Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Ангиогенные факторы и матриксные металлопротеиназы при новообразованиях женской репродуктивной системы (обзор литературы) 19-55.
1.1. Ангиогенез в норме и опухолевой трансформации 20-21.
1.2. Ангиогенез в опухолях 21-23.
1.3. Малоинвазивные инструментальные методы оценки ангиогенеза в опухолях 23-25.
1.4. Маркеры ангиогенеза 25-27.
1.5. Фактор роста эндотелия сосудов 27-29.
1.6. Рецепторы фактора роста эндотелия сосудов 29-34.
1.7. Клинические исследования ангиогенеза в опухолях женской репродуктивной системы и его роль в прогнозе заболевания 31-35.
1.8. Антиангиогенная терапия рака яичников 35-39.
1.9. Матриксные металлопротеиназы .39-41.
1.10. Клиническое значение ММP и ТIМP при опухолях яичников .41-52.
1.11. МMP - потенциальные мишени таргетной терапии .52-55.
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 56-65.
2.1. Общая характеристика обследованных больных 56-62.
2.2. Характеристика лабораторных методов исследования 62-63.
2.3. Иммуногистохимические методы исследования 63-65.
2.4. Статистические методы исследования 65-65.
ГЛАВА 3. Содержание ангиогенных факторов и матриксных металлопротеиназ в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников (результаты собственных исследований) 66-90.
3.1. Содержание VEGF в сыворотке крови в основных группах 6
6-67.
3.2. Уровни VEGF в сыворотке крови больных новообразованиями яичников и возраст пациенток 67-68.
3.3. Связь содержания VEGF в сыворотке крови больных новообразованиями яичников с наличием соматического заболевания, абортов и родов 69-70.
3.4. Содержание VEGF в сыворотке крови больных новообразованиями яичников и с учетом гистологического строения опухоли 70-71.
3.5. Уровни сывороточного VEGF у больных раком яичников с учетом стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли 71-73.
3.6. VEGF в опухолях больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников 73-75.
3.7. Содержание VEGF в опухоли больных РЯ, ПОЯ и ДНЯ с учетом их возраста данными анамнеза жизни 75-76.
3.8. Связь содержания VEGF в первичных опухолях яичников с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания .77-79.
3.9. VEGF-R1 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников 79-80.
3.10. Содержание VEGF-R1 в опухоли и сыворотке крови больных с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания 80-83.
3.11. VEGF-R2 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников 83-84.
3.12. Связь содержания VEGF-R2 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников разных групп с анамнестическими данными, стадией, гистологическим строением и степенью дифференцировки опухолей 84-87.
3.13. Содержание VEGF-R2 в сыворотке крови и опухолях больных РЯ с учетом основных клинических признаков болезни 87-88.
3.14. Соотношение показателей в сыворотке крови и опухолях больных новообразованиями
яичников 88-90.
ГЛАВА 4. Матриксные металлопротеиназы 2 и 7 типов в сыворотке крови и опухоли больных раком яичников (результаты собственных исследований) 91-103.
4.1. Содержание ММР-2 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников и в контроле 91-92.
4.2. Связь показателей ММР-2 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников с возрастом пациенток .92-93.
4.3. ММР-2 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников с учетом их гистологического строения 93-94.
4.4.Содержание ММР-2 в сыворотке крови и опухоли больных раком яичников с учетом стадии и степени дифференцировки опухоли .94-96.
4.5. Связь показателей ММР-2 в сыворотке крови и опухоли с уровнями VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2 в сыворотке крови и опухоли до лечения у больных новообразованием яичников .96-97.
4.6. Содержание ММР-7 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников и в контроле 97-98.
4.7. Связь показателей ММР-7 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников с возрастом пациенток и репродуктивным статусом .98-100.
4.8. ММР-7 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников с учетом их гистологического строения .100-101.
4.9. ММР-7 в сыворотке крови и опухоли больных раком яичников с учетом основных клинико-морфологических характеристик болезни 101-103.
4.10. Связь показателей ММР-7 в сыворотке крови и опухоли с уровнями СА-125, VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2 в сыворотке крови и опухоли до лечения у больных новообразованием яичников 103-103.
ГЛАВА 5. Иммуногистохимические исследования vegf и vegfr-2 в опухолях яичников (результаты собственных исследований) .104-113.
Обсуждение полученных результатов 114-126.
Выводы 127-128.
Практические рекомендации 128-128.
Список цитируемой литературы
- Малоинвазивные инструментальные методы оценки ангиогенеза в опухолях
- Характеристика лабораторных методов исследования
- Связь содержания VEGF в сыворотке крови больных новообразованиями яичников с наличием соматического заболевания, абортов и родов
- Связь показателей ММР-2 в сыворотке крови и опухоли с уровнями VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2 в сыворотке крови и опухоли до лечения у больных новообразованием яичников
Введение к работе
Актуальность темы
Рак яичников (РЯ) - гетерогенная по гистологическому строению группао-пухолей с множественными генетическими и эпигенетическими нарушениями (Карселадзе А.И., 2005; BastR.C.Jr. etal., 2009; Goodman M.T. etal., 2009), характе-ризуетсякрайне агрессивным клиническим течением, низкой эффективностью терапии и высокими показателями летальности.
С целью более углубленного понимания базисных основ развития новообразований яичников в условиях свершившейся опухолевой трансформации клеток, важно изучение конкретных молекул, связанных с механизмами регуляции скорости роста, пролиферативной активности, апоптоза, неоангиогенеза, инвазив-ной способности и метастазирования.
Одним из наиболее актуальных разделов клинической и экспериментальной онкологии является изучение механизмов неоангиогенеза при развитии опухолей (FolkmanJ., 2001; Луценко С.В.и соавт., 2004). Экспериментальные факты и клинические наблюдения подтверждают зависимость метастазирования опухоли от активности неоангиогенеза и его ключевого активатора – фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (FolkmanJ., 2001). Однако данные литературы по изучению 5 изоформ VEGF и его рецепторов в опухолях больных новообразованиями яичников не однозначны.
Наряду с активацией ангиогенеза в опухолях, одним из основных механизмов их инвазии является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с опухолью протеиназами (Герштейн Е.С.и соавт., 2007; DeryuginaE.I. etal., 2010). Публикации последнего десятилетия свидетельствуют о том, что именно активность семейства матриксных металлопротеи-наз ММР тесно связана с клиническим течением РЯ. Кроме того, они могут быть перспективными маркерами в диагностикехарактера новообразований яичников. Цель работы:комплексное сравнительное изучение содержания фактора роста эндотелия сосудов и его рецепторов1 и 2 типа, матриксных металлопротеиназ 2 и 7 типа в сыворотке крови и опухоли больных доброкачественными новообразова-3
ниями, пограничными опухолями и раком яичников, оценка их взаимосвязи с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания.
Задачи исследования
-
Сравнить иммуноферментным методом содержание фактора роста эндотелия сосудов и его рецепторов 1 и 2 типа в сыворотке крови и опухоли больных доброкачественными новообразованиями, пограничными опухолями и раком яичников.
-
С помощью иммуногистохимического метода изучить уровни экспрессии содержания фактора роста эндотелия сосудов и его рецептора 2 типа в различных морфологических вариантах рака яичников и сравнить их с таковыми показателями, определенными иммуноферментным методом исследования в первичных опухолях яичников.
-
Изучить содержание матриксных металлопротеиназ 2 и 7 типа в сыворотке крови и опухоли больных доброкачественными новообразованиями, пограничными опухолями и раком яичников.
-
Провести анализ содержания фактора роста эндотелия сосудов и его рецепторов 1 и 2 типа,матриксных металлопротеиназ 2 и 7 типа в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников с основными клиническими и морфологическими показателями заболевания.
-
Изучить возможности клинического использования показателей фактора роста эндотелия сосудов и его рецепторов 1 и 2 типа, матриксных металлопротеиназ 2 и 7 типа в сыворотке крови и опухоли больныхраком яичников.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное сравнительное исследование содержания фактора роста эндотелия сосудов и его рецепторов 1 и 2 типа, матриксных метал-лопротеиназ 2 и 7 типа в сыворотке крови и опухоли больных доброкачественными новообразованиями, пограничными опухолями и раком яичниковс учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.
Доказано, что содержание VEGF в сыворотке крови и опухоли больных раком яичниковдостоверно выше, чем у больных доброкачественными и погранич-4
ными новообразованиями, а уровень сывороточногоVEGF достоверно выше у всех групп больных по сравнению со здоровыми женщинами.Показано, что уровень VEGF в сыворотке крови больных раком яичниковзависит от стадии болезни, гистологического строения и степени дифференцировки опухоли, тогда как содержание VEGF в опухоляхсвязано с возрастом пациенток и гистологическим строением опухоли.
Показатели VEGF-R1 в сыворотке крови и опухоли больных доброкачественными новообразованиями, пограничными опухолями и раком яичниковне различались. У больных раком яичников содержание VEGF-R1 в сыворотке крови и опухоли не зависело от основных морфологических характеристик новообразования (гистологического строения и степени дифференцировки).Однакоуровни сывороточного VEGF-R1 были достоверно выше при распространенных III-IV стадиях заболевания, а показатели VEGF-R1 в этих опухолях были достоверно выше в эндометриоидных, чем в серозных и муцинозныхаденокарциномах.
Не установлено достоверной связи между концентрациями VEGF и VEGF-R2 в сыворотке крови и экспрессией этих маркеров в опухолях больных раком яичников, оцененнойиммуногистохимическим методом.
Доказано, что уровень ММР-7 в сыворотке крови больных раком яичников-достоверно выше, чем в контроле, и у больных пограничными и доброкачественными новообразованиями. У больных раком яичников выявлена прямая достоверная корреляционная зависимость между содержанием ММР-7 в сыворотке крови и опухоли, хотя содержание ММР-7 в опухоли не отражало гистологический вариант и степень ее дифференцировки, стадию заболевания, наличие асцита.
Практическая значимость
Доказано, что одновременное определение соотношения биохимических показателей VEGF-R1/CA-125 и VEGF/VEGF-R2 в сыворотке крови больных новообразованиями яичников можно использовать как дополнительные биологические маркеры в дооперационной диагностике заболевания. Применение многофакторного анализа значений СА-125, VEGF, VEGF-R1 и VEGF-R2 в сыворотке
крови, показало точность распознавания злокачественного характера новообразования яичника в 85% (чувствительность - 75%, специфичность - 93%).
Выявление повышенной экспрессии VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2, ММР-2 и ММР-7 в опухоляхбольных раком яичников свидетельствует о том, что эти бел-кимогут рассматриваться как мишени патогенетической терапии с целью возможного введения в схемы лечения этих пациенток препаратов, регулирующих ключевые этапы неоангиогенеза и инвазивную активность опухоли.
Количественное определение уровня VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2, ММР-2 и ММР-7 в сыворотке крови и опухоли больных новообразованиями яичников в сочетании с основными клинико-морфологическими показателями позволит дифференцированно подходить к выбору методов и оценке прогноза.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Содержание VEGF в сыворотке крови и опухоли больных раком яичников достоверно выше, чем при доброкачественных, пограничных новообразованиях и в контроле. При этомсывороточный VEGF зависел от стадии, гистологического строения и степени дифференцировки рака яичников.
-
Уровни VEGF-R1 в сыворотке крови и опухоли больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников не различались. Однако у больных раком яичников сывороточный VEGF-R1 был достоверно выше при распостраненных стадиях и в эндометриоидных аденокарциномах.
-
Показатели сывороточного VEGF-R2 достоверно различались между больными пограничными и доброкачественными новообразованиями, в контроле и при раке яичников, были достоверно ниже при I стадии и в высокодифферен-цированных опухолях.
-
Не установлено достоверной связи между сывороточными уровнями VEGF и VEGF-R2 и экспрессией этих маркеров в опухоли больных раком яичников, анализированных иммуногистохимическим методом.
-
Выявлено достоверное повышение уровня сывороточного ММР-7 у больных раком яичников, чем при доброкачественных, пограничных новообразованиях
и в контроле, а также при серозных аденокарциномах, распространенных III-IV стадиях и при снижении степени дифференцировки опухоли. 6. Содержание ММР-7 достоверно выше взлокачественных, чем в доброкачественных опухолях яичников, при этом выявлена достоверная связь между содержанием ММР-7 в сыворотке крови и опухоли.
Личный вклад автора
Автор лично участвовал в обследовании и хирургическом лечении больных новообразованиями яичников, обработке и анализе полученных результатов исследования.
Внедрение результатов исследования в практику
Полученные результаты исследования внедрены в клиническую практику ГКБ №15, ГКБ №50 (Москва). Материалы диссертации используются на лекционных, семинарских занятиях с курсантами циклов повышения квалификации врачей на кафедре репродуктивной медицины и хирургии ФПДО МГМСУ.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась 14 марта 2013г. на совместной научной конференции сотрудников кафедры репродуктивной медицины и хирургии ФПДО ГБОУ ВПО «МГМСУ имениА.И.Евдокимова» Минздравсоцразвития России, отделения комбинированных и комплексных методов лечения гинекологических заболеваний ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имениВ.И.Кулакова» МЗ РФ, хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.
Материалы диссертации доложены наВсероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 1-3 октября 2008г.); XII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 18-20 ноября 2008г.); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 11-15 апреля 2011г.);38thMeetingoftheInternationalSocietyofOncologyandBioMarkers
(ISOBM) (3-8 September, 2010, Munchen, Germany), VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 17-20 января 2012г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Малоинвазивные инструментальные методы оценки ангиогенеза в опухолях
Введение. На протяжении ХХ века ученые пытались сформулировать признаки, отличающие опухолевые клетки и ткани от их нормальных предшественников. Прогресс в данной области, затруднялся огромным биологическим разнообразием проявления новообразований. Тем не менее, основоположники молекулярной онкологии D.Hanahan и R.Weinberg [148] обобщили эти признаки и показали, что почти все опухоли характеризуются несколькими неотъемлемыми чертами, перечисленными ниже: 1) самодостаточность в отношении сигналов пролиферации; 2) потеря чувствительности к сигналам, сдерживающим процесс пролиферации, обусловленная инактивацией супрессорных (антимитотических) белков; 3) замедление процессов программируемой клеточной гибели, вследствие дисбаланса биохимической регуляции апоптоза; 4) неограниченный репликативный потенциал клеток (преодоление «лимита Хэйфлика»), сопряженный с реактивацией экспрессии фермента теломеразы, и, как следствие, отсутствием физиологического укорочения теломер; 5) стимуляция процессов ангиогенеза в опухоли направлена на удовлетворение повышенных потребностей быстроделящихся неопластических компонентов в оксигенации; 6) способность к инвазии и метастазированию, ассоциированная с продукцией опухолью протеолитических ферментов и факторов, угнетающих локальный иммунитет; 7) геномная нестабильность, опосредованная инактивацией систем репарации ДНК и нарушениями в молекулярном контроле клеточного цикла; 8) перестройка стромальных компонентов создает более благоприятные условия для эволюции злокачественного клона.
Выше представленные компоненты опухолевого роста не следует считать догмой – напротив, они будут постоянно пополняться новыми фактами и гипотезами. Данный обзор литературы посвящен ключевым факторам неоангиогенеза и матриксным металлопротеиназам у больных новообразованиями органов женской репродуктивной системы.
Ангиогенез в норме и при опухолевой трансформации Неоангиогенез, или формирование новых микрососудов на основе уже существующих в ткани опухоли, необходим для ее роста и развития метастазов, а также снабжения опухолевых клеток питательными веществами и кислородом [124, 140, 259]. Наиболее важным событием по ангиогенезу было открытие основного активатора неоангиогенеза – фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), которое было сделано независимо друг от друга, по крайней мере, четырьмя группами ученых [100, 146, 172, 191].
Ангиогенез - сложный и тонко регулируемый процесс, который связан с активацией 82 генов [207]. Известно, что инактивация (knockout) генов, регулирующих экспрессию VEGF и его рецепторов - летальна для макроорганизма [93, 120].
Последовательность событий, приводящая к васкуляризации новообразований, может быть отражением этапов физиологического ангиогенеза, который происходит, при заживлении ран, циклическом росте сосудов в органах женской репродуктивной системы [101, 183, 243, 253, 278], включая развитие фолликула и желтого тела в яичнике, а в эндометрии - во время менструального цикла [128, 142, 247]. D.Menendez et al. [208] выявили тесную связь между экспрессией VEGFR-1, РЭ и р53 что, чрезвычайно важно для физиологии яичников. При этом, ключевую роль в выше указанных физиологических процессах ангиогенеза играет VEGF, а его ингибиторы, и среди них VEGF Trap, подавляют овуляцию [132].
Кроме опухолей, ангиогенез также может быть компонентом многих патологических процессов, которые J.Folkman назвал «ангиогенными заболеваниями» и среди них атеросклероз (гиперпролиферация vasa vasorum в атеросклеротической бляшке), псориаз, диабетическая ретинопатия, меноррагия, эндометриоз, синдром гиперстимуляции яичников.
Пристальный интерес исследователей к проблеме ангиогенеза при новообразованиях органов женской репродуктивной системы связан с тем, что в опухолях он способствуют более свободной инвазии клеток в окружающие органы и ткани, облегчая этим процесс метастазирования [183, 231, 305]. Метастазы в свою очередь также могут быть островками активного неоангиогенеза, следовательно, и опухолевой диссеминации [126]. В определенном смысле опухолевый неоангиогенез может рассматриваться как приспособительный механизм, с помощью которого обеспечиваются метаболические процессы. Для самой же опухоли ангиогенез является «положительным» фактором, обеспечивающим ее существование. Однако он является «губительным» для организма-опухоленосителя.
Опухолевый ангиогенез имеет ряд характерных особенностей, а именно, постепенное и безвозвратное приобретение опухолью ангиогенного фенотипа [48, 119, 125, 130, 142].
Важным аспектом в изучении ангиогенеза в опухолях органов женской репродуктивной системы в настоящее время является использование этого показателя как одного из маркеров прогноза болезни. Кроме того, исследование ангиогенеза в опухоли имеет практическое значение, так как разработка антиангиогенных препаратов - одно из перспективных направлений в современной онкологии. Используемый ранее эмпирический подход со случайным перебором тысяч биологически активных веществ, постепенно замещается поиском действительно специфических противораковых средств, направленных на основные мишени опухолевой трансформации, в том числе и на активаторы ангиогенеза [111, 246, 302].
Следует отметить, что наиболее заметные исследования в проблеме опухолевого ангиогенеза были сделаны в начале 70-годов XX века группой ученых под руководством J.Folkman. Исследователи показали, что опухоли, имплантированные в изолированные перфузированные органы, не развивались [129]. Однако, если эти опухоли были имплантированы в глазную камеру в пределах 6 мм от кровеносных сосудов радужки, в них развивался ангиогенез, они быстро росли и метастазировали [142, 143]. Это наблюдение навело J.Folkman на мысль, что солидные опухоли полностью зависят от ангиогенеза, когда вырастают в диаметре до 2 мм и, что для увеличения их диаметра должно быть соответствующее увеличение плотности сосудов растущей опухоли [125, 127, 129]. Это - критический момент, для прогрессии опухоли и в результате неоангиогенеза она превращается из небольшого, неопасного для организма кластера мутантных клеток в опухоль, способную к росту, инвазии и метастазированию [124].
Другое исследование опубликовано J.Folkman в «Journal of National Cancer Institute» в 1990 г. и было озаглавлено «Доказательства зависимости опухоли от ангиогенеза» [127]. В этой статье автор собрал ряд ключевых доказательств того, что процесс ангиогенеза необходим для развития опухоли.
По мнению J.Folkman, для того, чтобы опухоль могла развиваться, на каждые 10-100 вновь образующихся опухолевых клеток должна образовываться как минимум одна эндотелиальная клетка. При отсутствии кровоснабжения опухолевых культур, их рост ограничивается определенными размерами и метастатическая активность резко падает [129]. Подобные результаты получены также в клинических наблюдениях при меланоме [70], РМЖ [78], опухолях мозга [80], РЯ [153, 284], раке почки [34, 43, 51], плоскоклеточном раке головы и шеи, раке легкого, гастроинтестинальных опухолях и подтверждают роль ангиогенеза в росте новообразований.
По мнению J.Folkman [126] в развитии опухоли следует выделять две фазы: I фаза безсосудистая - для которой характерен замедленный рост новообразования; II фаза сосудистая - когда ускоренное развитие опухоли происходит под влиянием ангиогенных факторов. Ангиогенезу предшествуют пролиферация и миграция эндотелиальных клеток, выстилающих сосуды микроциркуляторного русла. Мигрирующие эндотелиальные клетки, подобно опухолевым клеткам, секретируют ангиогенные вещества. Нормальные клетки часто секретируют низкие уровни индукторов ангиогенеза, которые компенсируются высокими уровнями ингибиторов ангиогенеза.
Характеристика лабораторных методов исследования
До недавнего времени основной характеристикой активности неоангиогенеза в опухолях была микроскопическая оценка плотности сосудов в опухолевой ткани с применением ИГХ метода окраски сосудов специфическими маркерами эндотелиальных клеток такими, как CD31, CD34 и VIII-фактор [19, 304, 306]. Однако, данный метод оценки ангиогенеза не всегда бывает объективным, а некоторые исследователи не выявили связи между степенью выраженности ангиогенеза в РЯ с основными клиническими характеристиками заболевания [255] и его прогнозом [135, 283].
S.B.Fox [131] сравнил несколько альтернативных методов оценки активности ангиогенеза при РМЖ (ИГХ, сцинтимаммографии, доплерографии, МРТ) и не рекомендовал в практику для оценки прогноза и выбора метода лечения, связано это с низкой их чувствительностью и специфичностью.
Недавно получены антитела к эндоглину (E-9, ТЕС-11) и интегрину осирЗ (LM-609), которые, как полагают авторы, специфичны к активированным/пролиферирующим ЭК [42]. Однако, подсчет плотности микрососудов в опухоли - субъективный метод, достаточно трудоемкий, поэтому использовать его для рутинной работы сложно, хотя применение компьютерной системы анализа изображения позволяет оценить такие дополнительные морфологические признаки, как количество сосудов внутри «горячего пятна», площадь просвета сосудов и ее периметр, процент иммуноокрашенных областей. R.Haubner [152] считает более перспективным использование радиофармпрепаратов в оценке опухолевого ангиогенеза -моноклональных антител к фибронектину (ED-B+) и лигандов интегрина avp3, меченных 18F, 99mTc, ш1п, 90Y. Однако, это данные экспериментов.
Большой интерес для практических онкологов представляет неинвазивный метод оценки васкуляцизации РЯ с помощью допплеровской ультрасонографии. Так, в ретроспективном исследовании 49 больных РЯ с помощью выше указанного метода J.L.Alc azar et al. [58] показали, что васкуляризация первичной опухоли этих пациенток выше при распространенном и метастатическом РЯ по сравнению с ранними стадиями.
В работе I.Thomassin-Naggara et al. [289] обследование 41 больной РЯ с помощью динамического МРТ-контрастирования помогло выделить ДНЯ, ПОЯ и РЯ, а изученные на МРТ показатели коррелировали с ангиогенным статусом первичной опухоли и экспрессией VEGF. Интерес вызвали предварительные данные по выявлению и изучению фокусов экспрессии VEGF и VEGFR-2 методом ПЭТ [218]. Преклинические экспериментальные исследования на моделях РЯ, леченных антиангиогенными препаратами, показали, что введение [18F]FDG позволило оценить ответ первичной опухоли с помощью ПЭТ через 2 часа после введения препарата [176].
Поскольку VEGF является ключевым активатором ангиогенеза, до настоящего времени дискутируется вопрос о том, где его следует определять у онкологических больных, в том числе и при РЯ, в оценке клинической значимости и прогноза заболевания [186]. Исследователи выявили достоверно более высокие показатели VEGF в моче [114], в плевральной [178], перикардиальной [205] и перитонеальной [313] жидкостях онкологических больных по сравнению с практически здоровыми людьми. По данным C.Kut et al. [186] самые высокие концентрации VEGF обнаружены в цитозолях опухолей. В работе по анализу расчетных моделей транспорта VEGF in vivo Mac Gabhann F. et al. [197] показали, что свободный VEGF составляет приблизительно 1% от общего внеклеточного VEGF в тканях (внеклеточный VEGF включает фактор роста свободный, связанный с матриксом и рецепторами поверхности клеток).
В результате изучения молекулярных механизмов ангиогенеза было продемонстрировано наличие целого ряда регуляторных эндогенных ангиогенных маркеров, среди которых наиболее значимыми считаются VEGF, ангиопоэтины 1 и 2 (Ang-1, Ang-2), интерлейкин 6 и 8 (IL-6, IL-8), плацентарный фактор роста (PlGF), тромбоцитарный фактор роста эндотелия (PD-ECGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор некроза опухоли-ос (TNF-oc), основной фактор роста фибробластов (bFGF), трансформирующий фактор роста-ос (TGF-oc), TGF-P, колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интегрины осир3, осир5, оСоРь Е-кадхерин, ММР, COX-2, хемокины, эфрины, uPA, tPA, а также и эндогенных антиангиогенных факторов (VEGF-R1, растворимый VEGF-R1, Ang-2, тромбоспондин-1,-2, ангиостатин, кринглины плазминогена, эндостатин, вазостатин, TIMPs, гепарин, PAI-I, интерефероны-ос, -Р, -у, IP-10, IL-4, IL-6, IL-12, IL-18, пролактин), динамический баланс которых обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли [31, 60, 141, 184, 201, 209, 211, 224, 295]. Не меньший интерес у исследователей вызывает изучение экзогенных проангиогенных и антиангиогенных факторов [27, 32, 183, 201].
В литературе представлен ряд генетических маркеров ангиогенеза, которые уже показали обнадеживающие результаты и среди них: 3 одновременно выявленных единичных нуклеотидных полиморфизмов, связанных с повышенной продукцией VEGF и как следствие снижающих общую выживаемость пациентов [153]; профиль 34 ангиогенных генов, предсказывающих продолжительность общей выживаемости больных РЯ [207]; высокая экспрессия ангиогенных маркеров STC2, EGFL6, FZD10, которые экспрессируются ЭК в опухолях и ассоциированы с низкими показателями безрецидивной выживаемости больных РЯ [81].
Представлены данные по использованию других биомаркеров ангиогенеза и, в частности IL-6, высокое содержание которого в сыворотке крови позволяет рассматривать этот цитокин в качестве маркера агрессивного течения РЯ и планировать выбор объема хирургического вмешательства [9]. Известно что чрезмерная секреция IL-6 наряду с ТGF- подавляет иммунный ответ к опухолевым клеткам и усиливает формирование васкуляризированной стромы, без которой опухоль не может развиваться [160]. Кроме того, предвестником рецидива после таргетной терапии больных РЯ может служить IL-8, который играет важную роль в механизмах ангиогенеза и туморогеназа независимо от VEGF [211]. В исследовании A.M.Schultheis et al. [271] показано, что IL-8 A-252T полиморфизм может служить молекулярным маркером базовой BEV химиотерапии больных РЯ, а рАКТ – предиктором резистентности к иматинибу [273].
Стимуляция ЭК опухолевых сосудов ангиогенными факторами, продуцируемыми клетками самой опухоли, привлекает в опухолевое поле макрофаги, лимфоциты, тромбоциты, тучные клетки, участвующие в воспалительных реакциях. ЭК усиливают ангиогенный сигнал и сами продуцируют ряд цитокинов, которые способствуют митогенной стимуляции эндотелия [110, 245]. Следует указать, что ЭК вновь образованных сосудов внутри опухоли являются более зависимыми от VEGF как митогена на выживание по сравнению ЭК сосудов в других областях тела человека [171]. При этом S.Seaman et al. [272] показали, что ЭК в РЯ характеризуются нарушением экспрессии ряда генов, в том числе и ангиогенных, а по данным K.Hida et al. [157] опухолевый эндотелий может также отличаться и по цитогенетическим характеристикам по сравнению с нормальным. Важной особенностью сосудов, питающих опухоль, является их повышенная проницаемость
Связь содержания VEGF в сыворотке крови больных новообразованиями яичников с наличием соматического заболевания, абортов и родов
Одной из наиболее значимых следует признать публикацию S.Sillanpaa et al. [279], проанализировавших 292 РЯ. В этом исследовании показано, что ММP-9 присутствует почти во всех исследованных тканях, однако клиническое значение экспрессии этой протеазы в эпителиальных опухолевых клетках и в строме противоположно. Так, с увеличением распространенности процесса уменьшается процент опухолевых клеток с высокой экспрессией ММP-9 и увеличивается доля таких клеток в строме. В соответствии с этим при однофакторном анализе общей группы больных было продемонстрировано увеличение 10-летней выживаемости у больных с высоким уровнем экспрессии ММP-9 в опухоли и ее уменьшение при высоком уровне экспрессии этой протеазы в строме. При многофакторном анализе сохранилось только прогностическое значение уровня экспрессии ММP-9 в опухолевых клетках при I стадии РЯ по FIGO. Авторы предположили, что ММP-9 играет двойную роль в прогрессии РЯ, препятствуя распространению опухоли, если она находится на эпителиальных клетках, и способствуя ему, находясь на клетках стромы.
В аналогичном исследовании, включавшем 90 больных РЯ, высокая экспрессия ММP-9 выявлена в опухолевых клетках в 97% случаев, а в клетках стромы – в 70% [170]. Высокая экспрессия ММP-2 обнаружена этими исследователями в опухолевых клетках в 54% случаев, а в строме – в 38%. Высокая стромальная экспрессия обеих ММP была ассоциирована с такими показателями агрессивности процесса как поздняя клиническая стадия, наличие асцита, положительный статус лимфатических узлов. В однофакторном анализе по методу Каплана-Майера показателем неблагоприятного прогноза общей выживаемости оказалась высокая экспрессия ММP-9 и ММP-2 не только в строме, но и в эпителии опухоли, однако в многофакторном тесте независимым прогностическим фактором оказалась только стромальная ММP-9.
S.Ozalp et al. [234] ретроспективно исследовали опухоли 45 больных (30 – РЯ и 15 – ПОЯ), оценивая интенсивность ИГХ окрашивания на ММP-9 по трехбалльной шкале. Интенсивность окрашивания эпителиальных клеток в злокачественных опухолях была более высокой, чем в ПОЯ, а уровень экспрессии ММP-9 в строме РЯ и ПОЯ достоверно не различался. Уровень экспрессии ММP-9 в эпителиальных клетках злокачественных опухолей не зависел от стадии заболевания и не оказывал влияния на выживаемость больных. В то же время, как и в вышеописанных исследованиях, высокий уровень экспрессии ММP-9 в строме РЯ оказался фактором неблагоприятного прогноза. A.Demeter et al. [105], оценивавшие зимографически активность ММP-2 и ММP-9 в экстрактах опухолей, асцитической жидкости и сыворотке крови 27 больных эпителиальными опухолями яичников, показали, что только активность ММP-9 была достоверно повышена в опухолях и асците тех пациенток, у которых за время 30-месячного наблюдения возник рецидив, по сравнению с нерецидивировавшими.
В большом ретроспективном исследовании S.Sillanpaa et al. [279] иммуногистохимически оценена экспрессия ММP-2 в 295 первичных опухолях и 67 метастазах РЯ и показано, что низкая экспрессия этой протеазы в опухолевых клетках ассоциирована с 3 степенью злокачественности и эндометриоидным типом опухоли. При многофакторном анализе высокий уровень экспрессии ММP-2 в опухолевых клетках оказался фактором благоприятного прогноза 10-летней безрецидивной выживаемости больных РЯ. В то же время, M.Perigny et al. [241], исследуя ретроспективно опухоли и перитонеальные имплантаты 100 оперированных в 1990-2000 гг. больных РЯ III стадии, показали, что гиперэкспрессия ММP-2 в опухолевых клетках перитонеальных имплантатов ассоциирована с ухудшением общей выживаемости больных по данным многофакторного анализа, при этом экспрессия этой коллагеназы в клетках первичных опухолей не влияла на прогноз. А ранее X.Wu et al. [310], используя комплекс методов (полуколичественный RT-PCR анализ, ИГХ, иммуноблоттинг), показали, что уровень экспрессии ММP-2 в РЯ выше, чем в эпителиальных ДНЯ, не зависит от основных клинико-морфологических характеристик, но является фактором неблагоприятного прогноза.
Еще в одном исследовании P.L.Torng et al. [292] изучали экспрессию ММP-2, активатора ММP-2, МТ1-ММP и ТIМP-2 в 35 эндометриоидных и 49 серозных РЯ, сопоставляя результаты со стадией, степенью злокачественности и размером опухоли, а также безрецидивной и общей выживаемостью больных. Однофакторный анализ показал, что высокая стромальная экспрессия ММP-2 достоверно связана с распространенной стадией, высокой злокачественностью и серозным гистотипом опухоли, меньшим размером первичной опухоли во время операции, а также с большей частотой рецидивов заболевания. Однако уровень экспрессии ММP-2 не влиял на уровень смертности больных. При многофакторном анализе стромальная экспрессия ММP-2 влияла только на выживаемость больных эндометриоидным РЯ. Матрилизин (ММР-7). В эту подгруппу помимо ММР-7 входит еще ММР-26, называемая также эндометазой или малой протеазой эндометрия. Помимо разрушения компонентов ВКМ, ММР-7 участвует в процессинге некоторых молекул клеточной поверхности - Fas-лиганда, проNF-a, Е-кадгерина. Секреция ММР-7 эпителием РЯ стимулируется VEGF и IL-8. В опытах in vitro показано, что ММР-7 увеличивает инвазивность клеток РЯ, активируя про-ММР-2 и про-ММР-9 [300].
Впервые усиление экспрессии ММР-7 в опухолях яичников было продемонстрировано H.Tanimoto et al. [286], исследовавшими методом RT-PCR 32 РЯ, 12 ПОЯ и 10 нормальных яичников. Уровень мРНК этой протеазы оказался повышенным примерно в 75% РЯ и ПОЯ. В дальнейшем эта же группа авторов, исследовав 44 муцинозных РЯ, ИГХ подтвердили увеличение экспрессии матрилизина в клетках РЯ, независимо от степени их злокачественности [276]. ММР-7 обнаружена в слизистом секрете этих опухолей. В то же время показано, что активность ММР-7 чаще выявлялась в РЯ (87%), чем в ДНЯ (28%) [134]. Интересно, что в отличие от описанных выше желатиназ ММР-7 не обнаружена в строме РЯ [133].
Наиболее репрезентативное исследование клинического значения ММР-7 при РЯ было представлено в работе S.M.Sillanpaa et al. [280]. ИГХ исследованы 284 первичных РЯ, 36 метастазов и 8 нормальных яичников. В опухолях эндометриоидного строения большая площадь и высокая интенсивность окрашивания на ММР-7 были достоверно ассоциированы с положительным окрашиванием ядер клеток на Р-катенин. Во всей группе в целом и в подгруппе неэндометриоидных раков низкий процент окрашивания на ММР-7 коррелировал с высокой степенью злокачественности опухоли, распространенной стадией и большим объемом остаточной первичной опухоли после операции. Оцененная ретроспективно 10-летняя безрецидивная и общая выживаемости больных оказались значительно лучше при высоком проценте интенсивного окрашивания на ММР-7, чем при низком, причем при многофакторном анализе этот показатель оказался независимым фактором благоприятного прогноза.
Связь показателей ММР-2 в сыворотке крови и опухоли с уровнями VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2 в сыворотке крови и опухоли до лечения у больных новообразованием яичников
Проблема РЯ считается одной из наиболее сложных в клинической и экспериментальной онкологии и связано это с уникальностью самой природы этого эндокринного органа и его роли в жизнедеятельности женского организма [13, 62]. РЯ занимает особое место в онкогинекологической практике и связано это с тем, что смертность от РЯ удерживает 1-е место, несмотря на то, что сама патология находится на 3-м месте в структуре онкологических заболеваний женских половых органов, уступая раку и шейки матки [35].
Несмотря на то, что к настоящему времени уже накоплен большой клинический опыт и достигнуты определенные успехи в лечении больных РЯ, выживаемость этих пациенток причины низкой выживаемости больных РЯ связаны с бессимптомным течением болезни на ранних стадиях; диагностическими ошибками, которые приводят к поздней диагностике заболевания; отсутствием полноценных высокочувствительных лабораторных молекулярно-биологических маркеров диагностики; низкой эффективностью комбинированных методов лечения [18]. При этом, большинство исследователей отмечают достаточно высокий процент рецидивов (23% и более) у больных с так называемыми «ранними стадиями» заболевания, которым была произведена радикальная операция [37]. При этом, летальность больных РЯ на первом году после установления диагноза составляет 35% [3].
Кроме того, многокомпонентное строение гонад, сочетание структур самых разных функциональных направлений обусловливает широкий спектр гистологических вариантов новообразований этого органа [24]. Если принимать во внимание еще и переходные формы, а также опухоли, в которых сочетаются два и более гистотипа, то количество вариантов опухолей яичников значительно возрастает [25].
Необычность патогенеза новообразований яичников подтверждается случаями мультицентрического роста, когда первичные опухоли обнаруживаются в забрюшинном пространстве, при выраженной диссеминации процесса по брюшной полости, но при абсолютно неизмененных яичниках [17]. Все выше указанное свидетельствует о необходимости неординарного подхода к изучению и терапии РЯ.
К сожалению, «ранняя диагностика» РЯ остается главной нерешенной проблемой в современной онкогинекологии [30]. До настоящего времени не разработаны программы скрининга РЯ, так как они не отвечают большинству требований к скринингам в онкологии [44]. При этом, главной причиной, почему не может быть рекомендован скрининг для РЯ, остается недостаточная чувствительность и специфичность основных клинических, инструментальных и лабораторных диагностических методов: пальпации, КТ и влагалищного УЗИ органов малого таза, определение концентрации СА-125 и HE4 в сыворотке крови. Поэтому международные эксперты ВОЗ не рекомендуют проводить скрининг всего женского населения из-за его низкой эффективности. Решение принято на основании того, что часто наблюдаемые ложноположительные результаты ведут к ненужному дорогостоящему обследованию и лапаротомиям, которые могут стать причиной опасных для жизни осложнений. Немногочисленное число выявленных больных с заболеванием на ранних стадиях не может перевесить возможного риска осложнений и дорогой стоимости данных скринингов [62]. Исключение могу составить пациентки с наследственным семейным синдромом [4].
Также, в настоящее время дискутируются вопросы о возможностях хирургического метода в лечении РЯ [117, 219], о числе проведения курсов неоадъювантной химиотерапии и интервалов между курсами, о возможностях интраперитонеальной химиотерапии цисплатины и паклитаксела [46].
В последнее десятилетие расширились возможности более углубленного изучения патогенетических механизмов развития онкологических заболеваний, в том числе и новообразований яичников [227]. Это связано с расширением лабораторных методических возможностей изучения роли ряда молекулярно-биологических факторов, конкретных молекул, которые тесно связаны с такими основными характеристиками новообразований, в том числе и РЯ, как инвазия и метастазирование [20, 23, 182]. Спектр факторов роста, различных цитокинов и их рецепторов, которые принимают активное участие в двух выше указанных процессах расширился за последние годы [12, 153].
Особое внимание исследователи уделяют изучению процессов неоангиогенеза, инвазии и метастазирования при развитии злокачественных опухолей яичников и роли ряда биологически активных маркеров на ключевых этапах этих процессов [20, 22, 26, 284]. Уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов, обеспечивающих снабжение клеток кислородом и питательными веществами [52, 126, 244]. Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза позволило перейти от микроскопической оценки плотности сосудов в опухоли к исследованию конкретных молекул, участвующих в регуляции образования и роста новых сосудов в опухолевой ткани. Ведущая роль среди таких регуляторов, безусловно, принадлежит VEGF [32, 42, 47, 119, 151]. При этом, ряд фактов указывает на то, что VEGF не только обладает проангиогенной активностью, но может и непосредственно участвовать в регуляции пролиферации клеток опухоли [284].
Исследования последних лет позволили по-новому взглянуть и на процессы ангиогенеза в репродуктивной системе женщин как при физиологических изменениях, так и при различных патологических состояниях [65, 274]. Показана роль VEGF и его рецепторов в процессе васкуляризации опухоли, взаимосвязи с прогнозом заболевания и эффективностью лечения ряда злокачественных опухолей, намечены новые направления терапевтических воздействий на злокачественный процесс [15, 257]. Появление в последние годы целого ряда молекулярно-направленных («таргетных») препаратов, специфически подавляющих активность VEGF и его рецепторов делает исследование этих показателей у больных различными новообразованиями, в том числе и РЯ, особенно актуальным [32, 47]. Тем, более, что R.A.Burger et al. [84] сообщили об эффективности антиангиогенного препарата Бевацизумаба в режиме монотерапии при рецидивах РЯ, а D.E.Cohn et al. [98], J.C.Chura et al. [96], D.L.Richardson et al. [256], J.D.Hurt et al. [163] показали целесообразность использования Бевацизумаба в комбинациях с различными цитотоксическими препаратами в лечении РЯ, хотя последние исследования проводили без оценки состояния экспрессии VEGF.
В последнее десятилетие пристальный интерес у исследователей привлекает ВКМ, который по мнению большинства из них является главным барьером, препятствующим инвазии опухолевых клеток в окружающие нормальные ткани, кровеносные и лимфатические сосуды. Следовательно, деградация ВКМ под влиянием ряда факторов, в том числе и ММР, секретируемых клетками опухоли и ее стромальными компонентами, может способствовать генерализации опухолевого процесса. ММР при РЯ считают одним из наиболее клинически перспективных направлений в области изучения роли этой протеолитической системы при опухолях яичников. Однако, регуляция активности ММР является сложным и до сих пор до конца не изученным процессом, важную роль в котором играют тканевые ингибиторы ММР - ТIМPs. В экспериментальных исследованиях продемонстрирована важная роль ММP-2 в формировании инвазивного потенциала клеток РЯ [174], причем индукция ММР является одним из ключевых механизмов проявления проинвазивных эффектов EGF [115, 116] и TGF- [260]. Показано также, что ММР-2, наряду с ММР-9 находятся в комплексном взаимодействии с ключевым активатором ангиогенеза – VEGF. С одной стороны, коллагеназы индуцируют секрецию VEGF опухолевыми клетками, что способствует образованию асцита [200, 314], а, с другой, секретируемый опухолью VEGF регулирует экспрессию коллагеназ в строме, влияя на инвазивную способность опухоли [72, 301]. При этом, активность некоторых ММР (ММР-2, ММР-9) в культивируемых клетках РЯ увеличивается под действием гормонов, биологически активных веществ, что приводит к активации инвазивной способности опухолевых клеток в тестах in vitro [194].
Стало быть, РЯ является одной из наиболее инвазивных злокачественных опухолей, а его высокий метастатический потенциал определяют необходимость углубленного изучения механизмов распространения опухоли, а именно, процессов неоангиогенеза и инвазии [104]. Представленные данные современной литературы [23, 104, 284] указывают на актуальность предпринятого нами сравнительного исследования содержания ММР, VEGF и его рецепторов (VEGF-R1, VEGF-R2) в сыворотке крови и опухоли больных РЯ, ПОЯ и ДНЯ.
