Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль флюоресцентной диагностики в гинекологии 14
1.1 Теоретические основы флюоресцентой диагностики 14
1.2 Клиническое применение аутофлюоресцентной спектроскопии 18
1.3 Преимущества использования флюоресцентной диагностики
с 5-аминолевулиновой кислотой в гинекологии 28
ГЛАВА 2. Экспериментально-клинические исследования (материалы, методы и результаты собственных исследований) 44
2.1 Аутофлюоресценция тканей органов женской репродуктивной системы ex vivo 44
2.2 Флюоресцентная спектрометрия Аласенс-индуцированного Пп IX в половых органах и органах брюшной полости экспериментальных животных 52
2.3 Способ внутриматочного подведения лазерного излучения 57
ГЛАВА 3. Интраоперационная флюоресцентная диагностика с препаратом аласенс (материалы и методы исследования) 63
3.1 Клиническая характеристика больных 63
3.2 Характеристика методов обследования больных и диагностического оборудования 66
3.3 Методика проведения флюоресцентной диагностики при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей 68
3.4 Методика обработки результатов флюоресцентной спектроскопии 70
ГЛАВА 4. Результаты флюоресцентной спектроскопии при гинекологических заболеваниях с препаратом аласенс ... 73
4.1 Спектрометрические диагностические критерии при эндометриозе, доброкачественных и злокачественных заболеваниях яичников, тела и шейки матки, вульвы 73
4.2 Оценка эффективности метода флюоресцентной спектроскопии в диагностике эндометриоза, злокачественных и предраковых гинекологических заболеваниий 98
4.3 Оптимизация методик измерения спектров флюоресценции 104
Выводы 129
Практические рекомендации 131
Список литературы 132
- Теоретические основы флюоресцентой диагностики
- Аутофлюоресценция тканей органов женской репродуктивной системы ex vivo
- Клиническая характеристика больных
- Спектрометрические диагностические критерии при эндометриозе, доброкачественных и злокачественных заболеваниях яичников, тела и шейки матки, вульвы
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время в медицине накоплен огромный опыт диагностики и лечения онкологических заболеваний, который позволяет оценить важность и сложность своевременной диагностики рака и предраковых заболеваний. Эффективный диагностический поиск на ранних этапах гинекологической патологии способствует сохранению генеративной функции, улучшению качества жизни женщины, профилактике злокачественных заболеваний, а при наличии новообразований - повышает вероятность благоприятного прогноза. Многие методы визуализации (ультразвуковое сканирование, цветное допплеровское картирование, кольпомикроскопия, кольпоцервикоскопия, гистероскопия, лапароскопия, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, радиоизотопные исследования), иммунологические (включая онкомаркеры, тест на опухолевый рост), цитогенетические и другие исследования уже произвели революцию в диагностике и лечении рака и предраковых заболеваний шейки и тела матки, вульвы и яичников, но не решили всех проблем [3, 4, 14, 15]. Разработка новых методов диагностики обусловлена необходимостью точных, быстро осуществимых диагностических критериев глубины, границы, особенностей роста онкопатологии, выявления наличия и распространенности метастазов.
Арсенал методов интраоперационной диагностики в гинекологии (визуальный осмотр, в том числе при эндоскопических исследованиях, пальпация, срочное морфологическое исследование) в полной мере не удовлетворяет хирургов, поскольку нередки ошибочные заключения как срочного гистологического или цитологического исследований, так и зрительного или пальпаторного осмотра, что влечет за собой принятие неадекватных решений на этом самом ответственном этапе диагностики.
Трудно переоценить значимость выявления и дифференциальной диагностики новообразований яичников. Рак яичников является одной из
наиболее сложных проблем онкогинекологии: скрытое течение на первых этапах приводит к тому, что 80% больных раком яичников поступают в онкологические учреждения с III-IV стадиями процесса, и длительность их жизни в значительной степени коррелирует с возможностью максимального выявления и удаления первичной опухоли и метастазов. Информативность интраоперационного морфологического исследования при пограничных опухолях яичников в сопоставлении с окончательным гистологическим исследованием, по данным некоторых авторов, составляет 45% [8].
Скрининг рака шейки матки и его предшественников основывается на диагностической кольпоскопии, морфологических исследованиях, выявлении инфекционных агентов, особенно вируса папилломы человека [5, 10]. Несмотря на уменьшение частоты рака шейки матки в странах с хорошими скрининговыми программами, известными проблемами остаются ложноотрицательные результаты цитологического исследования и низкая специфичность кольпоскопии, требующие высокой компетентности специалистов [115].
Диагностировать истинный предрак вульвы и влагалища - дисплазии -невозможно без инвазивной процедуры прицельной биопсии. Рак вульвы в структуре заболеваемости злокачественными опухолями женских половых органов занимает четвертое место (после рака тела матки, шейки матки и яичников) [32]. Рак наружных гениталий, наиболее доступный для ранней диагностики, примерно в половине случаев выявляется в III стадии с метастазами в пахово-бедренные, подвздошные лимфатические узлы, что требует выполнения тяжелой обширной операции [13].
Рост заболеваемости раком эндометрия за последние 10 лет составил 29,5%о [32]. Основной задачей клиницистов является выявление и своевременное лечение фоновых и предраковых состояний, при этом аблация эндометрия уже давно расценивается как альтернатива радикальному хирургическому лечению [28].
Частой клинической проблемой для женщин репродуктивного возраста является эндометриоз - второе по частоте заболевание репродуктивных органов, вызывающее бесплодие, боли и нарушение менструального цикла, требующее нередко повторных хирургических вмешательств. Диагностика аденомиоза при гистероскопии довольно сложна, и окончательный диагноз можно поставить только после гистологического исследования. Наружный генитальный эндометриоз клинически диагностируют на основании визуального осмотра. Однако эндометриоз может быть представлен очень изменчивыми формами, в результате чего нераспознанные очаги могут вести к рецидиву заболевания [2]. С этих позиций методы дополнительной визуализации эндометриоидных поражений являются перспективными и особенно актуальными для диагностики активного эндометриоза.
В связи с вышеизложенным, проблема ранней и уточняющей диагностики в гинекологии представляет значительный интерес, и в этом направлении идет поиск принципиально новых диагностических возможностей. Основное внимание в разработке методов диагностики нового поколения уделяется оптическим методам ввиду их высокой чувствительности, специфичности и неинвазивности. Существующие методы диагностики (рентгеновская, ультразвуковая, магнитно-резонансная) не позволяют обнаруживать рак на ранних стадиях или выявлять микрометастазы.
В последние 25 лет во всем мире интенсивно развиваются методы флюоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и целого ряда неопухолевых заболеваний [25, 26].
В настоящее время различают ау то флюоресценцию (эндогенную флюоресценцию), основанную на способности к флюоресценции веществ, входящих в состав тканей, и экзогенную флюоресценцию, суть которой заключается во введении больному фотосенсибилизаторов, обладающих свойством селективного накопления в быстропролиферирующих клетках и дающих более интенсивную флюоресценцию, чем аутофлюоресценция тканей.
Способностью к аутофлюоресценции обладают в основном следующие виды биологических молекул: триптофан, коллаген, эластин, НАД-Н, НАДФ-Н, флавины, порфирины. Их участие во многих сложных биохимических процессах в клетках обуславливает возможность выявления изменений в метаболизме клеток по анализу флюоресценции тканей. Изучение спектров аутофлюоресценции тканей - необходимый этап для последующего понимания и интерпретации спектров флюоресценции тканей, сенсибилизированных фотосенсибилизаторами, так как полученные результаты показывают, что при некоторых патологических состояниях наблюдается высокая интенсивность собственной флюоресценции за счет эндогенных флюорохромов [6, 131, 142].
Флюоресцентная диагностика с использованием фотосенсибилизаторов позволяет выявлять невидимые глазом патологические очаги с повышенной пролиферативной активностью. Кроме того, она необходима для обоснования проведения фотодинамической терапии и контроля эффективности лечения.
Флюоресцентная диагностика осуществляется методом спектрального анализа тканей организма. Оптическое зондирование основано на селективном возбуждении флюоресценции в тканях лазерным излучением или другим источником света определенной длины волны. Для этих целей используют как эндогенные, так и экзогенные фотосенсибилизаторы. Селективность их распределения в организме обеспечивается за счет биохимических и физиологических различий тканей и свойств межклеточной среды. Спектроскопический анализ флюоресцентных сигналов позволяет отличать здоровые и патологические биоткани друг от друга, при этом моментальная обработка получаемой информации позволяет корректировать тактику лечебного воздействия.
Одной из актуальных задач в проблеме ФД является поиск оптимального фотосенсибилизатора. Такие широко использующиеся в клинической практике фотосенсибилизаторы, как фотогем, фотофрин, фотосенс, накапливаются и длительное время сохраняются в коже, что сопряжено с риском развития фототоксических реакций и требует соблюдения светового режима.
5 -5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК) и созданный на ее основе препарат Аласенс не являются фотосенсибилизаторами, но индуцируют в клетках синтез протопорфирина IX (Пп IX), обладающего интенсивной флюоресценцией и фотодинамической активностью. Биологической основой флюоресцентной диагностики является высокое накопление Пп IX в быстропролиферирующих клетках и быстрая утилизация его в нормальных клетках. Результатом этого является высокий флюоресцентный контраст между патологической и окружающей здоровой тканью. Быстрая продукция Пп IX и быстрая утилизация его в нормальных клетках путем превращения в фото-неактивный гем (что практически исключает кожную фототоксичность) обусловили широкие клинические исследования возможностей метода ФД с 5-АЛК [41].
Высокая информативность метода флюоресцентной диагностики с 5-АЛК доказана в мировой и отечественной практике при выявлении раннего рака мочевого пузыря [21, 101]. Опубликованные работы показали эффективность ФД с 5-АЛК в нейрохирургии [68, 85], в дифференциальной диагностике заболеваний полости рта [105], легких [87], желудка [7], пищевода [96], молочной железы [102], кожи [145].
В литературе описаны работы по флюоресцентной диагностике с 5-АЛК рака яичников [109], цервикальной интраэпителиальной неоплазии [83], кондилом, дисплазий вульвы и влагалища [63], эндометриоидных очагов [ПО].
Основными проблемами при использовании методов флюоресцентной диагностики в гинекологии являются определение концентрации фотосенсибилизатора в ткани, разработка диагностических критериев, подведение светового излучения к ткани и обеспечение необходимой плотности излучения.
Известно, что синий и зеленый свет, используемый зарубежными авторами для возбуждения флюоресценции и получения флюоресцентного изображения, хорошо поглощается гемоглобином крови, что не только уменьшает глубину исследования тканей (до 0,5 мм), но и приводит к ошибкам в определении реальной концентрации протопорфирина IX вследствие разной насыщенности
гемоглобином исследуемых тканей. Это послужило основанием для проведения исследований по определению спектрального состава флюоресценции. Нами была выбрана методика измерения спектров флюоресценции, индуцированной красным лазерным излучением (длина волны 633 нм), при этом глубина оптической биопсии тканей составляет 1-3 мм [164].
Методы доставки лазерного излучения в полость матки сложны из-за анатомической формы полости матки [42, 146]. Необходимость осуществления равномерного облучения эндометрия важна для оценки интенсивности флюоресценции всей поверхности эндометрия и обоснования проведения фотодинамической аблации эндометрия.
Ввиду вышеизложенного, с целью увеличения диагностических возможностей в гинекологической практике проведено исследование эффективности флюоресцентной диагностики при различных заболеваниях женской репродуктивной системы, изучены особенности проведения и интерпретации результатов флюоресцентной спектроскопии.
Цель работы
Повышение эффективности ранней и дифференциальной диагностики гинекологических заболеваний с помощью метода лазерной флюоресцентной спектроскопии с препаратом Аласенс.
Основные задачи исследования:
Проанализировать результаты флюоресцентной спектрометрии тканей половых органов у экспериментальных животных в зависимости от времени после перорального введения Аласенса. Разработать в эксперименте способ внутриматочного подведения лазерного излучения для анализа состояния эндометрия методом флюоресцентной спектроскопии.
Оценить спектроскопические данные собственной флюоресценции тканей органов женской репродуктивной системы и флюоресценции Аласенс-индуцированного протопорфирина IX (Пп IX) в норме и при эндометриозе, доброкачественных и злокачественных заболеваниях яичников, вульвы, шейки и тела матки.
Провести анализ результатов флюоресцентной спектрометрии в зависимости от особенностей гормонального статуса организма (фазы менструального цикла, возрастных особенностей, приема гормональных препаратов или наличия гормонально-активных новообразований).
Оптимизировать методики проведения флюоресцентной диагностики при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.
Провести сравнение результатов спектрального анализа тканей в зависимости от характера патологического процесса и оценить эффективность метода флюоресцентной спектроскопии в диагностике эндометриоза, рака и предраковых гинекологических заболеваний.
Научная новизна.
Впервые предложен метод интраоперационной экспресс-диагностики злокачественных, пограничных и доброкачественных опухолей яичников, основанный на спектроскопическом исследовании свойств тканей с 5-аминолевулиновой кислотой.
Впервые изучены диагностические возможности метода флюоресцентной спектроскопии для уточнения характера и распространенности гинекологической патологии на основе регистрации флюоресценции 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX при возбуждении лазерным излучением (633 нм).
Предложены новые методики измерения флюоресценции биопсийного материала для диагностики патологических процессов.
Экспериментально обоснован способ измерения интенсивности флюоресценции эндометрия с использованием интралипида для анализа состояния эндометрия методом флюоресцентной спектроскопии.
Практическая значимость.
Определены спектрометрические критерии злокачественных и доброкачественных процессов яичников, шейки и тела матки, вульвы, а также метастатических поражений методом оптической экспресс-диагностики.
Выявлена зависимость результатов спектрального анализа тканей от
характера пролиферативного патологического процесса,
морфофункциональных особенностей исследуемых нормальных тканей и эндометриоидных гетеротопий.
Определены показания к флюоресцентной диагностике при различных гинекологических заболеваниях.
Разработаны методики проведения флюоресцентной диагностики при
лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем
гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.
Разработан в эксперименте способ внутриматочного подведения лазерного излучения, позволяющий анализировать интенсивность интегральной флюоресценции эндометрия.
Определены наиболее перспективные направления использования метода флюоресцентной диагностики с препаратом Аласенс в гинекологии.
Положения, выносимые на защиту.
Лазерная флюоресцентная спектрометрия с 5-аминолевулиновой кислотой при возбуждении флюоресценции лазерным излучением (633 нм) позволяет прижизненно, в реальном масштабе времени дифференцировать злокачественные опухоли гениталий (яичников, шейки матки и вульвы) от доброкачественных опухолей и нормальных тканей, а также выявлять метастазы.
Разработанная методика измерения флюоресценции биопсийного материала повышает достоверность диагностики патологических процессов в гинекологии.
Спектроскопический способ измерения интенсивности флюоресценции эндометрия с использованием интралипида позволяет определять уровень накопления фотосенсибилизатора для анализа состояния эндометрия.
Внедрение в практику. Метод лазерной флюоресцентной интраоперационной спектроскопии внедрен в практику гинекологических отделений Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Главного клинического госпиталя МВД России.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 печатных работ, в том числе 10 в центральной печати, 9 в зарубежной печати.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы экспериментально-клинических исследований, описания материалов и методов, результатов интраоперационной флюоресцентной диагностики, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 36 отечественных и 137 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 6 клиническими примерами, 46 рисунками и 12 таблицами.
Клиническая часть работы выполнена на базах кафедры репродуктивной медицины и хирургии факультета последипломного образования Московского государственного медико-стоматологического университета.
Благодарность: автор сердечно благодарит своего научного руководителя: академика РАМН Л.В. Адамян - заведующую кафедрой репродуктивной
медицины и хирургии факультета последипломного образования Московского
государственного медико-стоматологического университета,
к.ф.-м.н. В.Б. Лощенова - заведующего лабораторией лазерной
биоспектроскопии Центра естественно-научных исследований Института
общей физики РАН,
сотрудников гинекологических отделений Российского онкологического
научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Главного клинического госпиталя
МВД России, клиники акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева
Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова,
сотрудников лаборатории лазерной биоспектроскопии
за неоценимую помощь и поддержку в проведении научной работы.
Теоретические основы флюоресцентой диагностики
Поиск новых методов диагностики обусловлен сохраняющимися нерешенными проблемами раннего выявления гинекологических заболеваний. Последние достижения в области медицинских технологий - спиральная компьютерная томография, магнитно-резонансная томография - обеспечивают получение изображения практически любого органа и ткани с большим разрешением в двух- и трехмерном измерениях. Кроме того, магнитно-резонансная спектроскопия и позитронная эмиссионная томография позволяют регистрировать и изучать локальные физиологические процессы и метаболизм тканей in vivo. Перспективным методом получения изображения микроструктур биоткани является оптическая когерентная томография.
Несмотря на современные технические возможности диагностики, нередко встречаются сложные ситуации в своевременном выявлении и дифференциальной диагностике гинекологических заболеваний.
Лазерная флюоресцентная диагностика (ФД) с применением фотосенсибилизаторов родилась на стыке квантовой физики, фотобиологии, фотохимии и медицинской практики и предоставляет принципиально новые диагностические возможности неинвазивного мониторинга биохимических изменений клеток тканей при трансформации нормальных клеток в диспластические и злокачественные, которые происходят раньше структурных перестроек [143]. Кроме того, ФД является необходимым этапом для обоснования проведения фотодинамической терапии (ФДТ) — метода лечения опухолевых и целого ряда неопухолевых заболеваний, который интенсивно развивается как в нашей стране, так и за рубежом.
В 1997 г. организаторы FIGO Всемирного конгресса в Копенгагене предоставили возможность встретиться специалистам по фотодинамической терапии в гинекологии. Это был первый шаг, чтобы привлечь внимание акушеров-гинекологов к возможности развития и клинического применения фотомедицины в гинекологии. А в 1998 г. В Цюрихе состоялся 1 Всемирный конгресс по фотомедицине в гинекологии, в котором приняло участие около 150 известных ученых и клиницистов.
Флюоресцентная диагностика - это современная медицинская технология, в основе которой лежит взаимодействие фотосенсибилизатора (ФС) и источника света определенной длины волны, соответствующей максимуму возбуждения фотосенсибилизатора. Флюоресцентная диагностика осуществляется методом спектрального анализа биологических тканей. Использование спектрального анализа в медицине преследует следующие цели: диагностика скрытых очагов опухоли по флюоресцентным и светорассеивающим свойствам тканей; определение скорости накопления фотосенсибилизатора в опухоли и здоровых тканях и скорости его выведения; оценка концентрации и состояния фотосенсибилизаторов как с целью диагностики, так и контроля за терапией, и осуществления наиболее рациональной тактики лечения; определение степени оксигенации крови и кровенаполнения в различных тканях [18, 107].
Основным достоинством спектрального анализа тканей является его неинвазивность. Это позволяет получать информацию о состоянии тканей без воздействия на динамику различных биологических процессов, происходящих в тканях в момент проведения диагностики и при последующем динамическом наблюдении. Другим достоинством оптического анализа тканей является возможность моментальной обработки данных, что позволяет корректировать параметры светового лечебного воздействия в соответствии с полученной информацией. К настоящему времени наибольшие успехи ФД получены в урологии, легочной онкологии, нейроонкологии [11, 21, 41, 68, 85, 87, 101]. ФД позволяет выявлять микроочаги новообразований и микрометастазы, в том числе множественные, невидимые при обычном освещении. Данная диагностическая техника адаптирована для эндоскопических исследований, что потенцирует эффективность лечения в целом. Изучение и развитие флюоресцентной диагностики невозможно без знаний физико-химических принципов, лежащих в основе явления флюоресценции. Молекула фотосенсибилизатора при поглощении света определенной длины волны переходит из основного состояния в короткоживущее синглетное возбужденное состояние. Затем происходит либо обратный переход в основное состояние, сопровождающийся излучением кванта света — флюоресценцией -большей длины волны, чем возбуждающего света, либо синглетная форма конвертируется в относительно долгоживущее триплетное возбужденное состояние. Дальнейшие реакции относятся к кислородзависимым фотодинамическим процессам, реализующимся при фотодинамической терапии, однако важно знать основной механизм деградации клеточных структур, который может инициироваться этими превращениями. Перенос энергии от возбужденного триплетного состояния фотосенсибилизатора на молекулы кислорода приводит к образованию синглетного кислорода, который в свою очередь дает нестабильные пероксиды с образованием продуктов деструкции субстрата и свободных радикалов [19, 31,35].
В соответствии с фотофизической схемой (рис.1), молекула фотосенсибилизатора подобна катализатору в продукции синглетного кислорода и может снова принимать участие в последующих актах процесса возбуждения. Однако фотосенсибилизатор также подвергается воздействию цитотоксических радикалов. При продолжающемся фотодеструктивном процессе происходит фотобличинг (уменьшение концентрации фотосенсибилизатора под действием света и вследствие этого уменьшение интенсивности флюоресценции) с образованием продуктов деградации фотосенсибилизатора [134]. Наличие фотобличинга (обесцвечивания) говорит о том, что идет активная генерация синглетного кислорода. Его отсутствие свидетельствует о недостаточности кислорода в облучаемом объеме или о том, что фотосенсибилизатор находится в химически связанном с белками или липидами ткани состоянии и изменил свою активность.
Аутофлюоресценция тканей органов женской репродуктивной системы ex vivo
Изучение проблемы собственной флюоресценции тканей гинекологических анатомических структур целесообразно с целью разработки самостоятельного метода аутофлюоресцентной диагностики. Кроме того, это необходимый этап для последующего понимания и интерпретации спектров флюоресценции тканей, сенсибилизированных эндо- и экзогенными фотосенсибилизаторами. Исследование проводилось ex vivo и носило поисковый характер. Материалы и методы. Аутофлюоресцентную лазерную спектроскопию выполняли в клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова под руководством д.м.н., профессора В.М Зуева и в отделении гинекологии Главного клинического госпиталя МВД России под руководством д.м.н., профессора, академика РАМН Л.В. Адамян. Исследование проводили на удаленном операционном материале 50 больных, которым была проведена операция лапаротомическим или лапароскопическим доступом. Специального обследования и подготовки больных для проведения спектрально-флюоресцентных измерений не требовалось. Операционный материал включал в себя матку, маточные трубы, яичники, на которых измерялись спектры собственной флюоресценции эндоцервикса, экзоцервикса, эндометрия, миометрия, серозного слоя матки, слизистого и серозного слоев маточных труб, их фимбриальных отделов, ткани яичников, а также ткани миом, эндометриоидных очагов, кист (эндометриоидных, фолликулярных) и доброкачественных опухолей яичников (серозная, эндометриоидная цистаденома, тератома), трубной беременности. Контролировалось, чтобы не использовалось предварительного воздействия электрической или термической энергии на ткани, подвергаемые спектральному анализу ex vivo. Исследование аутофлюоресценции нативных препаратов методом флюоресцентной спектроскопии проводили сразу же после гинекологических операций на лазерной электронно-спектральной установке LESA-01-"Biospec" (ЦЕНИ ИОФРАН, Москва, Россия). Основными компонентами ее являются источник лазерного излучения длиной волны 632,8 нм (выходная мощность 1-10 мВт) для возбуждения собственной флюоресценции тканей и спектроанализатор для приема флюоресценции и рассеянного лазерного излучения и последующего анализа (рис. 5). Более подробная характеристика и устройство данного диагностического оборудования будет дана в главе 3. Для подведения лазерного излучения к исследуемому объекту и передачи получаемого сигнала на спектроанализатор применялась волоконно-оптическая система. Система светофильтров обеспечивала регистрацию сигналов флюоресценции и рассеянного лазерного излучения одновременно в диапазоне 620-800 нм. Получаемая информация обрабатывалась с помощью специально разработанной программы компьютера [17]. Измерения осуществляли путем легкого соприкосновения дистального конца оптического волокна гелий-неонового лазера с исследуемыми тканями (в среднем по 20 точек). Спектры анализировали по форме и амплитуде сигнала. Полученная кривая аутофлюоресценции тканей представляет собой графическую зависимость интенсивности аутофлюоресценции от длины волны возбуждающего ее лазерного излучения. На всех получаемых графических изображениях присутствуют следующие основные компоненты: - ось абсцисс, градуированная от 600 до 800, по которой отложена длина волны возбуждающего лазерного излучения, выраженная в нанометрах (нм); - ось ординат, градуированная десятичными дробями или целыми значениями, по которой отложена интенсивность аутофлюоресценции в относительных единицах; - спектры аутофлюоресценции, которые имеют два основных "подъема": первый - лазерная кривая (характеризует рассеянное и отраженное лазерное излучение в области 624-642 нм), второй - кривая аутофлюоресценции (характеризует флюоресценцию эндогенных порфиринов в диапазоне 645-800 нм). Поскольку интенсивность флюоресценции определяется не только свойствами тканей, но и техническими характеристиками, в частности интенсивностью лазерного облучения, анализировались не абсолютные значения площади аутофлюоресценции, а ее отношение к площади лазерной кривой - коэффициенты аутофлюоресценции кф, последние отображались в виде гистофамм. Полученные значения нормированы относительно нормальной кожи руки, принятой за единицу. На каждой гистофамме по оси абсцисс пронумерованы точки исследованных тканей органов, ось ординат градуирована в соответствии с получаемыми для них нормированными значениями кф.
Клиническая характеристика больных
Интраоперационная диагностика методом лазерной флюоресцентной спектроскопии с 5-аминолевулиновой кислотой выполнена 85 гинекологическим больным на базе кафедры репродуктивной медицины и хирургии ФПДО Московского государственного медико-стоматологического университета (заведующая кафедрой - академик РАМН, профессор, д.м.н. Л.В. Адамян) в отделении гинекологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН (заведующий отделением - профессор, д.м.н. В.В. Кузнецов). У 44 пациенток наблюдалась сочетанная гинекологическая патология. Исследование проводилось во время лапаротомии, лапароскопии, гистероскопии и при наружно-внутреннем гинекологическом исследовании. Обследованные больные были в возрасте от 20 до 77 лет. Результаты флюоресцентной спектрометрии четырех пациенток были исключены из дальнейшего статистического анализа из-за промежутка времени меньшего, чем 3 часа или большего, чем 8 часов после введения фотосенсибилизатор-индуцирующего препарата. У 81 больной выявлена и гистологически подтверждена 141 патология. Средний возраст больных, включенных в статистический анализ, составил 47,71±2,81 лет. Общая характеристика больных приведена в таблицах № 2, 3 и рис. 22. Злокачественные новообразования по стадиям распределились следующим образом (TNM Classification of Malignant Tumours, 6 th edition, UICC, 2002): Рак яичников IА стадии (ТІ a N0 MO) - 2, II С ст. (T2c N0 МО) - 1, III А ст. (ТЗа N0 МО) - 1, IV ст. (ТЗа N0 Ml, ТЗс N0 Ml, ТЗс N1 Ml) -3; две пациентки имели предшествующее комбинированное лечение по поводу рака яичников III С ст. (ТЗС N0 МО) - 1 и I ст. - 1 (метастаз опухоли в культю шейки матки). У одной больной раком сигмовидной кишки IIIВ ст. (ТЗ N1 МО) имелся метастаз в яичник. Больным проводились общепринятые плановые предоперационные обследования и специальные инструментальные исследования, включающие: -опрос и клинический осмотр пациентки; - общие анализы крови и мочи; - биохимическое исследование крови; - исследование показателей системы свертывания крови; - исследование крови на заболевания, передающиеся половым путем; - анализ мазка на флору из влагалища и цервикального канала; - ультразвуковое исследование органов малого таза; - электрокардиография; - рентгенография легких. В дальнейшем, учитывая данные анамнеза заболевания, физикального, инструментального обследования больной, лабораторных исследований, формировалась диагностическая концепция (предварительный диагноз), и принималось решение о показаниях к интраоперационной лазерной флюоресцентной спектроскопии, результаты которой сравнивали с данными планового гистологического исследования удаленных органов и тканей. Всем оперированным пациенткам наряду с традиционно проводимым осмотром выполняли флюоресцентную диагностику. Анализ спектроскопических характеристик тканей проводился в реальном масштабе времени. Среднее время оптической экспресс-диагностики тканей составило 2 мин. Для проведения интраоперационной флюоресцентной диагностики гинекологических заболеваний помимо необходимых наборов хирургических инструментов и оборудования, аппаратуры для лапароскопии и гистероскопии использовалась лазерная электронно-спектральная установка LESA-01-"Biospec", совместного производства лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФРАН и "Биоспек" (Москва, Россия) (рис. 23). 1) Гелий-неоновый лазер длиной волны 632,8 нм, выходная мощность - 1-10 мВт. 2) Y-образный многоканальный волоконно-оптический зонд, представляющий собой систему, состоящую из двух частей - лазерная часть (используемая для подведения лазерного излучения к исследуемому объекту) и приемно-измерительная часть (регистрирующая флюоресценцию и рассеянное лазерное излучение и позволяющая передавать получаемый сигнал на регистрирующее устройство). Малый диаметр (1,8 мм) и гибкость позволяют вводить диагностическое волокно в операционный канал гистероскопа. 3) Система светофильтров, подобранная таким образом, чтобы сигнал флюоресценции и рассеянное лазерное излучение одновременно регистрировались в диапазоне 620-800 нм. 4) Портативный многоканальный спектральный анализатор, позволяющий проводить регистрацию спектра в ускоренном режиме в диапазоне длин волн от 400 до 850 нм одновременно по 3000 каналам. 5) Получаемая информация обрабатывалась на специализированной программе компьютера (настольного, либо типа Notebook) в операционной среде Microsoft Windows 98/2000/ХР. Принцип работы лазерной электронно-спектральной установки можно представить следующим образом. Свет от лазерного источника фокусируется на входной конец Y-образного волоконно-оптического зонда и передается по нему к исследуемому объекту. Флюоресцентный и рассеянный свет поступает по 6 приемным волокнам волоконно-оптического зонда, которые окружают центральное волокно для доставки света. Выходной конец зонда соединен со спектроанализатором, причем приводящие волокна здесь расположены не по кругу, как на приемном конце зонда, а в ряд, что позволяет увеличить разрешающую способность. Принимаемый спектроанализатором сигнал подвергается аналогово-цифровому преобразованию, передается в оперативную память компьютера и отображается на дисплее в реальном масштабе времени в_ виде кривой. Такая компактная и мобильная система позволяет получать спектр отраженного лазерного излучения и флюоресценции тканей с интервалом 0,1 сек., что достаточно для мониторинга в реальном масштабе времени. 3.3 Методика проведения флюоресцентной диагностики при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей Флюоресцентная диагностика проводилась с препаратом Аласенс. Характеристика Аласенса: это Российский препарат, созданный на основе 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) в ФГУП ГНЦ "НИОПИК". Активная субстанция - гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты, выпускается в виде лиофилизированного порошка. Препарат хорошо растворим в воде, частично -в этаноле и метаноле, рН водного 1% раствора - 2,2 - 3,2.
Спектрометрические диагностические критерии при эндометриозе, доброкачественных и злокачественных заболеваниях яичников, тела и шейки матки, вульвы
НОРМАЛЬНЫЕ ТКАНИ. Обработка результатов спектрального анализа показала минимальное накопление протопорфирина IX в нормальной брюшине: кф=2,25±0,29 (р 0,05), в серозном покрове матки: кф=3,09±0,44 (р 0,05), маточных труб: кф=3,52±0,51 (р 0,05) и в нормальной ткани яичников: кф=3,05±0,35 (р 0,05). Это позволит при разработке метода панорамной флюоресцентной визуализации сравнивать норму с патологически яркой флюоресценцией. Обнаружено высокое накопление Аласенс-индуцированного Пп IX в фимбриальном отделе маточных труб: кф=16,84±2,90 (р 0,05). При спектральном анализе получено различие в накоплении Пп IX в нормальном эндометрии: кф=11,66±1,24 (р 0,05) по сравнению с миометрием: кф=3,38±0,40 (р 0,05) - в 3,5 раза (рис.25). Корреляционной зависимости результатов флюоресцентной спектрометрии от фазы менструального цикла, а также наличия или отсутствия у пациенток менструальной функции не обнаружено. Следует отметить один случай нехарактерно высокого значения кф -17,7 -внешне нормальной ткани яичников у одной больной эндометриозом яичников и брюшины позадиматочного пространства, которая постоянно принимала Диане-35 (более года), и даже в день операции прием препарата не был прекращен. Интенсивность флюоресценции была повышена не только по сравнению с нормальной тканью яичников (в норме средний кф=3,0), но даже по сравнению с эндометриозом яичников, при котором средний кф=6,4. Таким образом, прием гормональных препаратов, очевидно, может влиять на спектрально-флюоресцентные результаты исследований. ри эндометриоидных кистах или других кистах с кровоизлиянием иногда наблюдаются более высокие значения кф, обусловленные вкладом собственной флюоресценции, при этом форма спектров характерно отличается от формы спектров Пп IX смешением максимума флюоресценции в область 670 им (рис. 27). У одной больной была обнаружена гранулезоклеточная опухоль яичника на фоне аденокарциномы эндометрия. Коэффициент флюоресценции - 12,03 -был повышен по сравнению со средним значением кф (2,6) доброкачественных образований яичников. Возможно, это связано с гормональной активностью опухоли. Известно, например, что ткани щитовидной железы характеризуются высокой собственной флюоресценцией. 76 Из 9 обследованных больных раком яичников у двоих не было патологического процесса в яичниках, так как в анамнезе пациентки имели комбинированное лечение по поводу основного заболевания. Однако результаты интраоперационного флюоресцентного спектроскопического исследования тканей этих больных не были исключены из сводного анализа полученных данных вследствие их несомненного интереса. У одной больной имелся метастаз рака яичников в культю шейки матки: кф - 22,7, тогда как кф интактной ткани был 8,13. Другая больная была прооперирована с подозрением на метастаз рака яичников в сальник (по данным УЗИ, диагностической лапароскопии); при гистологическом исследовании удаленного большого сальника было дано заключение, что опухолевые узлы соответствуют липогранулеме, при этом кф - 9,6 отличается от спектрометрических значений нормального сальника: средний кф=3,4 и метастазов в сальнике: средний кф=29,0. Приведем клиническое наблюдение больной Л., 61 года, № истории болезни 03/12752. Поступила в отделение онкогинекологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина 10.07.03 с жалобами на слабость, субфебрильную температуру, тянущие боли внизу живота. История заболевания: В V-2003 г. по поводу длительной субфебрильной температуры, бронхита и неэффективности антибиотикотерапии обследовалась в МОНИКИ. При УЗИ органов малого таза и брюшной полости обнаружено образование, исходящее из малого таза справа около 20 см в диаметре резко неоднородной структуры за счет участков как пониженной, так и повышенной эхогенности, а также участков распада. СА-125 — 363 МЕ/мл. Больная была направлена в РОНЦ для дообследования и лечения. Анамнез: Менструации с 12 лет, постменопауза 14 лет. Беременности — 1, роды - 1. Перенесенные и сопутствующие заболевания: удаление кисты перикарда в 1981г. Недостаточность митрального клапана. Варикозная болезнь нижних конечностей. Гипертоническая болезнь II ст. Гинекологический статус при поступлении: шейка матки приподнята кверху, эксцентрична, резко укорочена. Ректовагинально: матки небольших размеров, в едином конгломерате с двусторонними опухолями яичников. Образование полностью выполняет малый таз с выходом в брюшную полость; конгломерат имеет крупнобугристую поверхность, практически неподвижен, размеры примерно 10x16x23см. Перед операцией проведены следующие параклинические методы обследования: Общий анализ крови и мочи в норме, биохимическое исследование крови без отклонений от нормальных показателей. Анализ крови на опухолевые маркеры СА-125 - 447 (норма до 35 МЕ/мл), РЭА - 0,5 (норма 0-2,5) нг/мл, СА-19-9 - 246,1 (норма 0-37) Е/мл, АФП - 1,1 (0-15) МЕ/мл. УЗИ органов малого таза и брюшной полости: печень не увеличена, структура без очаговых изменений. Почки обычных размеров, ЧЛС не расширена. Забрюшинные лимфоузлы не определяются. В малом тазу, больше справа с распространением в брюшную 80 полость, определяется объемное образование кистозно-солидной структуры, размером 22x20 см. В полости малого таза свободной жидкости не определяется. Ro-исследование толстой кишки: контрастирована вся толстая кишка, верхняя треть прямой кишки правая ее стенка неравномерна сдавлена извне, вероятно, спаяна с внекишечным образованием. Вся дистальная половина толстой кишки фиксирована, смещена влево, на отдельных участках спаяна. Эзофагогастродуоденоскопия: заключение - эзофагит, очаговый атрофичный гастрит. Цистоскопия патологических изменений не выявила. Экскреторная урография: отток по правому мочеточнику затруднен на уровне бифуркации правых подвздошных сосудов. Умеренно выражена гипотония полостей правой почки. Мочеточники в тазовых отделах смещены латерально. При лапаротомии обнаружена крупно-бугристая опухоль, размерами 25x20x15 см, исходящая из правых придатков, яичник атрофичен, с бугристой поверхностью; выпот в брюшной полости. Методом интраоперационной лазерной флюоресцентной спектроскопии в тканях обоих яичников выявлена высокая интенсивность Аласенс-индуцированного Пп IX, характерная для рака яичников: кф — 79,2; 77Б08; низкий кф - 4- единичного узла в большом сальнике, подозрительного на метастаз, свидетельствовал об отсутствии патологических изменений в сальнике (подтверждено плановым гистологическим исследованием). Проведена операция в объеме экстирпации матки с придатками, удаления большого сальника.
