Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Современное состояние вопроса о холодовом анабиозе лейкоцитов при температуре -80С
1.1. Особенности строения лейкоцитов 10
1.2. Лейкоциты как трансфузионная среда 15
1.3 . Теории криоповреждения и методы защиты клеток 19
1.4. Опыт криоконсервации лейкоцитов 30
Глава II. Материалы и методы исследований 34
Глава III. Результаты экспериментальных исследований
3.1. Разработка метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -80С 42
3.2. Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека до введения в холодовой анабиоз (-80С) и через разные сроки после выхода из него 49
3.3. Изучение биологических особенностей разработанного оптимального хладоограждающего раствора для лейкоцитов 55
3.3.1. Изучение «острой токсичности» хладоограждающего раствора 55
3.3.2. Изучение «хронической токсичности» разработанного хладоограждающего раствора 56
3.3.3. Изучение пирогенности хладоограждающего раствора 59
3.3.4. Изучение переносимости трансфузий концентрата лейкоцитов, замороженных с разработанным оптимальным хладоограждающим раствором 60
3.4. Влияние длительного хранения оптимального хладоограждающего раствора на его криозащитные свойства 62
Глава IV. Обсуждение результатов экспериментальных исследований 63
Выводы 73
Список использованной литературы 75
Список работ, опубликованных по теме диссертации 96
- Лейкоциты как трансфузионная среда
- Теории криоповреждения и методы защиты клеток
- Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека до введения в холодовой анабиоз (-80С) и через разные сроки после выхода из него
- Влияние длительного хранения оптимального хладоограждающего раствора на его криозащитные свойства
Введение к работе
Актуальность исследования. Применение различных клеточных компонентов крови в лечебной практике возможно только при наличии постоянных запасов консервированных клеток. Криоконсервация компонентов крови в настоящее время является одной из актуальных областей развития научной исследовательской деятельности (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994; Сведенцов Е.П., 1999; Wolfe J. et al. 1999; Koshimoto C, 2002). На сегодня криоконсервирование - единственный известный метод, способный обеспечить длительную сохранность ядерных клеток животных и растений. Данные по этой проблеме свидетельствуют, что чем проще организованы клетки, тем лучше они переносят неблагоприятное воздействие факторов охлаждения (замораживания) - отогрева. На примере крови этот тезис был доказан применительно к разным популяциям клеток крови (Цуцаева А.А., 1981; Голдовский A.M., 1986; Белоус A.M., 1994, Утемов СВ. и соавт., 1995, 1999; Сведенцов Е.П. и соавт., 2000, 2004). Различные виды клеток крови, имея сложную внутреннюю структуру, нуждаются в индивидуальных методах" замораживания, включающих программу охлаждения и состав криозащитного раствора.
В настоящее время показаниями к применению лейкоконцентрата являются патологические состояния различного происхождения, при которых организм не в состоянии самостоятельно остановить инфекционный процесс (Аграненко В.А, 1985; Абдулкадыров К.М., 1994; Балашов Д.Н., 2001; Neppert J., 1996; Sputtek А., 2004). Однако, лейкоцитарная масса как трансфузионная среда до сих пор не получила широкого распространения в лечебной практике. Во многом это связано с трудностями хранения данного трансфузионного компонента. Установлено; в частности, что у выделенных гранулоцитов быстро нарушаются морфофункциональные свойства: уже через 48 часов исчезает способность к фагоцитозу (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994; Заривчацкий М.Ф., 1995). Единственным методом долгосрочного хранения лейкоцитов является замораживание при температурах ниже 0С.
Исследования по криоконсервации лейкоцитов при температурах -20С и -40С показали возможность лишь недолговременного сохранения их функциональной активности и морфологического состояния (Деветьярова О.Н., 2005; Щеглова О.О., 2005). Температура -80С относится к низким температурам. Использование данного температурного диапазона весьма перспективно в связи с рядом преимуществ перед сохранением при ультранизких температурах. В числе этих преимуществ следует назвать использование электроморозильников вместо трудоёмкого и дорогого в эксплуатации жидкоазотного криогенного оборудования (Утемов СВ., 1999; Сведенцов Е.П. и соавт. 2000). Криоконсервация при данной температуре обеспечивает длительную сохранность клеток и допускает колебания температуры без сильного влияния на их функциональную полноценность, что особенно важно в отношении лейкоцитов, которые быстро реагируют на состояние окружающей их среды, изменяя деятельность различных систем клетки (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов СВ., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001). Таким образом, актуальным является вопрос о создании метода криоконсервации лейкоцитов, позволяющего сохранить функциональную активность данных клеток на высоком уровне в течение длительного времени и не требующего использования дорогостоящего оборудования.
Цель исследования - определить функциональное состояние лейкоцитов крови человека, перенёсших холодовой анабиоз при -80С, введение в который осуществлялось по разработанному методу с помощью нелинейной программы замораживания под защитой оригинального комбинированного криоконсерванта.
Задачи исследования:
1. Разработать оптимальный состав хладоограждающего раствора, сравнив три варианта раствора по показателям функциональной и морфологической сохранности лейкоцитов, замороженных под их защитой до -80С
Изучить функциональные и морфологические свойства лейкоцитов крови человека, замороженных до -80С, через различные сроки хранения.
Провести биологические испытания нового оптимального хладоограждающего раствора и переносимость аутотрансфузий лейкоконцентрата, подвергавшегося холодовому стресс-воздействию под его защитой, на экспериментальных животных.
Научная новизна. Изучено функциональное состояние лейкоцитов крови человека, вышедших из долговременного криоанабиоза при — 80С, введение в который осуществлялось с применением нелинейной программы охлаждения с помощью электроморозильников на -30С и -80С и под защитой разработанного криоконсервирующего раствора. Разработанный поликомпонентный криоконсервирующий раствор для лейкоцитов крови человека содержит протекторы различного типа действия: ГМБТОЭМ (гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина) и ДМСО (диметилсульфоксид), а также антигипоксант и антиоксидант ОМЭПС (сукцинат оксиметилэтилпиридина). Дано научное обоснование его криозащитных свойств.
Теоретическая и практическая значимость работы. Дано научное обоснование криозащитных свойств нового хладоограждающего раствора, включающего в себя криопротекторы ГМБТОЭМ и ДМСО и «реставрирующую» добавку ОМЭПС. Результаты проведённых исследований расширяют представление об общих механизмах криоповреждения и криозащиты на клеточном уровне при температуре хранения -80С.
В результате проведенных биологических (определение пирогенности, «острой» и «хронической» токсичности) исследований выявлено, что разработанный хладоограждающий раствор нетоксичен, апирогенен, не требует отмывания от биообъекта после его размораживания, не вызывает реакций и осложнений у животных при внутривенном введении с размороженным лейкоцитным концентратом. Результаты данного исследования представляют интерес для различных учреждений биологического и медицинского профиля.
Основные положения, выносимые на защиту:
Хладоогр
Новый криозащитный раствор позволяет вводить лейкоциты в холодовой анабиоз при -80С по нелинейной программе с помощью 2-х электроморозильников (на -30С и -80С) без использования жидкого азота и дорогого криогенного оборудования.
Функциональная активность и морфологическая полноценность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -80С под защитой нового хладоограждающего раствора, сохраняются на высоком уровне в течение 180 суток (срок наблюдения).
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на V и VI молодежных научных конференциях Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2006, 2007); I Всероссийской молодёжной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008); научно-практической конференции «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2008); научных конференциях с международным участием «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Новые криобиотехнологии для решения фундаментальных и прикладных задач медицины» (Харьков, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009); объединённом заседании Кировского филиала Российского физиологического общества имени И.П. Павлова и Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2008), Ученом Совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2008).
Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных и морфологических свойств нативных и размороженных лейкоцитов и проведена статистическая обработка результатов исследования. Он принимал участие в разработке и исследовании хладоограждающего раствора, проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК, 2 в прочих журналах.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 98 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты экспериментальных исследований, обсуждение результатов экспериментальных исследований), выводов, списка использованной литературы (198 источника, из них 112 отечественных и 86 иностранных) и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Диссертация содержит 20 таблиц, 7 рисунков.
Лейкоциты как трансфузионная среда
Лейкоцитный концентрат - трансфузионная среда с высоким содержанием лейкоцитов периферической крови от 10-Ю9 до 40-50« 109 данных клеток в 200—500 мл суспензионной среды с незначительной примесью эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы (Ермолович СВ., 1981; Аграненко В.А., Тибилова Н.Н., 1997; Сведенцов Е.П., 1999). Показаниями к применению лейкоконцентрата являются: лейкоцитопения, когда количество лейкоцитных клеток в периферической крови больного менее 1,5«109/л, при различных патологических состояниях с угрозой развития или развивающимися инфекционными осложнениями (Аграненко В.А, 1985, Sputtek А., 2004).; гипо- и апластические состояния кроветворения, медикаментозные агранулоцитозы (Ермолович СВ., 1981; Аграненко В.А., 1983; Абдулкадыров К.М., 1994; SchifferC, 1999; Muncunill J., 1999); тяжелый сепсис, онкологические и гематологические заболевания с резким угнетением лейкопоэза в результате применения химио- и лучевой терапии (Заривчацкий М.Ф., 1995; Жибурт Е.Б., 1997; Балашов Д.Н., 1999); токсическая и терминальная фазы разлитого перитонита с выраженными признаками иммунодефицита (Ханевич М.Д., Маринин А.В., 1995; Рыжков СВ. и соавт., 1995); ? гнойные заболевания плевры и легких, обширные глубокие ожоги в стадии генерализации инфекционного процесса с признаками иммунодефицита тяжелой степени и при неэффективности проводимого лечения (Шалаев С.А. и соавт., 1990; Мельникова В.Н. и соавт., 1993); ? нейтропения и выраженный сепсис у новорожденных (Cairo M.S. et al, 1992; Neppert J., 1996; Vamvakas E.C. et al, 1996); нейтропения и сепсис у детей (Heddle N.M. и соавт., 1994; Балашов Д.Н.,2001). Несмотря на широкий спектр ситуаций, при возникновении которых имеет место назначение трансфузии лейкоцитов, в последние годы эту процедуру применяют, в основном, в отношении детей, трансфузии лейкоцитов которым более успешны. Вероятно, это связано с относительным увеличением дозы у маленьких реципиентов или отсутствия аллоиммунизации (Strauss R.G. et al., 1995; De Montalembert M. et al., 1998; Абдулкадыров K.M., 2000; Engelfriet C.P. et al., 2000; Румянцев А.Г., 2002). Противопоказаниями к применению лейкоконцентрата служат свежие тромбозы и эмболии различного генеза, тяжелые аллергические реакции и острые нарушения мозгового кровообращения, тяжелые формы сердечной недостаточности, инфаркт миокарда, гипертонический криз. Концентрат лейкоцитов, в котором содержатся нежизнеспособные лейкоциты или их содержание ниже лечебной нормы, также не следует допускать к трансфузии (Сведенцов Е.П., 1999; Румянцев А.Г., 2000). Средняя доза при трансфузии гранулоцитов должна составлять 0,9-109/кг (Плоцкий А.Н., 1995; McCullough et al., 1996).
Однако следует помнить, что многократные трансфузии лейкоцитов способствуют быстрому образованию антител к этим элементам. Критерием эффективности трансфузий концентрата лейкоцитов является повышение эффективности проводимой антибактериальной терапии и снижение активности воспалительного процесса при одновременном увеличении числа лейкоцитов в периферической крови (Заривчацкий М.Ф., 1995; Мельникова В.Н., 1995). Сегодня существует несколько способов получения концентрата лейкоцитов из свежезаготовленной крови: выделением из крови лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования и спонтанного расслоения (Леонтович В.А. и соавт., 1971; Волкова С.Д., 1981; Гаврилов O.K., 1984); ускоренным осаждением эритроцитов с применением коллоидных веществ, выделением плазмы, обогащенной лейкоцитами, для её последующего центрифугирования и получения ЛК (70% клеток от исходного содержания) (Луганова И.С., СейцИ.Ф., 1967) фильтрационным лейкаферезом с пропусканием гепаринизированной крови через специальные (нейлон, дакрон, шерсть) фильтры, задерживающие лейкоциты (Утемов СВ., 1995). Последние элюируют с адсорбента растворами, содержащими хелатные агенты, позволяющие получить 80% лейкоцитов от исходного содержания; автоматическим лейкаферезом на сепараторах, позволяющим получить от одного донора ЛК с большим числом клеток (2 - 6 1010). (Калинин Н.Н., 1978; Блага М., 1983; Хестер Д., 1985; Шевченко Ю.Л. и соавт., 2003). В РНИИГТ были предложены методы получения лейкоцитной взвеси путем повторного двойного и тройного лейкаферезов с применением контейнеров «Гемакон-500/300», «Компопласт-300», лабораторных центрифуг К-70 или ЦЛ-4000 (Мельникова В.Н. и соавт., 2003). При двойном лейкаферезе от донора получают 200 мл лейкоцитной взвеси, содержащей до 4,0 10 лейкоцитов. В тройном лейкаферезе получают 300 мл взвеси, содержащей до 6,0 109 лейкоцитов.
Теории криоповреждения и методы защиты клеток
Само по себе действие отрицательных температур проявляется в дестабилизации структур клетки вблизи 0С.
Первой из гипотез повреждения клеток во время замораживания стала механическая. Согласно этой гипотезе клетка разрушалась растущими кристаллами льда (Максимов Н.А. 1913).
Позднее В. I. Luyet (1949) установил, что в основе разрушения биообъектов лежит образование вне- и внутриклеточных кристаллов льда, причём наиболее выраженное повреждающее действие на структуры клеток оказывают гексагональные кристаллы льда, а при формировании мелкозернистых форм повреждения значительно менее выражены. Выявлено существование прямой зависимости характера кристаллизации от присутствия в среде различных криопротекторных добавок и скорости снижения температуры.
Т. Nei (1962) и Е. Lusena (1965) считали, что клетки, локализованные в микроканальцах льда, повреждаются в результате действия «эффектов раствора» и растущих кристаллов льда. -Так плазматические мембраны клеток проявляют устойчивость только к медленно растущим кристаллам льда и сильно повреждаются в случае взрывного роста кристаллов внутри клетки, что приводит к механическому разрыву мембраны. Эти явления проявляются и при рекристаллизации (увеличении кристаллов льда при отогреве). Это позволило Е. Asachina (1966) выдвинуть рекристаллизационную гипотезу повреждения клеток. Им было показано, что некоторые клетки могут выживать при возникновении внутриклеточного льда при условиях формирования мелкозернистых кристаллов, не способных к росту. Если при этом отогрев клеток проводить очень быстро, то они полностью сохраняют свои биологические свойства. Т.е. летальным фактором для клеток является способность внутриклеточных кристаллов льда к увеличению до критических величин.
Повреждающее действие может оказывать и концентрация солей, возникающая при вымораживании чистой воды в лед (Lovelock J.E., 1953). Согласно этой концепции разрушение замораживаемого биообъекта происходит за счет воздействия гиперконцентрированных растворов электролитов на структуру плазматической мембраны клеток: нарушаются водородные, ионные и гидрофобные связи между компонентами мембран, в результате чего мембраны теряют часть фосфолипидов и холестерин. Изменяется поток ионов и метаболитов, осмотическая устойчивость мембран клеток резко снижается, и они могут лизировать. Об осмотическом стрессе при криоконсервировании говорится и в более поздних работах (Takahashi Т. et al., 1985; МсСаа С. et al., 1991; De Loecker W. et al., 1998).
P. Mazur (1970) выдвинул и математически смоделировал двухфакторную концепцию криоповреждений клеток, в которой он отмечает, что гибель клеток происходит в результате роста внеклеточного льда и действия «эффектов раствора», а также большую роль играет быстрая скорость замораживания биообъекта, когда переохлажденные клетки не успевают дегидратировать и повреждаются в основном внутриклеточными кристаллами льда.
Meryman Н.Т. (1974) выдвинул концепцию "минимального объема клетки", при достижении которого процесс дегидратации приостанавливается и дальнейшее увеличение осмотичности среды способствует потере барьерных свойств плазматической мембраны, а затем разрушению клетки. В основе лежит способность плазматической мембраны сжиматься до определенного уровня, после которого она начинает испытывать сопротивление внутриклеточного содержимого. В результате максимального сжатия на мембране возникает градиент гидростатического давления, который приводит к ее разрыву. Однако известно, что повреждение плазматической мембраны при охлаждении носит более сложный характер, связанный с развитием перекисного окисления липидов, их фазового разделения в плоскости мембраны, нарушением структурно-функционального состояния белков цитоскелета. Гипотеза минимального объема аналогична гипотезе J. Е. Lovelock и предполагает необходимость наличия криопротектора как внутри, так и вне клеток для эффективной криозащиты. Некоторые положения концепции минимального объема были дополнены сульфгидрильной теорией криоповреждений биообъектов, согласно которой в результате пространственного сближения микромалекул и взаимодействия реакционно-способных группировок формируются ковалентные дисульфидные связи в белках типа S-S-сшивок, которые устраняют функцию активных SH-групп ферментов и тем самым нарушают биологические свойства белков мембран и цитозоля.
Помимо повреждений клеток при температурном шоке, вызываемых осмотическими процессами, В.Ф. Осташко и Ф.И. Осташко (2004) в своей работе указывают на разрушительную силу удара резонансной гидродинамической волны, которая появляется в результате внезапных изменений скорости движения в закрытую полость клетки потока воды и его внезапной остановки цитоплазматической мембраной, напряженной до критического уровня и утратившей свойство упругой деформации.
Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека до введения в холодовой анабиоз (-80С) и через разные сроки после выхода из него
Изучение функциональных и морфологических свойств лейкоцитов осуществляли до введения в холодовой анабиоз и после выхода из него по общепринятым методикам: определение количества клеток путем их подсчета в камере Горяева, определение жизнеспособности ядерных клеток крови в пробах исключения эозина по R. Schreck, изучение морфологического состава лейкоцитов в мазках, окрашенных красителями Май-Грюнвальда и Романовского, выявление уровня функциональной активности нейтрофилов по их поглотительной способности инертных частиц латекса, диаметром 0,8 микрона, определении уровня содержания лизосомально-катионных белков, определение степени окислительно-восстановительного метаболизма в нейтрофилах с помощью НСТ-теста.
Исследования с оптимальным вариантом раствора для хранения лейкоцитов при -80С проводились на сроках 1 и 180 (срок наблюдения) суток.
При подсчете количества лейкоцитов в камере Горяева до введения в состояние холодового анабиоза и после выхода из него не выявлено достоверного снижения относительного количества лейкоцитов после 180-суточного хранения по сравнению со сроком хранения 1 сутки (табл. 3.8). В то же время выявлено уменьшение количества лейкоцитов после отогрева через 180 суток.
Изучение целостности клеточной мембраны лейкоцитов с помощью витального красителя эозина показало (табл. 3.9), что после отогрева клеток, замороженных под защитой оптимального хладоограждающего раствора по нелинейной программе и хранившихся при температуре -80С разные сроки (1 и 180 суток), происходит достоверное уменьшение их эозинорезистентности по сравнению с исходным уровнем. В то же время отсутствует достоверное различие между сроками хранения лейкоцитов.
При исследовании морфологического состава лейкоконцентрата выявлено достоверное увеличение относительного количества лимфоцитов и моноцитов по сравнению с исходными значениями лейкоформулы (табл. 3.10). В то же время не наблюдалось достоверного изменения количества гранулоцитов при обоих сроках хранения. Также выявлено достоверное уменьшение количества гранулоцитов через 180 суток хранения по сравнению с 1 сутками. Количество моноцитов и лимфоцитов достоверно увеличивалось. Это обусловлено, прежде всего, более высокой устойчивостью этих видов клеток к агрессивным факторам холодового стресс-воздействия при замораживании.
При изучении популяции лимфоцитов установлено, что количество Т-и В-лимфоцитов в размороженных образцах через 1 сутки достоверно не изменялось по сравнению с данными до замораживания (табл. 3.11). В то же время после отогрева через 180 суток количество В-лимфоцитов достоверно уменьшалось, по сравнению со сроком хранения 1 сутки.
Основной функцией нейтрофилов является фагоцитоз. Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов (процентное отношение фагоцитирующих клеток к общему числу сосчитанных) методом С.Г. Потаповой и соавт. (1977) показало, что в результате хранения в состоянии криоанабиоза лейкоцитов с исследуемым раствором происходит достоверное уменьшение количества клеток, способных поглощать частицы латекса при различных сроках хранения по сравнению с данными до замораживания. Однако достоверных различий между сроками хранения 1 и 180 суток не выявлено (табл. 3.12), клетки сохраняются одинаково на высоком уровне.
Полученные нами данные (табл. 3.13) свидетельствуют о том, что после хранения клеток в течение 1 и 180 суток при -80С количество лизосомально-катионных белков по среднему цитохимическому коэффициенту достоверно не отличается от исходного уровня. Также нет отличия в зависимости от сроков хранения (р 0,05).
По данным НСТ-теста установлено, что до замораживания только 4-5% нейтрофилов способны к восстановлению формазана. После размораживания нами отмечено по НСТ-тесту достоверное увеличение количества активированных нейтрофилов (рис 3.7). При хранении клеток в течение 1 суток при -80С эта доля возросла в 4,6 раза (при исходном количестве клеток с формазаном 4,6 ± 0,7 % и после отогрева - 21,3 ± 2,3 %), тогда как после их хранения в течение 180 суток она увеличилась в 6,8 раза (до замораживания 3,0±0,87 %, после отогрева 20,6 ± 3,5 %) (р 0,05).
Влияние длительного хранения оптимального хладоограждающего раствора на его криозащитные свойства
Хранение 3-х проб оптимального хладоограждающего раствора №2 в течение 45 суток при температуре +60С, которые приравниваются к хранению в течение 2-х лет при температуре +4С, показало нестойкость его физико-химических свойств, в частности кислотности, которая изменяется в кислую сторону (табл. 3.20), поэтому приготовление раствора необходимо осуществлять непосредственно перед процедурой замораживания. Опыт криоконсервации лейкоцитов крови человека насчитывает более 40 лет (Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А., 1966; Crowley James P., 1974; Lionetti F.J., 1975; Franges L. 1978; Boonlayangoor P, 1980; Белоус A.M., Грищенко E.A. 1994; Утёмов СВ., 1999; Сведенцов Е.П., 1999, 2004). За это время исследователями использовались самые разнообразные программы замораживания, аппаратура, криопротекторы, методики выделения лейкоцитов и оценки состояния лейкоцитов после отогрева. Однако, несмотря на опыт, накопленный в этой области, нельзя назвать проблему доступного длительного сохранения лейкоцитов решённой. Сохранность лейкоцитарных клеток зависит от условий и способов замораживания. Большинство клеток высших растений и животных в процессе эволюции не приобрели естественных механизмов адаптации к холоду, поэтому они нуждаются в средствах «искусственной» защиты от воздействия низких температур, в качестве которых могут выступать криопротекторы. В настоящее время известно более 120 веществ, обладающих криопротекторным действием, однако широкое применение получили единицы из них. В качестве внутриклеточных (способных проникать в клетку) криопротекторов чаще всего используют глицерин, диметилсульфоксид, диметилацетамид, 1,2-пропандиол, защитное действие которых обусловлено тем, что благодаря своей низкой молекулярной массе они легко проникают в клетку, связывают воду, изменяют кристаллообразование, способствуя образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. Эти вещества образуют также связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению ее повреждения при замораживании. Кроме того, будучи хорошими растворителями, они снижают концентрацию солей внутри и вне клеток, тем самым предохраняют их от обезвоживания и повреждения белковых структур. Среди внеклеточных (непроникающих в клетку) криопротекторов широкое распространение получил поливинилпирролидон, действие которого направлено на дегидратацию клеток и стабилизацию фракции внеклеточной воды. Применяют также криозащитные вещества смешанного типа - полиэтиленоксид - 400 и гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (Пушкарь Н.С., 1968; Полякова А.И., 1975; Сведенцов Е.П., 1987; Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994) Сохранность клеточной мембраны зависит также от скорости замораживания и отогрева. В настоящее время для замораживания клеток крови и костного мозга наряду с классическими линейными программами применяют и нелинейные. Показано, что нелинейные, в частности, двухступенчатые программы замораживания клеток костного мозга до сверхнизких температур (Сведенцов Е.П., 1987), а также тромбоцитов до умеренно низких (Яленский А.Ю., 2007) обеспечивают такую же эффективность криоконсервации, как и традиционное охлаждение с постоянной скоростью. Нелинейные программы наиболее предпочтительны, так как значительно сокращают продолжительность и трудоемкость процедуры замораживания. Они заключаются в погружении контейнера с биологическим объектом в криостат с жидким хладоагентом, имеющим фиксированную температуру, а затем после выдержки в течение 10-20 мин в нем - непосредственно в сосуд Дьюара с жидким азотом (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994). Финансовые затраты на реализацию низкотемпературной (-80С) консервации гемопоэтических стволовых клеток по нелинейному режиму (Костяев А.А., 2003) с применением электрорефрижераторной технологии в 2 раза ниже затрат при замораживании по линейным программам с использованием жидкого азота (— 196С). Это прекрасная альтернатива для тех учреждений, где нет возможности использовать жидкоазотную технологию. Нелинейные программы подтвердили свою эффективность и при замораживании ядерных клеток крови до субумеренно (-20С) и умеренно низкой (-40С) температуры (Svedentsov Е.Р. et al., 2004, 2006). На термограммах не отмечается выброса кристаллизационного тепла, и, следовательно, не происходит рекристаллизации и роста крупных кристаллов льда, вызывающих механическое повреждение мембран, что также положительно сказывается на сохранности клеточной взвеси.
