замораживании лейкоцитов в условиях использования линейной программы (Леонтович В.А и соавт., 1973, 1975; Махатадзе И.К. и соавт., 1975).
Благодаря применению вышеуказанной композиции хладоограждающего раствора и экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов крови человека до —40 С их жизнеспособность и функциональная активность сохраняются на высоком уровне в течение длительного времени (30 суток). Эти данные расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты на клеточном уровне.
На основе полученных положительных результатов о сохранении функциональных свойств лейкоцитов крови человека, перенесших холодовое стресс-воздействие (-40 С), предложен эффективный, доступный и надежный в методическом плане метод криоконсервирования данных клеток, включающий в себя применение хладоограждающего раствора, медленной экспоненциальной программы замораживания и быстрого отогрева. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Оптимальный хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ, фумарат натрия и лимонную кислоту, являясь нетоксичным, апирогенным, хорошо переносимым экспериментальными животными и не требующим отмывания от биообъекта после его оттаивания, позволяет сохранить функциональные свойства лейкоцитов, хранившихся в условиях холодового стресс-воздействия при -40С в * течение 30 суток.
2. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз до -40еС дает возможность получить высокий процент выхода жизнеспособных и функционально активных лейкоцитов после а перенесения ими холодового стресс-воздействия в течение 30 суток при данной температуре,
3. Лейкоциты человека обладают высокими репаративными возможностями, что позволяет им проявлять функциональную активность после холодового стресс-воздействия (-40С, в течение 30 суток).
Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003), заседании Кировского отделения физиологического общества имени И.П. Павлова (Киров, 2004), научной сессии Кировского филиала Российской Академии Естествознания (Киров, 2004), международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004), заседании Ученого совета ' Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004), заседании
Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2005).
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 3 - в центральных журналах.
Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных свойств и морфологического состава нативных и размороженных лейкоцитов, проведена их статистическая обработка. Автор принимал участие в разработке метода введения лейкоцитов в холодовои анабиоз при -40 С, в проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты экспериментальных исследований, обсуждение результатов экспериментальных исследований), выводов, списка использованной литературы (218 источников, из них 121 отечественный и 97 иностранных) и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Диссертация содержит 22 таблицы, 13 рисунков.
