Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Неинвазивная пренатальная диагностика по уровням свободной эмбриональной днк (сэ-днк) у женщин с привычным выкидышем и осложненным течением беременности (обзор литературы) 12
1.1 Генетические причины привычного выкидыша 12
1.2 Неинвазивная пренатальная диагностика по уровням сэ-ДНК в прогнозировании гестационных осложнений 15
1.3 Возможности неинвазивной пренатальной диагностики по сэ-ДНКв выявлении анеуплоидий 20
Глава 2. Материал и методы исследования 28
2.1 Критерии включения и исключения пациенток в группы исследования 28
2.2 Методы исследования 31
2.3 Специальные методы исследования 33
2.4 Статистическая обработка материала 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 44
3.1 Определение уровней сэ-ДНК независимо от пола плода для прогнозирования гестационных осложнений 44
3.1.1. Клиническая характеристика женщин исследуемых групп 44
3.1.2. Результаты клинико-лабораторного обследования супружеских пар с привычным выкидышем на ранних сроках беременности 51
3.1.3. Течение беременностей у пациенток исследуемых групп...54
3.1.4. Опре деление общей и сэ-ДНК в динамике с 6 до 22 недели беременности 58
3.1.5. Исходы наблюдаемых беременностей у женщин основной и контрольной групп
3.1.6. Анализ течения родов, послеродового периода и состояния новорожденных 80
3.2 Диагностика анеуплоидий по сэ-ДНК у пациенток высокого риска по развитию хромосомной патологии 87
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 99
Выводы 120
Практические рекомендации 123
Список сокращений 127
Список литературыq
- Неинвазивная пренатальная диагностика по уровням сэ-ДНК в прогнозировании гестационных осложнений
- Возможности неинвазивной пренатальной диагностики по сэ-ДНКв выявлении анеуплоидий
- Клиническая характеристика женщин исследуемых групп
- Анализ течения родов, послеродового периода и состояния новорожденных
Неинвазивная пренатальная диагностика по уровням сэ-ДНК в прогнозировании гестационных осложнений
Открытие свободной (внеклеточной) эмбриональной ДНК (сэ-ДНК), циркулирующей в плазме крови матери, положило начало новым возможностям неинвазивной пренатальной диагностики во время беременности [129, 134].
Пионерами в данной области были группа авторов под руководством Dennis Lo, с 1997 года непрерывно совершенствующие методы выявления сэ-ДНК [105]. Тем не менее, детальные исследования в неинвазивной пренатальной диагностике были проведены в течение последних пятнадцати лет, что связано с прогрессивным развитием технологии секвенирования.
Доля сэ-ДНК в плазме крови матери составляет 1-2% от всей циркулирующей ДНК [76, 98], что ограничивало ее выявление и диагностические возможности методов.
Задача, стоящая перед исследователями состоит в количественном определении ДНК плода на фоне большого количества ДНК матери. Некоторые локусы, такие как Y хромосома или ген RHD (Rhesus D), у беременной с резус-отрицательной принадлежностью крови, позволяют детектировать количество ДНК в плазме матери методом ПЦР. Определение наличия Y хромосомы и гена RHD описано в мировой литературе и применяется в клинической практике. Однако таким образом можно определить ДНК плода только у 50% беременных женщин. На данный момент сэ-ДНК используется для неинвазивного пренатального определения пола плода при сцепленных с полом заболеваниях и резус-принадлежности плода у резус-отрицательных беременных женщин [68, 87, 120, 158].
Новые открытия в эпигеномике сделали возможным использовать определения сэ-ДНК в течение беременности вне зависимости от пола плода [53, 73, 108, 90, 118]. Существует несколько способов определения доли свободной эмбриональной ДНК в крови матери вне зависимости от пола и Rh-фактора плода. Все они основаны на обнаружении различий между ДНК принадлежащей матери и ДНК плода.
Одним из методов является определение ДНК плода на основании профиля метилирования. Данный метод основан на эпигенетических различиях между плодовой и материнской ДНК, а именно на различиях в метилировании плодовой ДНК и ДНК матери. В качестве мишеней используются гены гиперметилированные у плода и гипометилированные у матери, что позволяет использовать чувствительные к метилированию рестриктазы. Подобные ферменты специфично разрушают неметилированную ДНК матери и оставляют только гиперметилированную ДНК плода. После этого становится возможной специфичная детекция свободной ДНК плода методом ПЦР в режиме реального времени [ 132, 135, 137].
К другим методикам относятся определение мутаций унаследованных от отца методом MALDIOF MS, матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, анализ коротких тандемных повторов. Клиническое применения данных методик описано для неинвазивнои пренатальнои диагностики талассемии, ахондроплазии, миодистрофии, муковисцидоза и врожденной гиперплазии коры надпочечников.
Внедрение массивного параллельного геномного секвенирования в научные и клинические исследования открыло новую эру в неинвазивнои пренатальнои диагностике, как в исследовательском, так и в практическом направлении [157].
Клиническое использование количественного измерения сэ-ДНК в настоящее время активно развивается. Еще в 1999 году было обнаружено почти 5-кратное повышение сэ-ДНК плода в кровотоке матери при преэклампсии по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью [136]. Было установлено, что при преэклампсии происходит выброс в материнский кровоток клеток синцитиотрофобласта, микрочастиц, ДНК и РНК молекул. Анализ данного материала может расширить понимание вклада плацентарных факторов в этиологию преэклампсии. При дальнейшем изучении этой патологии выявлен не только рост уровней сэ-ДНК, но и значительное повышение общего уровня ДНК матери, причем увеличение обоих показателей соответствовало степени тяжести преэклампсии [127]. Кроме того, было показано, что концентрация сэ-ДНК возрастает задолго до появления первых клинических симптомов. Так как ДНК плазмы является маркером клеточной гибели, повышенный уровень фетальной ДНК может быть результатом некроза и апоптоза клеток плаценты. С другой стороны, нарушение функции почек и печени, наблюдаемое при преэклампсии, ослабляет выведение циркулирующей ДНК из материнской крови. Кроме преэклампсии, были описаны и другие акушерские осложнения, при которых имеет место повышение уровня сэ-ДНК: преждевременные роды, тяжелая рвота беременных, плотное прикрепление плаценты или ее врастание, ЗРП, внутриматочные гематомы, многоводие, плацентарная недостаточность [84, 89, 94, 147].
Связь повышенных уровней сэ-ДНК с развитием плацентарной недостаточности была продемонстрирована в нескольких исследованиях. Так во Франции, определены уровни сэ-ДНК у женщин с задержкой роста плода (ЗРП) в связи с преэклампсией (группа А, 19 женщин), при ЗРП вследствие других причин (группа В, 31 пациентка). Контрольная группа состояла из 28 женщин (группа С). В результате исследования были сделаны выводы, что уровни как общей, так и сэ-ДНК были достоверно выше при плацентарной недостаточности и ЗРП [151].
Возможности неинвазивной пренатальной диагностики по сэ-ДНКв выявлении анеуплоидий
В соответствии с поставленными задачами, исследование сэ-ДНК проводилось двум категориям женщин. Первая часть диссертационной работы посвящена определению уровней сэ-ДНК и общей ДНК вне зависимости от пола плода у женщин с нормальной и осложненной беременностью для раннего прогнозирования гестационных осложнений и исходов беременностей.
Во второй части работы проведена оценка клинической значимости выявления анеуплоидий по 21 и 18 хромосомам, а также копийности половых хромосом (X и Y) с помощью неинвазивной пренатальной диагностики по сэ- ДНК по сравнению с общепринятым скринингом беременных.
Для выполнения первой части диссертационной работы обследование проведено 93 беременным женщинам. Из них на основании критериев включения и исключения в исследование вошли 67 пациенток. В связи с техническими возможностями метода выделения сэ-ДНК на основании выявления различных последовательностей у партнеров дальнейшее измерение уровней сэ-ДНК стало возможным провести у 56 супружеских пар (83,6%). Основную группу составили 32 беременные с привычным выкидышем, контрольную группу - 24 беременных с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом. Забор крови проводился, начиная со срока 5-6 недель беременности с интервалом 2 недели до 22 недель беременности вне зависимости от пола эмбриона/плода, далее ежемесячно.
Перед включением в исследование все пациентки прошли обследование по определенной схеме, состоящей из следующих клинических и лабораторных методов:
Сбор данных анамнеза (характер менструаций, число беременностей, выкидышей, родов и абортов, особенности их течения, наличие осложнений; сведения о наследственности, перенесенных ранее заболеваниях, наличии вредных привычек).
Объективный осмотр (тип телосложения, степени развития подкожной жировой клетчатки, характер оволосения, определение наличия видимых отеков, состояния кожных покровов и слизистых оболочек, молочных желез).
Гинекологический осмотр (осмотр наружных половых органов, влагалищное исследование, осмотр в зеркалах: определение состояние слизистой влагалища и шейки матки, выявление эктопии шейки матки, воспалительные заболевания влагалища и шейки матки, наличие опухолей).
Ультразвуковое исследование матки (выяснение жизнеспособности эмбриона (сердцебиения на ранних сроках беременности), соответствия развития гестационному сроку, определение характера имплантации/плацентации, диагностика наличия ретрохориальной и / или заоболочечной гематомы).
Общепринятое лабораторное обследование: клинический анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, анализ крови на ВИЧ, сифилис, гепатиты, группу крови, резус-фактор. Бактериологический посев из цервикального канала и мазок из влагалища на степень чистоты. Исследование отделяемого влагалища и цервикального канала на наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов методом ПЦР («фемофлоріб», «фемофлор-комплекс»). Гемостазиологическое исследование крови. Анализ крови на наличие аутоиммунных антител (антитела к р2-гликопротеину, аннексину, протромбину, кардиолипину, фосфатидилсерину). Оценка врожденных факторов, предрасполагающих к развитию тромбофилии. Проведено проспективное наблюдение за течением и исходами беременностей женщин всех групп.
В динамике беременности проводилась оценка фетоплацентарного комплекса: ультразвуковая фетометрия, допплерометрия в 24-25, 30-31 недели беременности (при наличии показаний), кардиотокография после 33 недель еженедельно.
Клиническая характеристика женщин исследуемых групп
В связи с наличием клинических и ультразвуковых признаков хронического эндометрита, наличия хламидийной инфекции в анамнезе, проведена противовоспалительная терапия с супругом вне беременности.
После лечения по данным УЗИ - адекватный рост и секреторная трансформация эндометрия во второй фазе менструального цикла. Пациентке рекомендована витаминотерапия, гестагенная поддержка со второй фазы предполагаемого фертильного цикла и даны рекомендации о планировании беременности.
При наступлении беременности определение сэ-ДНК, независимо от пола плода, проводилось методом ПЦР в режиме реального времени (real time PCR).
На ранних сроках, до 20 недель, беременность протекала на фоне гестагенной поддержки без осложнений. При сроке 6 недель уровень общей ДНК составил 5080 копий/мл, в то время как уровень сэ-ДНК составил 19 копий/м. Уровень общей и сэ-ДНК колебался в небольших пределах и достоверно не отличался от средних показателей в группе женщин с привычным выкидышем и контрольной группе с физиологически протекающей беременностью.
В сроке 21 неделя беременности при УЗ-исследовании размеры плода соответствовали гестационному сроку, патологии развития плода не выявлено, количество околоплодных вод в пределах нормы. Впервые в сроке 23 недели беременности уровень общей ДНК составил 225393 копий/мл, а уровень сэ-ДНК составил 1968 копий/м. В 25 недель беременности произведены УЗИ и доплерометрия, выявлено: выраженное отставание в показателях фетометрии, снижение кровотока в маточных артериях и артериях пуповины. Размеры плода соответствуют 22 неделям беременности. Выставлен диагноз: Плацентарная недостаточность. Задержка роста плода. Проводилось динамическое наблюдение за состоянием беременной и плода, включая еженедельную допплерометрию и фетометрию, после 27 недель допплерометрия проводилась 1 раз в 3 дня.
В сроке 27 недель зарегистрирован «нулевой» диастолический кровоток в артерии пуповины, уровни общей ДНК составили 456000 копий/мл и сэ-ДНК 3500 копий/мл. Пациентка была госпитализирована, проведена профилактика респираторного дистресс синдрома плода, обследована, данных за развитие преэклампсии не получено. Под тщательным контролем беременность была пролонгирована до 29-30 недель. В сроке 30 недель в связи с развитием маловодия, критическим ухудшением состояния плода вследствие тяжелой плацентарной недостаточности произведено досрочное родоразрешение путем операции кесарево сечение. Кесарево сечение проведено без технических трудностей, ребенок извлечен в целом плодном пузыре, отмечалось выраженное маловодие, воды светлые. Родился живой глубоко недоношенный мальчик массой 630 г, ростом 29 см, оценка состояния по шкале Апгар 5-6 баллов. Плацента массой 165 г, размерами 10x12 см. Ребенок длительно получал лечение в условиях отделения в реанимации и интенсивной терапии новорожденных. Проводилась комплексная терапия: респираторная, антибактериальная, инфузионная, антианемическая, парентеральное питание с положительным эффектом. После стабилизации клинического состояния для дальнейшего лечения и выхаживания ребенок был переведен в отделение патологии новорожденных и недоношенных детей центра, в дальнейшем на выписан домой в удовлетворительном состоянии под наблюдение участкового педиатра.
Интерес представляют данные об уровнях сэ-ДНК на ранних сроках в периферической крови наблюдаемой пациентки с плацентарной недостаточностью. В отсутствии признаков угрожающего/начавшегося выкидыша до 22 недель, достоверных изменений уровней сэ-ДНК по сравнению с уровнями сэ-ДНК у женщин с неосложненной беременностью не отмечено. Вероятно, это свидетельствует о быстром динамическом изменении уровней сэ-ДНК в зависимости от процессов, происходящих в фето-плацентарном комплексе. Повторяющиеся высокие уровни сэ-ДНК в периферической крови женщины после 22 недели беременности свидетельствуют о прогрессировании плацентарной недостаточности. Представленное клиническое наблюдение подтверждает возможность прогнозирования плацентарной недостаточности по апоптотическим выбросам сэ-ДНК в периферическую кровь беременной женщины.
Требуется проведение дальнейших исследований для расширения возможностей диагностики и прогнозирования осложнений второй половины беременности у женщин с отягощенным акушерским анамнезом.
В ходе проведенного исследования выявлено, что одним из частых осложнений III триместра у женщин с привычным выкидышем была угроза преждевременных родов, которая осложняла беременность в 36,0% наблюдений.
При этом женщины были госпитализированы 2-е отделение акушерское патологии беременности, где проводилась токолитическая терапия (Р-миметиками внутривенно), профилактика респираторного дистресс синдрома плода, обследование женщин на инфекции, передающие половым путем, лечение при наличии показаний. Анемия легкой степени, как осложнение III триместра у женщин контрольной группы встречалась в 12,5% случаев, у женщин основной группы - в 16,6% наблюдений.
Преждевременные оперативные роды произошли у 2-х женщин (6,2%), в одном случае у женщины контрольной группы в связи с несостоятельностью рубца на матке в сроке 36 недель беременности, в другом случае у женщины основной группы в связи с критическим ухудшением состояния плода вследствие тяжелой плацентарной недостаточности в сроке 29-30 недель.
Анализ течения родов, послеродового периода и состояния новорожденных
Внедрение методов высокопроизводительного секвенирования открыло новые возможности в неинвазивной пренатальной диагностике анеуплоидий и определении уровней сэ-ДНК для прогнозирования течения и исходов беременностей [6].
В то же время, основным источником сэ-ДНК плода, как полагают, является апоптоз клеток трофобласта, который может служить отражением неадекватной плацентации и развития анеуплоидного плода [63, 140]. В дальнейшем, при определении анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования и одновременном измерении уровней сэ-ДНК открываются возможности не только диагностики ХА плода, но и прогнозирования гестационных осложнений. Оба этих аспекта являются исключительно актуальными у женщин с привычными выкидышами, преждевременными родами, плацентарной недостаточностью в анамнезе. В исследованиях показано, что резкое повышение уровня сэ-ДНК в крови матери связано с гипоксией и некрозом плаценты, что можно обнаружить задолго до появления симптомов осложнений беременности [63]. Повышение уровней сэ-ДНК и общей ДНК может быть прогностическим маркером различных осложнений беременности, в том числе преэклампсии, плацентарной недостаточности, задержки роста плода, преждевременных родов, врастания плаценты, антенатальной гибели плода [56, 59, 62, 88, 94, 109, 126].
Попытки прогнозирования преэклампсии и плацентарной недостаточности по резким выбросам сэ-ДНК в материнский кровоток проводились отдельными группами зарубежных ученых [57, 67, 137]. Установлено, что увеличение уровней сэ-ДНК и общей ДНК происходит задолго до клинических проявлений преэклампсии и плацентарной недостаточности. Аналогичные исследования в области привычных потерь беременностей, а также прогнозирования поздних гестационных осложнений на ранних сроках беременности в доступной литературе найти не удалось. В этой связи целью настоящего исследования является оптимизация программы неинвазивной пренатальной диагностики и прогнозирования исходов беременностей у супружеских пар с привычным выкидышем.
Результаты диссертационной работы основаны на динамическом обследовании 256 женщин, обратившихся в Научно-поликлиническое отделение Центра за период 2011-2014 гг.
Для достижения поставленной цели исследование проведено по двум направлениям. В первом проспективном когортном исследовании проводилось динамическое измерение уровней сэ-ДНК в течение всей беременности у женщин с привычным выкидышем (основная группа) и беременных с неотягощенным акушерским анамнезом (контрольная группа). Исследование проводилось у всех пациенток, начиная со срока 6 недель беременности с интервалом 2 недели до 22 недель беременности вне зависимости от пола эмбриона/плода, далее ежемесячно до родоразрешения. Новизна данного исследования состояла в разработке метода, позволяющего измерить уровень сэ-ДНК у женщин, вынашивающих плоды как мужского, так и женского пола. Предыдущие исследования в данной области в основном касались женщин, вынашивающих мальчиков, когда уровень сэ-ДНК определялся на основании фрагментов Y хромосомы SRY и DYS-14, отсутствующих у беременной женщины и отражающих апоптотические изменения в трофобласте. В проведенном исследовании методом ПНР оценивались делеционные полиморфизмы, присутствующие у отца, но отсутствующие у матери, а следовательно имеющие эмбриональное / плодовое происхождение. В данном исследовании проведен сравнительный анализ уровней сэ-ДНК в различные сроки беременности, при возникновении акушерских осложнений у женщин с отягощенным и неосложненным анамнезом, проанализированы исходы беременностей и родов, состояние новорожденных.
Вторым направлением работы была валидация метода неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий, исключительно важного при осложненном течении беременности у женщин с отягощенным акушерским анамнезом. В исследование включено 200 женщин в сроках беременности от 10 до 20 недель с высоким риском трисомии 21 и/или трисомии 18 и моносомии X по данным комбинированного пренатального скрининга, которым была предложена инвазивная пренатальная диагностика. Критерии исключения: отказ или невозможность проведения инвазивной пренатальной диагностики (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез), невозможность проведения пункции периферической вены, отказ от участия в исследовании.
В совокупности, оба направления данного исследования продемонстрировали современные возможности неинвазиной пренатальной диагностики, основанной на определении ДНК эмбрионального / фетального происхождения.
Исходное обследование проведено 93 беременным женщинам. Из них на основании критериев включения и исключения в исследование вошли 67 пациенток. В связи с техническими возможностями метода выделения сэ-ДНК на основании выявления различных последовательностей у партнеров дальнейшее измерение уровней сэ-ДНК стало возможным провести у 56 супружеских пар (83,6%). Основную группу составили 32 беременные с привычным выкидышем, контрольную группу - 24 беременных с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом. Дизайн исследования представлен на рис. 12.
