Содержание к диссертации
Введение
Глава I Неудачи ЭКО и материнская тромбофилия (Обзор литературы) стр. 10
1.1. Взаимосвязь между неудачами ЭКО и спектром материнской тромбофилии стр. 10
1.2. Основные принципы подготовки к беременности женщин с тромбофилией и неудачами ЭКО стр. 33
Глава II Общеклиническая характеристика больных. Материалы и методы исследования стр. 39
2.1. Клиническая характеристика обследованных пациенток стр. 39
2.2. Методы исследования стр. 49
Глава III Структура тромбофилии у женщин с бесплодием (неясного генеза) неудачами ЭКО стр. 63
Глава IV Основные принципы профилактики повторных неудач ЭКО и выкидышей у женщин с тромбофилией стр. 80
Глава V Обсуждение полученных результатов стр. 97
Выводы стр. 122
Практические рекомендации стр. 124
Список литературы
- Основные принципы подготовки к беременности женщин с тромбофилией и неудачами ЭКО
- Клиническая характеристика обследованных пациенток
- Методы исследования
- Основные принципы профилактики повторных неудач ЭКО и выкидышей у женщин с тромбофилией
Основные принципы подготовки к беременности женщин с тромбофилией и неудачами ЭКО
Проблема бесплодного брака, как нашей стране, так и за рубежом приобрела в настоящее время не только медицинское, но и огромное социально-демографическое значение. Сегодня, по данным ВОЗ, частота бесплодного брака составляет 10-15% от числа супружеских пар и имеется тенденция к росту этого показателя. В некоторых регионах России, и по данным ряда эпидемиологических исследований, эти цифра каждым годом увеличивается и приближается в настоящее время к 20%. В нашей стране это проблема приобретает особую остроту в связи с прогрессивным снижением рождаемости в последнее десятилетие [2, 10, 34, 57, 61, 68].
Активное внедрение в клиническую практику программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона (ЭКО и ПЭ) делает актуальным повышение её эффективности и безопасности для здоровья матери и будущего ребёнка [38]. В связи с этим целесообразно проанализировать причины неэффективности попыток ЭКО у женщин с бесплодием, обусловленным тромбофилиями и разработать новые методы подготовки этих пациенток к проведению программы ЭКО.
ЭКО - оплодотворение яйцеклетки In Vitro. Впервые в 1944 г. с помощью этого метода J.Rock и M.Melkin добились развития 2-х клеточного эмбриона. Но только в 1978 г. английские учёные Роберт Эдварде и Патрик Стептоу произвели ЭКО женщине, не имевшей маточных труб, в результате чего родился первый в мире ребёнок, зачатый в «пробирке» [12, 29, 36, 57]. В России впервые метод ЭКО и ПЭ был внедрён в 1986 г. в НЦ АГиП РАМН. По мере увеличения количества применяемых технологий, этапности и повышения сложности, стало, принято говорить не о методе, а о программе ЭКО [29,33].
Многочисленные исследования, посвященные изучению физиологии и патологии системы гемостаза, пополнили сведения о механизмах различных видов тромбообразования, выявили ранее неизвестные наследственные дефекты системы гемостаза (тромбофилии) и различные иммунные формы тромбозов. По данным литературы, около 30,0% населения имеют генетические формы тромбофилии. Доказана важная роль этих нарушений в патогенезе различных видов патологии у матери и плода, привычном невынашивании беременности [3, 25, 37, 42, 54].
При наличии генетических и приобретённых (АФС) форм тромбофилии могут иметь место субклинические аборты, что маскируется в виде бесплодия неясного генеза. У пациенток с бесплодием неясного генеза и неудачами ЭКО (при исключении всех других возможных причин бесплодия и неудач ЭКО) необходимо обследование на наличие скрытой тромбофилии, поскольку «бесплодие» в таких случаях может быть обусловлено ранними преэмбрионическими потерями вследствие дефектов имплантации оплодотворенной яйцеклетки [6, 39, 114,144].
По данным Кулакова В.Н. и соавт., неэффективность попыток ЭКО можно объяснить нарушением микроциркуляции с образованием микротромбозов в эндометрии и хорионе на начальных этапах беременности [37].
В последние годы практически отсутствуют ограничения по отбору пациенток в программе ЭКО, несмотря на то, что индукция суперовуляции сопряжена со значительной экзогенной гормональной нагрузкой на организм женщины с возможным развитием тяжёлой формы синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) и, как следствие этого - высоким риском тромбоэмболических осложнений [84, 167]. Частота СГЯ при проведении ЭКО варьирует от 15% до 29% в зависимости от используемой схемы стимуляции суперовуляции (лёгкая степень до 14%, средняя до 11%, тяжёлая от 0,2 до 9%). При использовании «чистой схемы» (только ЧМГ) частота этого осложнения составляет 15%, комбинированной схемы (антиэстрогенные препараты + ЧМГ) - 19%, при использовании а-Гл частота СГЯ в 1,5-2 выше, чем при применении других схем - 29% [82, 84,134,135].
Не вызывает сомнения, что тромбозы магистральных сосудов и тромбоэмболия легочной артерии являются самыми серьёзными осложнениями при тяжёлых формах СГЯ и наиболее частыми причинами летальных исходов у данного контингента больных [142, 181]. Описаны тромбозы глубоких вен конечностей, яремной, подключичной и нижней полой вен. Могут поражаться церебральные, позвоночные, подключичные, сонные, бедренные и брыжеечные артерии, аорта [74, 143, 167, 173, 181].
В условиях стимуляции овуляции на уровни коагуляционных факторов влияют не столько уровни сывороточных концентраций эстрадиола (которые иногда в 10 раз выше, чем в регулярном физиологическом менструальном цикле), сколько биохимические изменения, развивающиеся после индукции овуляции хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ). Достоверно известно, что если после стимуляции овуляции человеческим менопаузальным гонадотропином (МГЧ) концентрация факторов свертывания в фазу пролиферации остаётся в пределах нормативных значений, то после индукции с помощью ХГЧ уровни фибриногена, факторов II, V, VII, VIII и IX, достоверно увеличиваются, хотя при этом уровень сывороточного эстрадиола снижен. Клинические исследования свидетельствуют, что эстрогены при стимуляции яичников прямо «не ответственны» за биохимические изменения, способствующие развитию СГЯ и гиперкоагуляции. В пользу этой гипотезы свидетельствует хотя бы тот факт, что у пациенток с недостаточностью фермента 17,20-десмолазы, которые после индукции овуляции с помощью ХГЧ имеют низкий уровень сывороточного эстрадиола, развиваются биохимические изменения, клинически проявляющиеся как СГЯ. После назначения ХГЧ обнаруживается активация не только коагуляционного каскада, но и фибринолиза, о чём свидетельствуют повышенные концентрации плазминогена, снижение уровня ингибитора а2-плазмина и повышенные концентрации фибрина/фибриногена (Д-димер). Этот «фибринолитический феномен» развивается спустя несколько дней после проявления «протромботического феномена». Такой отсроченный фибринолитический ответ свидетельствует о развитии так называемого репаративного фибринолиза в рамках компенсированного ДВС-синдрома (внутрисосудистого микротромбообразования) [39]. Таким образом, гормональная стимуляция суперовуляции при проведении программы ЭКО является мощным активирующим фактором запуска процесса патогенетического микротромбообразования в условиях уже имеющегося гиперкоагуляционного сдвига. Наличие недиагностированных процессов активации внутрисосудистого свертывания крови перед проведением программы ЭКО является предрасполагающим фаісгором развития таких осложнения, как гиперстимуляции яичников (СГЯ), невынашивание беременности, гестоз, плацентарная недостаточность, в патогенезе которых важным звеном является хронический ДВС-синдром [57].
Клиническая характеристика обследованных пациенток
Клинико-лабораторное обследование включало инструментальные методы - УЗИ, цветной допплер, кардиотокография в динамике, ЭКГ, ЭхоКГ; использовались такие лабораторные методы как клинический, биохимический анализы крови, общий анализ мочи, а также исследования системы гемостаза, в том числе генетические.
Забор крови производился сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия. Необходимая обработка и выполнение срочных тестов проводились в течение 2 часов после взятия крови. Последовательное центрифугирование крови и плазмы позволяло получить богатую тромбоцитами плазму. Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Для приготовления бестромбоцитарной плазмы кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. 1.Определение концентрации комплексов тромбин-антитромбин (ТАТ) с помощью фирменного набора EnzygnostAT (Behringwerke, Germany).
Принцип исследования заключается в определении концентрации комплексов ТАТ иммуноферментным методом в плазме крови с помощью «сандвич» - техники. Во время первой инкубации находящиеся в исследуемом образце комплексы ТАТ связываются с антителами к антитромбину, фиксированными на поверхности пластиковой пробирки. В ходе дальнейшей реакции при добавлении антител к человеческому AT III, конъюгированных с пероксидазой, последние связываются со свободными (еще не связанными) детерминантами AT III комплексов ТАТ. Избыток антител, конъюгированных с пероксидазой, удаляется при промывании. Затем измеряется энзиматическая активность соединения. Энзиматические преобразования перекиси водорода и хромогена тормозятся путем добавления в пробирку разведенной серной кислоты. Затем фотометрически измеряется интенсивность окрашивания, которая пропорциональна концентрации комплексов ТАТ. Клиническое значение определения концентрации комплексов ТАТ связано с возможностью ранней диагностики тромбофилического состояния, так как комплексы ТАТ являются ранними маркерами тромбофилии и начала внутрисосудистого свертывания крови. 2. Метод оценки внутрисосудистого тромбообразования определение D-димера с помощью латекс-теста Dimertest (Agen, Australia), который основан на взаимодействии высокоспецифичных антител к D-димеру, фиксированных на латексных частицах. D-димер характеризует перекрестную полимеризацию фибрина в процессе внутрисосудистого свертывания крови; является одним из наиболее специфических тестов диагностики ДВС синдрома, тромбофилии и тромбоза. 3. Исследование плазменного звена системы гемостаза. а) Определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), характеризующего суммарную активность факторов внутреннего пути свертывания (кроме FVII и FVIII) в условиях стандартной активации факторов контакта (FXII и FXI) каолином и стандартного содержания фосфолипидов (частичный тромбопластин) с использованием коммерческих наборов Stago, Франция. б) оценка показателей гемостаза на приборе тромбоэластограф «Hellige» (Germany): "r+k" (хронометрический показатель), "ma" (максимальная амплитуда) «ИТП» (индекс тромбодинамического потенциала с целью оценки хронометрических и структурных параметров коагуляции. 4. Определение количества тромбоцитов. Контроль количества тромбоцитов в периферической крови проводился на автоматическом счетчике «Trombocounter», Франция. 5. Исследование функциональной активности тромбоцитов. Исследование афегации тромбоцитов проводили на афегометре Payton (США) по методу Вот (106), с фафической регистрацией интенсивности и динамики афегации тромбоцитов при перемешивании их со стимуляторами афегации в кювете афегометра. Принцип метода основан на фотоэлектрической регистрации динамики изменения светопропускания (оптической плотности) образца плазмы богатой тромбоцитами при перемешивании с индукторами афегации: раствор аденозиндифосфата (АДФ) конечной концентрации lxlO M, lxlO"DM, 1х10"7М; суспензия коллагена, раствор адреналина - 1x10"М; арахидоновой кислоты 1хЮМ.
Предварительная оценка афегатометра проводилась в зависимости от типов кривых: "необратимая афегация", "обратимая афегация" (дезафегация) и двухфазная афегация (рис. 7). Количественная оценка парамефов афегации тромбоцитов проводилась после предварительной оценки по типам кривых, с помощью вычисления следующих параметров агрегации:ТПВ5ТНЬТДЪиtjn (рис.8).
Характеристика параметров афегации: Тш (%) - величина максмальной афегации, определяется отношением величины изменения светопропускания образца исследуемой плазмы к величине интервала светопропускания от 0% до 100%, характеризует интенсивность агрегации. Tlia (%) - величина вторичной афегации, определяется отношением изменения светопропускания образца плазмы на этапе вторичной афегации к величине интервала от 0% до светопропускания 100%, характеризует интенсивность вторичной афегации (только для двухфазных кривых афетофаммы). ТД1 (%) - величина дезафегации, определяется отношением изменения светопропускания образца исследуемой плазмы на этапе образования дезагрегации (только для обратимой агрегации). tul (сек) - латентный период коллаген-агрегации и агрегации под воздействием арахидоноюи кислоты, от момента добавления стимулятора до начала реакции высвобождения эндогенных стимуляторов и синтеза ТхАз, характеризует время начала реакции высвобождения эндогенных стимуляторов агрегации и синтеза циклических эндопероксидов - простагландинов и тромбоксана Ат в тромбоцитах.
Методы исследования
В условиях гипофибринолиза (как в результате полиморфизма РAI-1, так и других причин) происходит десинхронизация локальных процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации. В такой ситуации протеаз, синтезируемых бластоцистой, становится относительно недостаточно, чтобы разрушить экстрацеллюлярный матрикс в эндометрии и внедриться на достаточную глубину.
Если при этом еще имеет место и циркуляция АФА, то это усугубляет ситуацию, поскольку: а) АФА не только усиливают протромботические механизмы и потому десинхронизируют процессы фибринолиза и фибринообразования, но и б) АФА могут изменять поверхностные предимплантационные характеристики плодного яйца: как заряд, так и конфигурацию. Если же рассматривать этот вопрос в контексте перечня неудач ЭКО, то, с нашей точки зрения, помимо нечета тромбофилии, дополнительно негативную роль играет вспомогательная терапия с массивной гормонотерапией.
В ряде случаев у пациенток с диагнозом бесплодия могут иметь место ранние преэмбрионические потери, которые клинически маскируются нерегулярным менструальным циклом (рисунок 15).
У человека имплантация в силу многих объективных причин еще очень мало изучена. Так, с помощью светового микроскопа к настоящему времени1 были изучены только две человеческие имплантирующиеся бластоцисты. Большое число работ, проделанных по изучению механизмов имплантации у различных видов животных (Leroy F.(1982); Edwards R.G.(1982)), позволило расшифровать многие аспекты этих механизмов и сделать выводы о некоторых общих закономерностях и специфичных для каждого вида особенностях имплантации.
Вследствие скудности точных сведений об имплантации у человека в настоящее время отсутствует единая система деления процесса имплантации на стадии. Разные авторы предлагают свои системы классификации.
Ключевыми моментами во всех современных классификациях являются три стадии: аппозиция (apposition), адгезия (adhesion) и инвазия (invasion).
Начальным этапом установления контакта бластоцисты и эндометрия является стадия аппозиции. Такой контакт может установиться только после освобождения бластоцисты от прозрачной оболочки, чему способствуют ритмичные сокращения бластоцисты. Заключенная в прозрачную оболочку бластоциста является электрически нейтральным телом, в то время как после дегенерации прозрачной оболочки поверхность зародыша становится отрицательно заряженной. Свободная подвижность бластоцисты в эту стадию прекращается, и возникают многочисленные интердигитации микроворсинок бластоцисты и пиноподов, расположенных на апикальной поверхности эпителия эндометрия. Пиноподы абсорбируют маточный секрет, уменьшают объем полости матки и тем самым способствуют близкому контакту бластоцисты и поверхности эндометрия.
После стадии аппозиции следует стадия адгезии - стадия стабильного прикрепления микроворсинок бластоцисты. Для нее характерно то, что плазматические мембраны трофобласта и эпителия эндометрия плотно соприкасаются друг с другом на протяжении больших участков, где их разделяет узкая щель.
Вслед за этим начинается пенетрация трофобласта в слизистую оболочку матки. По мере того как трофобластные клетки проникают в эндометрий, они пролиферируют, дифференцируются на внутренний слой цитотрофобласта и наружный слой синцитиотрофобласта. В синцитиотрофобласте появляются лакуны, которые в дальнейшем будут увеличиваться, сливаться и преобразовываться в межворсинчатое пространство плаценты. На одиннадцатый день после оплодотворения трофобласт уже проникает в материнские сосуды и именно с этого момента начинается активный контакт с плазмой матери. В результате эндоваскулярной инвазии трофобласта происходит -замещение эндотелия интимы на большом протяжении клетками трофобласта. - замещение внутренней эластической мембраны и гладкомышечных клеток среднего слоя матриксом, содержащим клетки трофобласта, окруженные некоторым количеством фибрина.
Имплантация, инвазия трофобласта и дальнейшее функционирование плаценты представляются многоступенчатыми процессами эндотелиально-гемостазиологических взаимодействий со сложной аутокринно-паракринной регуляцией, которые объективно нарушаются при тром боти ческой тенденции и в случае генетических дефектов свертывания. К таким дефектам относятся дефициты протеина С, протеина S, AT III, мутация фактора V Leiden, мутация протромбина, дефицит гепарин-кофактора II, дефицит протромбина, плазминогена, фактора XII, дисфибриногенемия, синдром липких тромбоцитов и другие [8, 9, 39, 43, 94, 121, 129, 174].
Относительно роли различных форм тромбофилии в патогенезе преэмбрионических потерь беременности, в том числе, при неудачах ЭКО наиболее важным представляется мультифакториальный генез и полиморфизм генетических форм тромбофилии. Суть заключается в том, что тромбофилия, как конечный результат, может быть следствием: 1) дефектов различных компонентов системы гемостаза; 2) различных дефектов (различных точечных мутаций) одного и того же компонента; 3) варьировать по степени выраженности в зависимости от гетеро- или гомозиготной формы мутации; 4) сочетаться с другими генетическими или приобретенными дефектами и/или факторами риска (рис 16).
Для биохимического анализа брали листья завершившие свой рост. Среднюю пробу листьев с 10-15 растений фиксировали при 125С и досушивали при 75С в термостате.
Содержание общего азота определяли методом Къельдаля (Медведев, 1996). Навеска сухого вещества составляла 0,3 грамма. Серную кислоту (плотностью 1,84 г/мл) добавляли из расчета 3 мл на 0,1 грамм сухого материала.
Для расчета общего азота в растительном материале использовали формулу:
X = 0,28-V-(YiT[ - Y2T2)/(A-P), где X - содержание азота в сухом веществе, мг/г; Yj - количество 0,02 н. серной кислоты, помещенной в приемную колбу, мл; Y2 - количество 0,02 н. гидроксида натрия, израсходованного на титрование, мл; Ть Т2, - поправочные коэффициенты к титру кислоты и щелочи соответственно; 0,28 - количество азота (мг), которое связывается в виде сульфата аммония 1 мл 0,02 н. серной кислотой; А - объем исследуемого раствора, взятого для отгонки, мл; Р - навеска растительного материала, взятого для сжигания, г; V - объем раствора в мерной колбе (после озоления), мл (Медведев, 1996).
Нитратный азот определяли в водном экстракте (30 мин., на водяной бане) с добавлением 5% раствора салициловой кислоты в H2S04 и 4% NaOH, на приборе КФК-2 (Россия) (Медведев, 1996).
54
Массу золы определяли после сжигания навески растительного материала в муфельной печи при 550С в течении 8 часов (Филиппович, 1982).
Растворимые сахара экстрагировали из растительного материала 80% этанолом двукратно при 40С. После центрифугирования раствор использовали для определения суммы растворимых Сахаров (фруктозы, сахарозы и глюкозы), остаток подвергали кислотному гидролизу (3% соляной кислотой) для отделения неструктурных полисахаридов. Количественное определение растворимых Сахаров и неструктурных полисахаридов проводили методами тонкослойной хроматографии и колориметрическим методом с антроном КФК-2 (Россия) (Филиппович, 1982).
Зольные элементы определяли атомно-адсорбционным методом анализа (Методика..., 1998). Пробоподготовку для проведения анализа осуществляли по стандартной методике. Образцы растительной массы фиксировали при 125С, досушивали до воздушно-сухого состояния (температура 75С) и измельчали. Сухие, измельченные образцы отбирали методом средней пробы до веса 0,01 г. Затем образцы сжигали в муфельной печи при температуре 400-500С в течении 90 минут. После сжигания тигли с золой охлаждали и взвешивали. К полученным образцам приливали 4 мл азотной кислоты (2 моль/л) и 2 мл соляной кислоты (1:1) и проводили разложение в автоклаве XF100, используя микроволновую печь Multiave 3000 фирмы Anton Paar, разложение проводили изменяя мощность разложения от 800 Ватт в течении 5 минут, до 1000 Ватт в течении 15 минут, и на завершающей стадии 60 Ватт в течении 20 минут. Мощность контролировали с помощью ИК - датчика ротора. Полученные в результате разложения пробы исследовали на приборе Aanalist 700 фирмы Perkin Elmer.
Градуировку прибора проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в МИ 2345-95 «ГСП. Характеристики градуировочных средств измерений состава и свойств веществ и материалов. Методы выполнения
55 измерений с использованием стандартных образцов». Содержание элементов в представленных образцах рассчитывали по следующей формуле:
С = S х Vpr / Mnav, где S - показания прибора; Mnav - навеска пробы исследуемого образца, г; Vpr - объем анализируемого раствора, мл.
Углерод определяли сжиганием проб растительного материала в струе кислорода в трубчатой печи при температуре 850С и улавливанием продуктов их сгорания, в которых измеряли выделившийся СОг по его поглощению гидроксидом калия (Посыпайко, 1989).
Кадмия во всех исследованных пробах содержится менее 1 мг/кг (ниже предела обнаружения метода).
3.3.4. Математические методы обработки данных
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 11.5; Excel 2005 из пакета Microsoft Office ХР. Для оценки различий между разными группами видов использовали критерии Стьюдента и Манна-Уитни (Наследов, 2005).
Достоверность различий между растениями разных типов экологических стратегий по изученным параметрам оценивали но параметрическому критерию Стьюдента и непараметрическому U-критерию Манна-Уитни (Наследов, 2005). Тесты предназначены для оценки различий между двумя выборками по уровню какого-либо, количественно измеренного признака и позволяет выявить различия между малыми выборками, когда число образцов в группах Пі =3, п2 >7.
Для выделения и анализа групп растений с разными свойствами первичных типов ЭС, а также оценки достоверности их разделения был использован дискриминантный анализ. Это статистический метод позволяющий изучать различия между двумя и более группами объектов по нескольким переменным одновременно (Факторный, дискриминантный и кластерный анализ, 1989). Данный метод позволяет ответить на вопросы
56 возможно ли, используя данный набор характеристик, отличить одну группу объектов от другой, насколько хорошо эти характеристики позволяют провести различие и какие из них наиболее информативны. Кроме того, дискриминантный анализ дает возможность классифицировать объекты по принципу максимального сходства. При этом вычисляются дискриминантные функции (линейные уравнения), зависящие от значений переменных таким образом, что появляется возможность отнести каждый объект к одной из групп. Программа позволяет так же визуализировать данные путем проектирования объектов на дискриминантные векторы.В условиях гипофибринолиза (как в результате полиморфизма РAI-1, так и других причин) происходит десинхронизация локальных процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации. В такой ситуации протеаз, синтезируемых бластоцистой, становится относительно недостаточно, чтобы разрушить экстрацеллюлярный матрикс в эндометрии и внедриться на достаточную глубину.
Если при этом еще имеет место и циркуляция АФА, то это усугубляет ситуацию, поскольку:
а) АФА не только усиливают протромботические механизмы и потому
десинхронизируют процессы фибринолиза и фибринообразования, но и
б) АФА могут изменять поверхностные предимплантационные
характеристики плодного яйца: как заряд, так и конфигурацию.
101
Если же рассматривать этот вопрос в контексте перечня неудач ЭКО, то, с нашей точки зрения, помимо нечета тромбофилии, дополнительно негативную роль играет вспомогательная терапия с массивной гормонотерапией.
В ряде случаев у пациенток с диагнозом бесплодия могут иметь место ранние преэмбрионические потери, которые клинически маскируются нерегулярным менструальным циклом (рисунок 15).
У человека имплантация в силу многих объективных причин еще очень мало изучена. Так, с помощью светового микроскопа к настоящему времени1 были изучены только две человеческие имплантирующиеся бластоцисты. Большое число работ, проделанных по изучению механизмов имплантации у различных видов животных (Leroy F.(1982); Edwards R.G.(1982)), позволило расшифровать многие аспекты этих механизмов и сделать выводы о некоторых общих закономерностях и специфичных для каждого вида особенностях имплантации.
Вследствие скудности точных сведений об имплантации у человека в настоящее время отсутствует единая система деления процесса имплантации на стадии. Разные авторы предлагают свои системы классификации.
Ключевыми моментами во всех современных классификациях являются три стадии: аппозиция (apposition), адгезия (adhesion) и инвазия (invasion).
Начальным этапом установления контакта бластоцисты и эндометрия является стадия аппозиции. Такой контакт может установиться только после освобождения бластоцисты от прозрачной оболочки, чему способствуют ритмичные сокращения бластоцисты. Заключенная в прозрачную оболочку бластоциста является электрически нейтральным телом, в то время как после дегенерации прозрачной оболочки поверхность зародыша становится отрицательно заряженной. Свободная подвижность бластоцисты в эту стадию прекращается, и возникают многочисленные интердигитации микроворсинок бластоцисты и пиноподов, расположенных на апикальной поверхности эпителия эндометрия. Пиноподы абсорбируют маточный секрет, уменьшают
102 объем полости матки и тем самым способствуют близкому контакту бластоцисты и поверхности эндометрия.
После стадии аппозиции следует стадия адгезии - стадия стабильного прикрепления микроворсинок бластоцисты. Для нее характерно то, что плазматические мембраны трофобласта и эпителия эндометрия плотно соприкасаются друг с другом на протяжении больших участков, где их разделяет узкая щель.
Вслед за этим начинается пенетрация трофобласта в слизистую оболочку матки. По мере того как трофобластные клетки проникают в эндометрий, они пролиферируют, дифференцируются на внутренний слой цитотрофобласта и наружный слой синцитиотрофобласта. В синцитиотрофобласте появляются лакуны, которые в дальнейшем будут увеличиваться, сливаться и преобразовываться в межворсинчатое пространство плаценты. На одиннадцатый день после оплодотворения трофобласт уже проникает в материнские сосуды и именно с этого момента начинается активный контакт с плазмой матери. В результате эндоваскулярной инвазии трофобласта происходит
-замещение эндотелия интимы на большом протяжении клетками трофобласта.
- замещение внутренней эластической мембраны и гладкомышечных клеток среднего слоя матриксом, содержащим клетки трофобласта, окруженные некоторым количеством фибрина.
Имплантация, инвазия трофобласта и дальнейшее функционирование плаценты представляются многоступенчатыми процессами эндотелиально-гемостазиологических взаимодействий со сложной аутокринно-паракринной регуляцией, которые объективно нарушаются при тром боти ческой тенденции и в случае генетических дефектов свертывания. К таким дефектам относятся дефициты протеина С, протеина S, AT III, мутация фактора V Leiden, мутация протромбина, дефицит гепарин-кофактора II, дефицит протромбина,
103 плазминогена, фактора XII, дисфибриногенемия, синдром липких тромбоцитов и другие [8, 9, 39, 43, 94, 121, 129, 174].
Относительно роли различных форм тромбофилии в патогенезе преэмбрионических потерь беременности, в том числе, при неудачах ЭКО наиболее важным представляется мультифакториальный генез и полиморфизм генетических форм тромбофилии. Суть заключается в том, что тромбофилия, как конечный результат, может быть следствием: 1) дефектов различных компонентов системы гемостаза; 2) различных дефектов (различных точечных мутаций) одного и того же компонента; 3) варьировать по степени выраженности в зависимости от гетеро- или гомозиготной формы мутации; 4) сочетаться с другими генетическими или приобретенными дефектами и/или факторами риска (рис 16).
В условиях гипофибринолиза (как в результате полиморфизма РAI-1, так и других причин) происходит десинхронизация локальных процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации. В такой ситуации протеаз, синтезируемых бластоцистой, становится относительно недостаточно, чтобы разрушить экстрацеллюлярный матрикс в эндометрии и внедриться на достаточную глубину.
Если при этом еще имеет место и циркуляция АФА, то это усугубляет ситуацию, поскольку:
а) АФА не только усиливают протромботические механизмы и потому
десинхронизируют процессы фибринолиза и фибринообразования, но и
б) АФА могут изменять поверхностные предимплантационные
характеристики плодного яйца: как заряд, так и конфигурацию.
101
Если же рассматривать этот вопрос в контексте перечня неудач ЭКО, то, с нашей точки зрения, помимо нечета тромбофилии, дополнительно негативную роль играет вспомогательная терапия с массивной гормонотерапией.
В ряде случаев у пациенток с диагнозом бесплодия могут иметь место ранние преэмбрионические потери, которые клинически маскируются нерегулярным менструальным циклом (рисунок 15).
У человека имплантация в силу многих объективных причин еще очень мало изучена. Так, с помощью светового микроскопа к настоящему времени1 были изучены только две человеческие имплантирующиеся бластоцисты. Большое число работ, проделанных по изучению механизмов имплантации у различных видов животных (Leroy F.(1982); Edwards R.G.(1982)), позволило расшифровать многие аспекты этих механизмов и сделать выводы о некоторых общих закономерностях и специфичных для каждого вида особенностях имплантации.
Вследствие скудности точных сведений об имплантации у человека в настоящее время отсутствует единая система деления процесса имплантации на стадии. Разные авторы предлагают свои системы классификации.
Ключевыми моментами во всех современных классификациях являются три стадии: аппозиция (apposition), адгезия (adhesion) и инвазия (invasion).
Начальным этапом установления контакта бластоцисты и эндометрия является стадия аппозиции. Такой контакт может установиться только после освобождения бластоцисты от прозрачной оболочки, чему способствуют ритмичные сокращения бластоцисты. Заключенная в прозрачную оболочку бластоциста является электрически нейтральным телом, в то время как после дегенерации прозрачной оболочки поверхность зародыша становится отрицательно заряженной. Свободная подвижность бластоцисты в эту стадию прекращается, и возникают многочисленные интердигитации микроворсинок бластоцисты и пиноподов, расположенных на апикальной поверхности эпителия эндометрия. Пиноподы абсорбируют маточный секрет, уменьшают
102 объем полости матки и тем самым способствуют близкому контакту бластоцисты и поверхности эндометрия.
После стадии аппозиции следует стадия адгезии - стадия стабильного прикрепления микроворсинок бластоцисты. Для нее характерно то, что плазматические мембраны трофобласта и эпителия эндометрия плотно соприкасаются друг с другом на протяжении больших участков, где их разделяет узкая щель.
Вслед за этим начинается пенетрация трофобласта в слизистую оболочку матки. По мере того как трофобластные клетки проникают в эндометрий, они пролиферируют, дифференцируются на внутренний слой цитотрофобласта и наружный слой синцитиотрофобласта. В синцитиотрофобласте появляются лакуны, которые в дальнейшем будут увеличиваться, сливаться и преобразовываться в межворсинчатое пространство плаценты. На одиннадцатый день после оплодотворения трофобласт уже проникает в материнские сосуды и именно с этого момента начинается активный контакт с плазмой матери. В результате эндоваскулярной инвазии трофобласта происходит
-замещение эндотелия интимы на большом протяжении клетками трофобласта.
- замещение внутренней эластической мембраны и гладкомышечных клеток среднего слоя матриксом, содержащим клетки трофобласта, окруженные некоторым количеством фибрина.
Имплантация, инвазия трофобласта и дальнейшее функционирование плаценты представляются многоступенчатыми процессами эндотелиально-гемостазиологических взаимодействий со сложной аутокринно-паракринной регуляцией, которые объективно нарушаются при тром боти ческой тенденции и в случае генетических дефектов свертывания. К таким дефектам относятся дефициты протеина С, протеина S, AT III, мутация фактора V Leiden, мутация протромбина, дефицит гепарин-кофактора II, дефицит протромбина,
103 плазминогена, фактора XII, дисфибриногенемия, синдром липких тромбоцитов и другие [8, 9, 39, 43, 94, 121, 129, 174].
Относительно роли различных форм тромбофилии в патогенезе преэмбрионических потерь беременности, в том числе, при неудачах ЭКО наиболее важным представляется мультифакториальный генез и полиморфизм генетических форм тромбофилии. Суть заключается в том, что тромбофилия, как конечный результат, может быть следствием: 1) дефектов различных компонентов системы гемостаза; 2) различных дефектов (различных точечных мутаций) одного и того же компонента; 3) варьировать по степени выраженности в зависимости от гетеро- или гомозиготной формы мутации; 4) сочетаться с другими генетическими или приобретенными дефектами и/или факторами риска (рис 16).103 102 101
В условиях гипофибринолиза (как в результате полиморфизма РAI-1, так и других причин) происходит десинхронизация локальных процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации. В такой ситуации протеаз, синтезируемых бластоцистой, становится относительно недостаточно, чтобы разрушить экстрацеллюлярный матрикс в эндометрии и внедриться на достаточную глубину.
Если при этом еще имеет место и циркуляция АФА, то это усугубляет ситуацию, поскольку: а) АФА не только усиливают протромботические механизмы и потому десинхронизируют процессы фибринолиза и фибринообразования, но и б) АФА могут изменять поверхностные предимплантационные характеристики плодного яйца: как заряд, так и конфигурацию. Если же рассматривать этот вопрос в контексте перечня неудач ЭКО, то, с нашей точки зрения, помимо нечета тромбофилии, дополнительно негативную роль играет вспомогательная терапия с массивной гормонотерапией.
В ряде случаев у пациенток с диагнозом бесплодия могут иметь место ранние преэмбрионические потери, которые клинически маскируются нерегулярным менструальным циклом (рисунок 15).
У человека имплантация в силу многих объективных причин еще очень мало изучена. Так, с помощью светового микроскопа к настоящему времени1 были изучены только две человеческие имплантирующиеся бластоцисты. Большое число работ, проделанных по изучению механизмов имплантации у различных видов животных (Leroy F.(1982); Edwards R.G.(1982)), позволило расшифровать многие аспекты этих механизмов и сделать выводы о некоторых общих закономерностях и специфичных для каждого вида особенностях имплантации.
Вследствие скудности точных сведений об имплантации у человека в настоящее время отсутствует единая система деления процесса имплантации на стадии. Разные авторы предлагают свои системы классификации.
Ключевыми моментами во всех современных классификациях являются три стадии: аппозиция (apposition), адгезия (adhesion) и инвазия (invasion).
Начальным этапом установления контакта бластоцисты и эндометрия является стадия аппозиции. Такой контакт может установиться только после освобождения бластоцисты от прозрачной оболочки, чему способствуют ритмичные сокращения бластоцисты. Заключенная в прозрачную оболочку бластоциста является электрически нейтральным телом, в то время как после дегенерации прозрачной оболочки поверхность зародыша становится отрицательно заряженной. Свободная подвижность бластоцисты в эту стадию прекращается, и возникают многочисленные интердигитации микроворсинок бластоцисты и пиноподов, расположенных на апикальной поверхности эпителия эндометрия. Пиноподы абсорбируют маточный секрет, уменьшают объем полости матки и тем самым способствуют близкому контакту бластоцисты и поверхности эндометрия.
После стадии аппозиции следует стадия адгезии - стадия стабильного прикрепления микроворсинок бластоцисты. Для нее характерно то, что плазматические мембраны трофобласта и эпителия эндометрия плотно соприкасаются друг с другом на протяжении больших участков, где их разделяет узкая щель.
Вслед за этим начинается пенетрация трофобласта в слизистую оболочку матки. По мере того как трофобластные клетки проникают в эндометрий, они пролиферируют, дифференцируются на внутренний слой цитотрофобласта и наружный слой синцитиотрофобласта. В синцитиотрофобласте появляются лакуны, которые в дальнейшем будут увеличиваться, сливаться и преобразовываться в межворсинчатое пространство плаценты. На одиннадцатый день после оплодотворения трофобласт уже проникает в материнские сосуды и именно с этого момента начинается активный контакт с плазмой матери. В результате эндоваскулярной инвазии трофобласта происходит -замещение эндотелия интимы на большом протяжении клетками трофобласта. - замещение внутренней эластической мембраны и гладкомышечных клеток среднего слоя матриксом, содержащим клетки трофобласта, окруженные некоторым количеством фибрина.
Имплантация, инвазия трофобласта и дальнейшее функционирование плаценты представляются многоступенчатыми процессами эндотелиально-гемостазиологических взаимодействий со сложной аутокринно-паракринной регуляцией, которые объективно нарушаются при тром боти ческой тенденции и в случае генетических дефектов свертывания. К таким дефектам относятся дефициты протеина С, протеина S, AT III, мутация фактора V Leiden, мутация протромбина, дефицит гепарин-кофактора II, дефицит протромбина, плазминогена, фактора XII, дисфибриногенемия, синдром липких тромбоцитов и другие [8, 9, 39, 43, 94, 121, 129, 174].
Относительно роли различных форм тромбофилии в патогенезе преэмбрионических потерь беременности, в том числе, при неудачах ЭКО наиболее важным представляется мультифакториальный генез и полиморфизм генетических форм тромбофилии. Суть заключается в том, что тромбофилия, как конечный результат, может быть следствием: 1) дефектов различных компонентов системы гемостаза; 2) различных дефектов (различных точечных мутаций) одного и того же компонента; 3) варьировать по степени выраженности в зависимости от гетеро- или гомозиготной формы мутации; 4) сочетаться с другими генетическими или приобретенными дефектами и/или факторами риска (рис 16).
Основные принципы профилактики повторных неудач ЭКО и выкидышей у женщин с тромбофилией
К таковым мы относим либо а) те формы, которые потенциируют взаимные эффекты через одни и те же механизмы (то есть действуют на одну и ту же «мишень»), являясь по отдельности менее тромбогенными, как, например, изолированные полиморфизмы генов PAI-1 или АГЇФ; либо б) сочетание наиболее тромбогенных форм тромбофилии (например, FV Leiden, протромбин G20210A, MTHFR С677Т, АФА), когда задействованы различные механизмы возникновения тромбофилии, как-то эндотелиальные расстройства, повышенная тромбинемия вследствие высокого уровня факторов свертывания (как при мутации Pt G20210A), снижение естественных противотромботичских ресурсов (при мутации FV Leiden, АФС, гипофибринолизе).
Если же глобально оценить роль генетически обусловленной тромбофилии в процессе эффективности ЭКО обращает на себя внимание и тот факт, что по нашим данным, у пациенток с неудачами ЭКО достаточно часты ранние преэмбриональные потери у (100%), синдром потери плода (35%), ранние выкидыши в анамнезе отмечались у (25%).
Следует заметить, что у пациенток с бесплодием I или II, и неудачами ЭКО был выявлен наиболее высокий процент отягощенного семейного акушерского анамнеза - 63,9%. Семейный тромботический анамнез был отягощен у 30,8%.
Учитывая, что нарушения, связанные с тромбофилией и неадекватным образованием фибрина, начинают формироваться еще на этапе имплантации оплодотворенной яйцеклетки, инвазии трофобласта, формирования плаценты, важно еще до зачатия проводить профилактику более поздних осложнений.
Начиная с фертильного цикла, при подготовке в программе ЭКО, проводимая в нашем исследовании патогенетически обоснованная терапия включала гирудотерапия (являвшейся высокоспецифичным ингибитором фермента тромбина), аспирин в дозе 75-81 мг, фолиевая кислота, полиненасыщенные жирные кислоты (Омега-3), витамины для беременных. Здесь же следует отметить, что при гомозиготной форме мутации MTHFR С677Т и тяжелой гипергомоцистеинемии были назначены витамины группы В, поскольку являются кофакторами метаболического цикла метионина и доза фолиевой кислоты в таких случаях составляла 4 мг/сутки. В связи с наличием оксидативного стресса при мутации MTHFR С677Т и повреждения сосудистой стенки токсическими продуктами перекисного окисления липидов, дополнительно проводилась профилактика антиоксидантами (Микрогидрин).
В качестве базисного терапевтического агента мы использовали низкомолекулярный гепарин фраксипарин в дозах 0,3-1,0 мл (150-250 ICU/кг) в зависимости от выраженности тромбофилии. Доза препарата корректировалась в зависимости от уровней маркеров тромбофилии, агрегационной активности тромбоцитов, веса женщины. Терапию НМГ получали, начиная с фертильного цикла, в рамках подготовки к программе ЭКО, а именно, в процессе стимуляции овуляции. Отменяли за сутки до планируемой пункции. Через 12 ч после подсадки эмбрионов его приём возобновлялся. Терапия фраксипарином проводилась в непрерывном режиме в течение всей беременности.
Оценка эффективности длительного применения НМГ фраксипарина производилась с учетом как клинических, так и лабораторных критериев. Об эффективной профилактике свидетельствовали то, что в процессе подготовки к программе ЭКО позволила добиться положительных результатов 36,4% случаях и пролонгировать беременность у пациенток с бесплодием (неясного генеза) и повторными неудачами ЭКО практически во всех случаях.
К важнейшим лабораторным критериям эффективности проводимой профилактики относится снижение вплоть до полной нормализации молекулярных маркеров тромбофилии (ТАТ, Д-димер) и нормализация агрегационной активности тромбоцитов. Патогенетически обоснованная, с нашей точки зрения, профилактика позволила во всех случаях предупредить рецидив тромбоза и значительно улучшить исходы беременности после ЭКО. При этом достоверно лучшие исходы имели место у пациенток, которые получали терапию в фертильном цикле подготовки к ЭКО. Что касается оптимизации профилактики, то в связи с выяснением новых форм тромбофилии (таких, например, как РАГ-1) и роли фибринолиза на ранних этапах имплантации, нам представляется весьма многообещающим включение гирудотерапии в процесс подготовки в фертильном цикле (табл. 19).
