Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8-30
1.1. Невынашивание беременности как медицинская и социальная проблема 8-12
1.2. Современные взгляды на этиопатогенез невынашивания беременности 13-19
1.3. Методы прогнозирования течения гестационного процесса lAToll-рецепторы и их значение в акушерстве 24-30
Глава 2. Материалы и методы исследования 31-45
Глава 3. Собственные результаты 46-97
3.1. Результаты ретроспективного исследования 46-53
3.2. Клиническая характеристика пациенток обследованных групп 54-76
3.3. Результаты специальных методов исследования. Показатели провоспалительных цитокинов, экспрессии TLR 2 и TLR 4 в крови пациенток при физиологическом течении беременности и при угрозе ее прерывания 79-89
3.4. Обоснование усовершенствованной тактики ведения пациенток с угрозой прерывания беременности в ранние сроки с учетом показателей врожденного иммунитета 90-94
3.5. Результаты дифференцированной тактики ведения беременных с угрозой прерывания, основанной на разработанных критериях диагностики данной патологии 95-100
Глава 4. Врожденный иммунитет при физиологическом и осложненном течении беременности. Обсуждение полученных результатов 101-117
Выводы 118-118
Практические рекомендации 119-119
Список литературы
- Методы прогнозирования течения гестационного процесса lAToll-рецепторы и их значение в акушерстве
- Клиническая характеристика пациенток обследованных групп
- Обоснование усовершенствованной тактики ведения пациенток с угрозой прерывания беременности в ранние сроки с учетом показателей врожденного иммунитета
- Результаты дифференцированной тактики ведения беременных с угрозой прерывания, основанной на разработанных критериях диагностики данной патологии
Методы прогнозирования течения гестационного процесса lAToll-рецепторы и их значение в акушерстве
Причины невынашивания беременности многочисленны и часто не удается выделить ведущий фактор. .[1,3,16,17,35,145,147,164].
До 80% репродуктивных потерь приходится на I триместр [108,136,228,229]. На самом деле число женщин с невынашиванием может быть несколько выше, так как часть самопроизвольных выкидышей происходит еще до обращения женщины к гинекологу в связи с фактом беременности [129,133,138]. Около 1-2% женщин страдают привычным невынашиванием беременности. Привычный выкидыш может быть связан с наличием хромосомных аномалий , антифосфолипидного синдрома , а также с иммунными и эндокринными нарушениями [107,138,172,174,263]. Среди причин преждевременного прерывания беременности одно из лидирующих мест занимают воспалительные заболевания [110,116,270]. Однако в 50% случаев причина выкидыша оказывается неустановленной [235,266]. Поэтому изучение причин невынашивания беременности до сих пор является одной из актуальных проблем в акушерстве и гинекологии.
По мнению большинства исследователей среди ведущих этиологических факторов неразвивающейся беременности следует прежде всего выделить инфекционный.[148,162,167,179].
Данные Кузнецовой О.А. (2011г.) о результатах гистологического исследования, проведенного у пациенток с неразвивающейся беременностью, указывают на выявленные воспалительные изменения у 76% обследованных женщин.
Роль хронического эндометрита в невынашивании беременности в настоящее время не вызывает сомнений, а во всех случаях замершей беременности по решению Международного конгресса « Контраверсии в акушерстве и гинекологии» дополнительная верификация не требуется [104,132,159,164].
Хронический эндометрит в генезе самопроизвольных выкидышей раннего срока играет безусловную роль, пациентки с хроническим эндометритом имеют достоверно более низкую частоту имплантации эмбриона по сравнению с пациентками с нормальным эндометрием (11% и 58% соответственно) [54,55,222]. Однако диагноз хронического эндометрита не часто фиксируется в историях болезней гинекологических больных, так как диагностика хронического эндометрита представляет собой значительные трудности. В настоящее время для этого используется комплекс клинико-анамнестических данных, но верификация возможна только по данным биопсии эндометрия, полученных при аспирации или диагностическом выскабливании слизистой полости матки под контролем гистероскопии. [302].
Эндометрий и децидуа содержат большое количество иммунных и воспалительных клеток, способных продуцировать цитокины. Одна из недавних гипотез, объясняющих механизм иммунологически обусловленного невынашивания беременности предполагает наличие нарушений в ТН1 типе иммунного ответа и важную роль TNF в реализации этого механизма. Суть гипотезы заключается в том, что плод может выступать в качестве мишени для локальной клеточной иммунной реакции, кульминацией которой является прерывание беременности,у женщин, страдающих привычным невынашиванием, антигены трофобласта активизируют макрофаги и лимфоциты, что приводит к индукции клеточного иммунного ответа регулируемого цитокинами ТН1 клеток – TNF,IL1альфа и IL b что приводит к прекращению развития эмбриона и роста и функционирования трофобласта. Так повышенный уровень TNF и IL в периферической крови обнаруживается только у женщин с невынашиванием беременности, но не у женщин с нормальной репродуктивной функцией. В среднем у 60–80 % небеременных женщин, перенесших несколько спонтанных выкидышей выявляются нарушения ТН1 типа иммунного ответа на антигены трофобласта, в то время как менее чем у 3 % нормально вынашивающих беременность женщин наблюдаются такие же изменения. Было также установлено, что в отличии от женщин с привычным невынашиванием беременности, у которых наблюдается ТН1 тип иммунного ответа на антигены трофобласта, у большинства женщин с нормально протекающей беременностью выявляется ТН2 тип иммунного ответа на антигены трофобласта. Таким образом, цитокины способны нарушать нормальное течение беременности в зависимости от их вида, концентрации и стадии дифференцировки потенциальных тканей-мишеней.
Персистенция в эндометрии бактериально-вирусной инфекции сопровождается нарушениями в системе гемостаза и метаболическими изменениями в слизистой оболочке матки, нарушает рецептивность эндометрия, оказывает негативное влияние на процесс имплантации, что может служить причиной остановки развития эмбриона (плода).
При вирусном и микоплазменном поражении воспалительные изменения в децидуальной оболочке сочетаются с острыми циркуляторными нарушениями в маточно-плацентарных артериях. При бактериальном поражении воспалительные инфильтраты обнаруживают чаще в амнионе, хорионе и межворсинчатом пространстве. При наличии инфекционной патологии у матери смерть эмбриона (плода) обусловлена массивной воспалительной инфильтрацией, а также микронекрозами в месте непосредственного контакта хориона с материнскими тканями.
Тератогенная роль инфекционных заболеваний у матери доказана и обуславливает 1- 2 % всех тяжелых врожденных аномалий у плода.
Роль инфекции в спонтанном прерывании беременности зависит от пути проникновения микроорганизмов, вовлечения в инфицирование плода и околоплодных оболочек, вида и вирулентности микробов, количества проникших патогенов, продолжительности заболевания матери и прочих факторов.
Восходящий путь инфицирования эмбриона (плода), преобладающий в I триместре беременности, обусловлен условно-патогенными бактериями, а также микоплазмами, хламидиями, грибами рода Candida, вирусом простого герпеса. Предрасполагающими факторами к развитию воспалительного процесса могут явиться истмико-цервикальная недостаточность, частичный разрыв плодных оболочек и проведение некоторых инвазивных манипуляций с целью оценки состояния эмбриона (плода): биопсия хориона, амниоцентез и др.
Клиническая характеристика пациенток обследованных групп
В каждую пробирку добавляется по 50 мкл. крови с ЭДТА, добавляется по 5 мкл меченных R-фикоэритрином (PE) моноклональных антител к CD16 (IOTest, Beckman coulter). Перемешивается на Vortex 1-2 секунды, инкубируется в темноте 15-20 минут, добавляется лизирующий раствор (OptiLyse B) по 250 мкл и сразу же перемешиваем на Vortex 3-4 секунды.
Помещается в темное место на время от 10 минут до 2 часов, добавляется PBS (приготовление PBS: 1 таблетка на 100 мл воды) по 250 мкл., перемешивается. Через5-10 минут пробы готовы к анализу.
Далее исследуемые пробы помещались в проточный цитофлюориметр FACScan (Becton Dickinson, США). Детекция TLR-4 и CD-14, CD-16 в пробе с помощью метода проточной цитофлюориметрии. Учет результатов.
Лазерная проточная цитофлюориметрия является универсальным методом исследования лейкоцитов, который позволяет не только получить детальные характеристики клеточных субпопуляций, но производить их препаративное разделение. Обработка полученных данных по специальной программе позволяет определить количество сайтов связывания, т. е. вычислить плотность данного рецептора на клеточной мембране.
Проточная цитофлюориметрия основана на измерении оптических свойств индивидуальной клетки, предварительно обработанной соответствующими МКА, меченными флюоресцирующими красителями. Клетки образца проходят поодиночке через проточную кювету. В определенном месте поток клеток пересекает луч света (лазер, ультрафиолетовая лампа или их комбинация). Свет от возбужденных флюоресцирующих красителей, связанных с клеткой, улавливается, усиливается и преобразуется в определенную информацию гистограмму. При использовании нескольких красителей, МКА и изменения угла рассеивания света возможно одновременное измерения нескольких параметров одной клетки (фагоцитоз, полноценность ДНК и т. д.). Современные цитометры позволяют исследовать не только популяции клеток, но и состояние мембраны клетки, изменение её формы и субструктур; диагностировать аномальные клетки, активность внутриклеточных ферментов, активность митохондрий, интенсивность экспрессии генов и т. д. Современное поколение приборов, совмещая лазерную и компьютерную технологии с использованием флюоресцентных красителей, дают возможность исследовать тысячи клеток в секунду.
Принцип метода основывается на том, что определенные субклассы лейкоцитов содержат на своей поверхности специфические рецепторы. Добавляя моноклональные меченные флюорохромом антитела к взвеси лейкоцитов, можно пометить определенные лимфоциты. Подсчет меченых лейкоцитов осуществляется за счет того, что флюорохром при освещении светом определенной длины волны начинает флюоресцировать, что отмечается прибором. Таким образом, определяются молчащие клетки и клетки меченные флюорохромом. Можно использовать сразу двойную или тройную метку – добавление к одной пробе антител разной специфичности меченных разными флюорохромами [Белан Э.Б., Гумилевский Б. Ю.2006]. Учет результатов: Степень экспрессии вычисляется как отношение интенсивности флуоресценции в опытной пробе к пробе с изотипическим контролем. При учете специфического свечения на проточном цитофлюориметре клетки экспрессирующие TLR-4(моноциты и гранулоциты) из гейта лимфоцитов, будут располагаться по каналу FITC дальше границы негативного контроля. Клетки экспрессирующие CD14(моноциты) CD16(гранулоциты) из гейта лимфоцитов, будут располагаться по каналу PE дальше границы негативного контроля.
Характеристики установленных на проточном цитофлюориметре светофильтров таковы, что их область пропускания соответствует максимуму спектра испускания флуорофора. Но за счет того, что спектр испускания флуорофора может быть достаточно широким, часть его излучения может проходить сквозь другие светофильтры, настроенные на регистрацию излучения другого флуорофора. То есть, к примеру, некоторая доля излучения от красителя FITC будет регистрироваться в канале, предназначенном для фикоэритрина, искажая результаты измерения. Для исключения данного эффекта необходимо уменьшать сигнал с детектора пропорционально сигналу с соседнего детектора, компенсируя, таким образом, паразитное свечение соседних флуорохромов. Величина компенсации зависит от многих параметров: напряжения на фотоумножителе и как следствие его чувствительности, спектра используемых флуорохромов, производителя реактивов (меченые антитела от разных производителей имеют разное соотношение белок/флуорофора, соответственно одни и те же образцы, окрашенные различными антителами, будут давать сигналы разной интенсивности).
Для качественного анализа и контроля качества проводилась калибровка прибора с использованием латексных частиц, для проверки оптического выравнивания источника света и для контроля мощности источника света.
Материалы для контроля: REF 6605359 Flow-CheckTM Fluorospheres/ Flow-Check – полистероловые гранулы (флуоросферы). По каналу FITC использовали – FL1 HPCD – QC 1L Flow – Check-pro, Flow – Check, 9434817, FL1@ 2.0., X, HPCV. По каналу PE использовали – FL2 HPCV – QC 1L Flow – Check-pro, Flow – Check , 9434817, FL2@ 2.0., X, HPCV.
Обоснование усовершенствованной тактики ведения пациенток с угрозой прерывания беременности в ранние сроки с учетом показателей врожденного иммунитета
Полученные данные свидетельствуют, что в структуре экстрагенитальной патологии преобладают воспалительные заболевания. В проведенном нами исследовании частые простудные заболевания имели место в анамнезе у 21(26,6%)пациенток группы сравнения, у 11,1% - в основной группе. При этом в контрольной группе острые респираторно-вирусные заболевания имели в анамнезе 32,4% женщин.
Тонзиллит был в анамнезе у 8 (10,1%) обследованных женщин группы сравнения и у 3 (5,5%) основной группы, хронический гайморит - в группе сравнения 3 (3,8%), в основной группе 1 (1,9%). Достаточно часто выявлялся хронический бронхит, указания на который были у 10,8% пациенток контрольной группы, 11,1% - группы сравнения и у 3,7% женщин основной группы. Пневмония выявлена у 2(5,4%)пациенток контрольной группы и у 5(6,3%) пациенток группы сравнения, вместе с тем встречалась у 3 (5,6%) пациенток основной группы.
Среди обследуемого контингента обращает на себя внимание большой процент женщин, у которых были выявлены инфекции мочевыводящих путей. Наиболее часто встречался пиелонефрит, который был в контрольной группе у 3 (8,1%), в группе сравнения у 7 (8,9%), а в основной у 4 (7,4%.) пациенток.
Кроме того, часто встречались заболевания желудочно-кишечного тракта: хронический гастрит (контрольная группа 8,1%, группа сравнения 8,9%, основная группа 7,4%), хронический холецистит (контрольная группа 2,7%, основная группа 1,9%), желчекаменная болезнь (группа сравнения 1,3%).
Структура экстрагенитальной патологии у пациенток обследованных групп. Обращает на себя внимание высокий процент произведенных аппендэктомий у обследованных пациенток: контрольная группа - 5 (13,5%), группа сравнения - 7 (8,9%), основная группа - 2(3,7%).
Среди заболеваний сердечно-сосудистой патологии преобладали вегето-сосудистая дистония (10,8% в группе сравнения, 10,1% в группе сравнения и 5,6% основной группы) и гипертоническая болезнь (2,7%, 5,0% и 3,7% соответственно).
Обращает на себя внимание высокая частота встречаемости метаболических нарушений. Так у 7 (8,9%) пациенток группы сравнения диагностировано ожирение, в контрольной и основной группах по 5,4% и 5,6% соответсственно. Дефицит веса еще чаще имел место у пациенток с осложненным течением беременности (11,4% в группе сравнения и 9,2% в основной группе).
Полученные данные о частоте и характере экстрагенитальной патологии у обследованных пациенток позволяют сделать вывод о том, что все беременные с явлениями угрозой прерывания, и особенно с неразвивающейся беременностью имеют высокие показатели инфекционного индекса. По мнению большинства авторов , именно инфекция - один из ведущих факторов в прерывании беременности. Вирусные, бактериальные заболевания могут приводить к анэмбрионии, неразвивающимся беременностям, самопроизвольным выкидышам, антенатальной гибели плода, а также к порокам развития плода, внутриутробной инфекции, проявляющейся в постнатальном периоде.
Полученные результаты исследования свидетельствуют о низком уровне соматического здоровья женщин репродуктивного возраста в популяции. Только каждая пятая (21,6%) пациентка контрольной группы, куда согласно дизайну исследования и критериям включения были отнесены клинически здоровые беременные женщины, не имела экстрагенитальной патологии.
Достоверно более высокая частоты соматической патологии у пациенток с осложненным течением беременности подчеркивает значимость этого фактора в этиологии невынашивания беременности. Очевидным является значимость мер, направленных на улучшение здоровья населения и пропаганды здорового образа жизни, в решении демографических проблем в стране. Таким образом, проблема невынашивания беременности не может быть решена только усилиями акушеров-гинекологов, эта проблема комплексная и требует участия специалистов других специальностей.
Всем пациенткам обследованных групп проводился анализ менструальной функции, который показал, что начало менструальной функции у всех пациенток было в возрасте от 11 до 15 лет и соответствует физиологическим характеристикам. Средний возраст менархе в контрольной группе составил 12,1± 2,8 лет, в группах основной и сравнения 12,5± 1,9 и13,1± 2,6соответственно. Достоверных различий по продолжительности менструального цикла, который составил 27,3 ± 4,12 дней у пациенток контрольной группы, 28,2 ± 2,9 дня у женщин группы сравнения и 28, 1 ± 2,3 дня в основной группе, выявлено не было. Жалобы на болезненные менструации предъявляли 9 (25%) женщин контрольной группы, каждая шестая (13,2%) пациентка группы сравнения и 17,4% в основной группе. Нарушения менструального цикла в виде задержек менструаций отмечали 3 (8,3%) пациентки контрольной группы, 9 (11,4%) и 6 (11,1%) женщин в группах сравнения и основной.
Таким образом, особенности менструальной функции у пациенток основной группы практически не отличались от таковой в группе сравнения. Сроки начала половой жизни у пациенток контрольной группы колебались от 14 до 23 лет и в среднем составил 16,6 лет ± 2,15. Полученные данные свидетельствуют, что во всех группах обследованных пациенток средний возраст полового дебюта составил 16-18 лет, таким образом, в большинстве случаев начало половой жизни было до вступления в брак. На наш взгляд, этот факт заслуживает особого внимания и обсуждения. Очевидно, что это не только и не столько медицинская проблема, только объединение усилий педагогов, психологов и медицинских работников позволит сформировать правильное отношение девушек к своему репродуктивному здоровью.
Актуальность этой проблемы подтверждает тот факт, что среди пациенток, обратившихся к гинекологу с целью прерывания нежеланной беременности 14 (37,8%)не состояли в регистрированном браке. Даже ряд пациенток основной и группы сравнения, у которых была желанная беременность, также жили половой жизнью вне регистрированного брака. В группах сравнения и основной подавляющее большинство пациенток (89,5%) состояли в зарегистрированном браке, среди женщин контрольной группы замужем были только 23 (62,2%).
Отсутствие четкой концепции по вопросам полового воспитания с акцентом на семейные ценности приводит к ухудшению репродуктивного здоровья поколения, вступающего в детородный период, и снижает репродуктивный потенциал, что в условиях демографического кризиса в стране приобретает социальную значимость.
Результаты дифференцированной тактики ведения беременных с угрозой прерывания, основанной на разработанных критериях диагностики данной патологии
В программных документах, определяющих актуальные направления развития современной медицинской науки, указывается, что приоритетными в области патологической физиологии, иммунологии, акушерства и гинекологии являются исследования, направленные на снижение материнской, перинатальной и детской смертности, повышение эффективности лечения невынашивания беременности, профилактики бесплодия.
Проблема невынашивания беременности продолжает оставаться чрезвычайно актуальной не только в клиническом, но и в социальном аспекте. Медико-демографическая ситуация в России остается крайне напряженной. Состояние репродуктивного потенциала страны характеризуется нарастающими негативными тенденциями. Только каждый пятый (9,7%) житель страны сегодня – подросток или ребенок, при этом доля населения старше трудоспособного возраста прогрессивно растет, превышая в 1,4 раза таковую для лиц моложе трудоспособного возраста. [13,76,87,171]. Становится очевидным необходимость принятия ряда экстренных мер по улучшению демографической ситуации в стране, среди которых немаловажными являются мероприятия по охране репродуктивного здоровья женщин, начиная с детского и подросткового возраста.
Анализ современной ситуации не позволяет прогнозировать улучшение также потому, что поскольку в первые десятилетия нового века в активную фазу репродукции вступает популяция женщин, имеющая серьезные проблемы с репродуктивным здоровьем. Высокая частота встречаемости гинекологической и соматической патологии среди женщин фертильного возраста в последние годы приводит к повышению частоты осложнений беременности и родов, различных нарушений репродуктивного здоровья [8,27,39,115,119,140].
В России происходит ежегодно до 170000 самопроизвольных выкидышей, практически теряется каждая пятая беременность, причем до 80% репродуктивных потерь приходится на I триместр [148,108,136, 150,228,229]. На самом деле число женщин с невынашиванием беременности может быть несколько выше, так как часть самопроизвольных выкидышей происходит еще до обращения женщины к гинекологу в связи с фактом беременности [129,133,138]. Около 1-2% женщин страдают привычным невынашиванием беременности.
Среди причин преждевременного прерывания беременности одно из лидирующих мест занимают воспалительные заболевания [110,116,270]. Однако в 50% случаев причина выкидыша оказывается неустановленной [235,266]. Поэтому изучение причин невынашивания беременности до сих пор является одной из актуальных проблем в акушерстве и гинекологии. В настоящее время большое количество исследований посвящены изучению роли хронического эндометрита в невынашивании беременности. Хронический эндометрит в генезе самопроизвольных выкидышей раннего срока играет безусловную роль, кроме того, пациентки с хроническим эндометритом имеют достоверно более низкую частоту имплантации эмбриона по сравнению с пациентками с нормальным эндометрием (11% и 58% соответственно) [54,55,222].
В последнее десятилетие все большее внимание исследователей привлекают иммунные нарушения как причина невынашивания беременности в ранние сроки. Одна гипотез, объясняющих механизм иммунологически обусловленного невынашивания беременности, предполагает наличие нарушений в ТН1 типе иммунного ответа, где важную роль играет уровень TNF. Согласно этой гипотезы заключается в том, что плод может выступать в качестве мишени для локальной клеточной иммунной реакции, кульминацией которой является прерывание беременности. Так, повышенный уровень TNF и IL в периферической крови обнаруживается только у женщин с невынашиванием беременности по сравнению с женщинами с нормальной репродуктивной функцией. В среднем у 60–80 % небеременных женщин, перенесших несколько спонтанных выкидышей выявляются нарушения ТН1 типа иммунного ответа на антигены трофобласта, в то время как у нормально вынашивающих беременность женщин наблюдаются такие изменения менее чем у 3 %.
Таким образом, в настоящее время накоплено достаточно сведений о значимости иммунного дисбаланса в генезе невынашивания беременности, однако, в основном они посвящены приобретенным звеньям иммунитета. О роли врожденного иммунитета в функционировании репродуктивной системы женщины как при физиологическом ее состоянии, так и при возникновении ее нарушений, в частности невынашивании беременности, в литературе имеются лишь отдельные данные.
Впервые TLR был описан только в 1985 году Кристианой Нюсляйн Фольхард у дрозофилы [275]. Изучая многообразные эффекты выявленных рецепторов у дрозофил, исследователь назвала это удивительным (нем. «toll»), и этим дала название всей группе. По мнению других авторов Toll-подобные рецепторы (TLR) получили свое название от английского слова, которое переводится как «колокольчик у входной двери», подчеркивая, что это первая сигнальная система организма [170,241,301]. В настоящее время Toll-подобные рецепторы рассматриваются как одни из ключевых молекул, приводящих в готовность иммунную систему к микробному вторжению.У млекопитающих описаны 13TLR, из них у человека встречаются 10. В последние годы появляются ряд работ, посвященные изучению показателей врожденного иммунитета в репродуктивном тракте женщины. Эффекторные клетки врожденного иммунитета женских половых путей экспрессируют все 10 типов TLR, каждый из которых связывается со специфическим лигандом [283,291], что приводит к выработке цитокинов и антимикробных пептидов.
