Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы. Система протеина С и беременность 11
I. 1.Понятие о системе протеина С, его роль в физиологии и патологии органов
I.2. Изменения гемостаза во время физиологической беременности 21
I.3. Репродуктивные потери
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 50
11.1 Общеклиническая характеристика пациентов 50
11.2 Методы исследования 65
ГЛАВА III. Ретроспективный анализ нарушения в системе протеина С у пациенток с синдромом потери плода в анамнезе с клинико-гемостазиологической патологие
ГЛАВА IV. Основные принципы патогенетической профилактики повторных репродуктивных потерь у пациенток с тромбофилией в основе которых имеются нарушения системы протеина
ГЛАВА V. Обсуждение 98
Выводы 114
Список литературы
- Изменения гемостаза во время физиологической беременности
- Репродуктивные потери
- Методы исследования
- Обсуждение
Изменения гемостаза во время физиологической беременности
В результате посттрансляционной модификации молекулы происходят следующие изменения структуры профермента:1) выщепление связывающего дипептида Lys156-Arg157 и превращение одно-цепочечной формы в двух цепочечную молекулу, состоящую из тяжелой и легкой цепей, соединенных дисульфидной связью; 2) дополнительное - карбоксилирование девяти остатков глутаминовой кислоты NH2 конца легкой цепи протеина С и образование Гла-домена; 3) гидроксилирование остатка Asp в EGF1 домене; 4) гликозилирование. (Ahnstrm J, Andersson HM, Canis K, Norstrm E, 2011; Vodnik T, Ignjatovi S, Majki-Singh N., 2003)
Кроме Гла-домена, легкая цепь протеина С содержит два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF1 и EGF2 домены). (Zhu T, Ubhayasekera W, Nickolaus N, Sun W, 2010)
Тяжелая цепь протеина С содержит короткий отрицательно заряженный пептид активации Lys158-Arg169 и домен сериновой протеиназы. В норме у здорового человека концентрация протеина С в крови около 3мг/мл. (H. Weiler, 2011; Schuepbach RA, Velez K, Riewald M., 2011) Кофактор протеина С – протеин S На поверхности клеток протеин С находится в комплексе с кофактором-протеином S - фактором протромбинового комплекса, который не может формировать фермент. (Tchaikovski SN, Thomassen MC, Costa SD, Peeters LL, 2011; Hackeng TM, Rosing J., 2009)
Строение протеина S: на N- конце молекулы локализован Гла -домен, отвечающий за связывание молекулы с отрицательно заряженной мембраной клетки. Затем следуют : домен, чувствительный к тромбину, четыре домена, подобные EGF СООН-концевой домен, гомологичный белкам, семейства андрогенсвязывающих белков человека. (Persson КЕ, Stenflo J, Linse S, Stenberg Y, 2006)
Протеин S содержит две пептидные связи, гидролизуемые тромбином. После их расщепления Гла-домен остается связанным с остальной частью молекулы через дисульфидную связь, но протеин S теряет свои антикоагулянтные свойства. (Heeb MJ, Schuck Р, Хи X., 2006)
Протеин S находится в кровотоке в свободной форме, способной связывать протеин С, и в комплексе со связывающим белком системы комплемента-С4. Функция протеина S - повышать сродство протеина С к фосфолипидам мембраны клеток. Протеин S синтезируется эндотелиальными клетками, мегакариоцитами, клетками мозга и др. (Saposnik В, Borgel D, Aiach М, Gandrille S., 2003; Mille-Baker В, Rezende SM, Simmonds RE, Mason PJ, 2003) Активация протеина С Протеин С циркулирует в крови в форме профермента. Превращение профермента в сериновую протеиназу- активированный протеин С происходит вследствие расщепления тромбином одной пептидной связи Argl69 - Leul70 в тяжелой цепи протеина С человека и освобождения отрицательно заряженного 12-членного пептида активации (Lys158-Arg169) с N-конца. Расщепление протеина С происходит только под действием тромбина (в нМ концентрации) в комплексе с тромбомодулином. (Yang L, Manithody C, Rezaie AR , 2006; Rezaie AR, 2010)
Тромбомодулин - первая мишень тромбина на эндотелии. Тромбин, связанный с тромбомодулином, теряет свои прокоагулянтные свойства и приобретает антикоагулянтные свойства, быстро превращая протеин С в активную форму- активированный протеин С (APC). Кроме тромбина протеин С может быть активирован фактором Xa и тромбиноподобным активатором из яда щитомордника. При активации расщепляется одна пептидная связь Арг-Лей и освобождается активационный пептид. (Murakami M.T., Arni RK, 2005; Zangari M, Berno T, Zhan F, Boucher KM, 2011)
Функции активированного протеина С На поверхности клеток формируется комплекс фермента - АРС, кофактора- протеина S и субстратов АРС – факторов Va и VIIIa свертывания крови. АРС вызывает протеолиз этих факторов, потенциальных компонентов теназы (IX и VIII) и протромбиназы (V и Xа) до неактивных форм. (Tran S, Dahlback B 2010; Andersson HM, Arantes MJ, Crawley JT, Luken BM, 2010)
Инактивация FVа происходит благодаря протеолизу в Arg506 и Arg306. Протеолиз сайта Arg506 приводит только к частичной инактивации фактора V и облегчает взаимодействиес сайтом Arg306. Расщепление в сайте Arg306 ускоряется в присутствии кофактора протеина S, в то время как расщепление в Arg506 не зависит от протеина S. Затем происходит протеолиз сайта Arg 679.
Инактивация FVIIIа происходит благодаря протеолизу в Arg336 и Arg562. Факторы V и VIII очень похожи, но расщепление любого из сайтов FVIII приводит к полной потери прокоагуляционных свойств в отличие от FV. (Tran S, Dahlback B 2010; H. Weiler, 2011) Активированный протеин С, связываясь со специфическим рецептором — эндотелиальным рецептором протеина C (EPCR), приобретает новые противовоспалительные свойства. (Griffin JH, Fernandez JA, Gale AJ, Mosnier LO 2007; Rezaie AR, 2010; Sarangi PP, Lee HW, Kim M., 2010)
Репродуктивные потери
Еще один генный полиморфизм, приводящий к гипергомоцистеинемии, - замена C G в позиции 766 в гене транскобаламина. Мутация приводит к замене аргинина на пролин в 259 кодоне. Особенно широко распространен генотип 766TC в Кавказской популяции. Транскобаламин - транспортер витамина B12, обеспечивающий его доставку к тканям. У гетерозиготы по данному гену наблюдают гипергомоцистеинемию.
Наличие мутантного гена 766G достоверно выше в абортном материале по сравнению с контрольной группой. (Zetterberg H., 2004; Bibi S, Qureshi, Ahmad M, Qureshi PM, 2011)
Недостаток витамина B-12 Исследование M. Paskal и соавторов, изучавших содержание витамина В12 в плазме крови матерей, родивших детей со spina bifida, продемонстрировало, что снижение концентрации витамина В12 в материнской сыворотке крови ниже уровня 185 ммоль/л коррелирует с 3,5 кратным повышением риска рождения ребенка со spina bifida. (Acilmis YG, Dikensoy E, Kutlar AI, Balat O, 2011) Средние концентрации витамина В12 у матерей группы spina bifida были на 21% меньше по сравнению с контрольной группой, в то время как различий между концентрациями фолатов, витамина В6 и гомоцистеина в сыворотке крови и эритроцитах не наблюдалось. (L. Dodds, D. B. Fell, K. C. Dooley, B. A. Armson, 2008; В.О. Бицадзе, А.Д. Макацария, 2007; О.Н.Аржанова, Е.А.Алябьева, Т.Н.Шляхтенко, 2009)
Исследования Thompson и соавторов также показало, что прием витамина В12 может предотвратить развитие дефектов нервной трубки. (Miles D Thompson, David EC Cole, and Joel G Ray,2009) В США и Канаде давно было предложено обогащение зерновых продуктов витамином В12, что позволило бы заменить 2,4 кружки синтетического витамина В12, которые рекомендует US Institute of Medicine всем людям старше 50. Многие авторы считают, что если следовать этим рекомендациям, то возможно предотвращение развития spina bifida и анэнцефалии. Данная проблема весьма актуальна, т.к. ежегодно 220 тысяч детей заболевают приобретенной фолат-зависимой spina bifida. Поэтому, как считает Ray, большинство стран, включая Европу, должны ввести промышленное обогащение зерновой культуры витамином В12. (M. del R. Rodrguez-Guilln, L. Torres-Snchez, J. Chen2, M. Galvn-Portillo, 2009; Yunni Yi, Marion Lindemann, Antje Colligs, and Claire Snowball, 2011)
Влияние гомоцистеина на плод
По мнению многих авторов, гипергомоцистеинемия приводит к деекту нервной трубки. Молекулярные механизмы этого процесса до конца неизвестны, но высказываются предположения о недостаточном метилировании ключевых метаболитов, аномальной дифференцировке, пролиферации и апоптозу нервных клеток вследствие ошибки включения нуклеотидов в ДНК. Несколько механизмов эмбриотоксического действия гомоцистеина: 1) Увеличенное образование S-аденозилгомоцистеина приводит к ингибированию ключевых реакций метилирования. 2) Возросшая концентрация гомоцистеина также приводит к ингибированию синтеза дезокситимидилата (dTMD). Для ингибирования реакции превращения dUMD в dTMD увеличивается захват тимидина. 3) 5,10-метилентетрагидрофолат истощается в присутствии избытка гомоцистеина, т.к. необходимо большое количество 5-метилтетрагидроолат для удаления избытка гомоцистеина путем метилирования. Все это может индуцировать ошибки включения нуклеотидов в ДНК, разрывы нитей ДНК, остановку клеточного цикла и, в конечном счете, апоптоз. (Zetterberg H., 2004; L. Dodds, D. B. Fell, K. C. Dooley, B. A. Armson, 2008)
Гипергомоцистеинемия и патология беременности Во время беременности уровень гомоцистеина имеет тенденцию к снижению. Это снижение (на 50-60 %) происходит обычно на границе первого и второго триместров беременности, и затем остается относительно стабильным. (Oger E, Lacut K, Le Gal G, Couturaud F, 2007) Нормальные уровни гомоцистеина восстанавливаются через 2-4 дня после родов. Считается, что снижение уровня гомоцистеина при беременности благоприятстствует плацентарному кровообращению. Возможными причинами снижения концентрации гомоцистеина являются гемодилюция, повышение синтеза стероидов, а также потребление метионина и гомоцистеина растущим плодом. (Бицадзе, А.Д. Макацария, 2007)
Гипергомоцистеинемия приводит к повреждению и активации эндотелиальных клеток, что значительно повышает риск развития тромбозов. Механизм ясен не до конца, но многое уже известно. (Pacchiarotti A, Mohamed MA, Micara G, Linari A, 2007; Gatt A, Makris M., 2007)
Тромбогенное действие гомоцистеина может быть связано с повреждением клеток эндотелия, неспецифическим ингибированием синтеза простациклина, активацией фактора V, торможением активации протеина C, снижением экспрессии тромбомодулина, блокадой связывания тканевого активатора плазминогена эндотелиальными клетками.
Методы исследования
В проспективную часть исследования из ретроспективной были включены 30 пациенток. Которые разделены на три подгруппы: I подгруппа 10 женщин с СПП (многократные выкидыши), II подгруппа- 10 женщин с тяжелой формой гестоза в анамнезе, III подгруппа- 10 женщин с ПОНРП в анамнезе. Все 30 женщин обратились к нам на этапе планирования беременности. Все пациентки наблюдались с фертильного цикла, нами проводилась комплексная профилактическая подготовка к беременности в зависимости от результатов клинико-гемостазиологического обследования и анамнестических данных. Пациентки проспективной группы были консультированы и обследованы до наступления беременности, наблюдались в течение всего гестационного периода до родоразрешения. Контрольную группу составили 50 женщин с неосложненным течением беременности, неотягощенным акушерско-гинекологическим и тромботическим анамнезом.
В проспективной группе у всех обследованных был отягощен акушерский анамнез, так, синдром потери плода отмечался в первой подгруппе ранние выкидыши составили 10(100%), поздние выкидыши 4(40%), во второй подгруппе 10(100%), 2(20%), и в третей подгруппе 7 (70%) ранних потерь и 3(30%) поздние выкидыши. Антенатальная гибель плода имела место в I и II подгруппе- 4(40%) , в III подгруппе 6 (60%) , всего 14(46.6%). Гестоз в I-4(40%), II-10(100%), III- 6(60%). ПОНРП I-0, II-4(40%), III-10(100%). Таблица 13. Акушерский анамнез пациенток проспективной группы
У всех пациенток из проспективной группы было обнаруженно нарушение протеина С. 30 женщин с нарушением в системе протеина С были обследованы на предмет наличия антифосфолипидных антител и мутации FV Leiden. Анализ результатов выявил в первой подгруппе циркуляция антифосфолипидных антител 10(100%). Во второй и третей подгруппе 10(100%) с нарушением протеина С и циркуляцией антифосфолипидных антител.
В своей работе мы применяли гирудотерапию и НМГ. Женщины у которых было обнаружено нарушение системы протеина С и циркуляция АФА – получали гирудотерапию до наступления беременности, НМГ c наступления беременности. С нашей точки зрения, применение гирудотерапии показано при нарушении протеина С и циркуляции антифосфолипидных антител. Лечение пиявками проводилось с соблюдением основных принципов, продиктованных патогенетическими механизмами:
После курса гирудотерапии (до 12 сеансов), при условии наступления беременности, для адекватного формирования маточно-плацентарного кровотока нами проводилась антикоагулянтная терапия низкомолекулярным гепарином- фраксипарином. Доза антикоагулянта подбиралась индивидуально в динамическом режиме. У секрета пиявки на сегодняшний день известно 60 биологически активных ферментов, основным из которых является гирудин. Гирудин обладает антимикробным действием. Элины, бделины, дестабилаза, анти Ха-фактор, гиалуронидазный комплекс, холинэстераза, и другие компоненты, оказывают антиагрегационный, тромботический, антикоагулянтный эффекты на свертывающую систему крови. Пиявка обладает рядом преимуществ перед лекарственными препаратами: -является натуральным средством -обладает одновременным, сбалансированным влиянием ферментов секрета практически на все звенья свертывающей системы -совмещает разнонаправленное воздействие: через микроциркуляцию на кровоток, лимфатическую систему, рефлекторное (при постановке на биологически активные точки) -местное, локальное воздействие -практически не вызывает кровотечений, в отличие от рекомбинантного гирудина и других антикоагулянтов (варфарин, нефракционированный гепарин и пр.) Доза применяемых препаратов корректировалась в зависимости от уровня маркеров тромбофилии ТАТ, F1+2, Д-димер, агрегационной активности тромбоцитов и результатов глобального теста, оценивающего функцию протеина С (ПАРУС-тест)
Всем пациенткам до назначения фраксипарина, а затем через 10 дней и далее ежемесячно проводился контроль уровня маркеров тромбофилии ТАТ, Д димера, измерялся уровень гомоцистеина в плазме, агрегационная активность тромбоцитов, функция протеина С (Парус-тест), уровень PAI-1. Это было необходимо для определения исходного уровня тромбофилии, выбора исходно адекватной дозы антикоагулянта и антиагреганта и контроля эффективности и безопасности применения препаратов.
Доза НМГ корректировалась в зависимости от уровней маркеров тромбофилии, агрегационной активности тромбоцитов и веса женщины. Препарат применялся подкожно 1-2 раза в сутки в непрерывном режиме в течение всей беременности. За сутки до кесарева сечения препарат отменялся с целью предотвращения геморрагических осложнений. Через 8 часов после операции терапия была продолжена в течение 10 дней послеоперационного периода с дальнейшей оценкой состояния параметров системы гемостаза. Глобальные общеоценочные тесты, такие как АЧТВ, ТЭГ, протромбиновое время были использованы перед назначением НМГ и накануне родоразрешения с целью исключения геморрагической наклонности
Обсуждение
Своевременное начало профилактики (предпочтительно с фертильного цикла или, по крайней мере, до завершения процессов инвазии трофобласта и плацентации)
Использование патогенетически обоснованной профилактики, при этом базисным препаратом является НМГ. Постоянный контроль дозы, эффективности и безопасности терапии НМГ с использованием маркеров тромбофилии, прежде всего D-димера, с интервалом 2-3 недели, а при необходимости еще чаще в зависимости от показателей гемостазиограммы и клинической картины Использование препаратов натурального микронизированного прогестерона у пациенток с отслойкой хориона в анамнезе
Дифференцированный подход к подготовке и ведению беременности в зависимости от выявленной формы тромбофилии и наличия дополнительных факторов риска.
При наличии АФС патогенетически оправданным является добавление к терапии НМГ аспирина в низких дозах (50-75 мг), так как сочетание этих двух препаратов показало наибольшую эффективность при анализе течения и исходов беременности у пациенток с циркуляцией АФА. Более того, мы считает обоснованным назначение аспирина при гиперагрегации тромбоцитов, при наличии полиморфизмов тромбоцитарных рецепторов, сопровождающихся гиперфункцией тромбоцитов, а также у пациенток с ОНМК и/или преэклампсией в анамнезе, что подтверждают литературные данные. Аспирин мы назначали на этапе подготовки беременности, в I триместре по показаниям при наличии выраженной гиперагрегации тромбоцитов, во II и III триместре максимально до 34-35 недели во избежание повышения риска кровотечений в родах и в послеродовом периоде с учетом длительного сохранения эффекта этого препарата на функцию тромбоцитов даже после его отмены. Выявление гипергомоцистеинемии и также наследственной предрасположенности к ней требует назначения высоких доз фолиевой кислоты (минимум 4 мг в сутки), а также витаминов группы В. В связи с характерным для всех вариантов тромбофилии состоянием гиперкоагуляции, эндотелиальной дисфункции, активации провоспалительного ответа к терапии мы считаем необходимым добавлять омега-3 жирные кислоты, обладающие помимо антиоксидантных эффектов антиагрегантной активностью, эндотелиопротективными и антиатерогенными эффектами. Учитывая отсутствие известного отрицательного влияния натурального прогестерона на систему гемостаза, его эффекты, направленные на подавление провоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-1 и TNF-альфа, иммуномодулирующие эффекты, обеспечивающие повышение иммунной толерантности организма матери к плоду, токолитические свойства, мы считаем патогенетически обоснованным назначение утрожестана у пациенток с синдромом потери плода в анамнезе, в случае угрозы прерывания беременности, при подтвержденном дефиците прогестерона, который может быть обусловлен анти-ХГЧ эффектами АФА. В связи с эндокринными эффектами АФА применение натурального прогестерона у пациенток с АФС может иметь особенно важное значение. Назначение утрожестана у пациенток с отягощенным тромботическим анамнезом мы считаем возможным только при условии адекватного подбора дозы НМГ и тщательного контроля состояния системы гемостаза, при этом предпочтение мы отдавали вагинальному способу назначения в связи с данными о его меньшем предполагаемом влиянии на свертывающую систему крови.
Такая тактика комплексной профилактической терапии с фертильного цикла или ранних сроков беременности в предыдущих исследованиях уже показала свою высокую эффективность у пациенток с тромбофилией и тяжелыми акушерскими осложнениями. Так, ее эффект для профилактики повторных ПОНРП достигает 100%, в 96% удалось добиться благоприятного исхода беременности у пациенток с синдром потери плода и до 40% случаев у пациенток с повторными неудачами ЭКО, ни в одном случае не наблюдалось развития тяжелых форм гестозов у пациенток с преэклампсией в анамнезе. Эффективность комплексной патогенетической терапии связана не только с антитромботическими эффектами, но и с недавно обнаруженной противовоспалительной активностью НМГ и его способностью влиять на процессы имплантации, инвазии трофобласта и плацентации . Было показано, что НМГ ингибирует продукцию TNF-альфа, повышает сывороточный TNF-альфа-связывающий протеин I, обладает противовоспалительным эффектом в сосудистой стенке в условиях тромбоза, а также, возможно, восстанавливает способность трофобласта секретировать ХГЧ, которая подавлена в условиях циркуляции АФА.
Если в патогенезе ранних репродуктивных потерь при АФС превалирует в основном воспаление и активация системы комплимента, то поздние репродуктивные потери, ПОНРП, антенатальная гибель плода в большей степени опосредованы тромбозами микроциркуляторного русла плаценты, спровоцированными тромбофилией. Поэтому нетромботические и тромботические патологические влияния тромбофилии патогенетически обосновывают применение НМГ с его неантикоагулянтными и антикоагулянтными эффектами с ранних сроков беременности.
Таким образом, подводя итог нашему исследованию следует еще раз подчеркнуть, что патогенетически обоснованная, рано начатая терапия НМГ у беременных с нарушениями в системе протеина С и, в частности, при АФС и мутации FV Leiden, позволяет осуществлять профилактику потерь плодов и тромбозов, обеспечить более адекватное развитие плаценты, а так же маточно-плацентарного кровотока, что в сою очередь снижает частоту таких осложнений как преждевременные роды, ЗРВП, антенатальная гибель плода, гестоз, и в конечном счете приводит к благоприятному течению гестационного процесса.
Из этого следует, что ранный скрининг нарушений в системе протеина С в группах риска позволяет своевременно выявить тромбофилию и ее этиологию, а соответственно, своевременно начать патогенетический обоснованную профилактику как тромботическиз , так и акушерских осложнений.
Система протеина С обеспечивает множественные важнейшие функции поддержания баланса между гемостазом и иммунной системы в ответ на воспаление. Система протеина С кроме того обеспечивает одну из важнейших фукций поддержание крови в жидком состояние в организме, а так же цитопротективное действие. Протеин С включает в себя противоапоптическое, противовоспалительное действие и стабилизирует эндотелиальный барьер.
