Содержание к диссертации
Список сокращений 5
ВВЕДЕНИЕ 6
1. Обзор литературы 11
Таксономия и номенклатура бактерий рода Campylobacter. 11
Биологические свойства бактерий рода Campylobacter 12
Морфологические свойства 12
Культуральные и биохимические свойства 14
Антигенные свойства 16
Антибиотикорезистентность 17
1.3. Роль бактерий рода Campylobacter в патологии человека 21
Историческая справка. Состояние заболеваемости кампилобактериозом 21
Факторы патогенности Campylobacter spp 24
Патогенез, клинические особенности течения кампилобактериоза 27
1.4. Основные источники бактерий рода Campylobacter
в среде обитания человека и их обнаружение в пищевых продуктах.
Пути передачи 30
1.5. Устойчивость бактерий рода Campylobacter в окружающей среде 37
1.6. Методы выделения бактерий рода Campylobacter из пищевых
продуктов 41
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы исследования 46
Изучение распространенности и количественного содержания бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах 46
Изучение биологических свойств Campylobacter spp., выделенных
из пищевых продуктов 48
Изучение видовой принадлежности 48
Изучение антибиотикорезистентности 50
1.3. Изучение патогенных свойств бактерий рода Campylobacter,
выделенных из пищевых продуктов 53
Изучение гемолитических свойств 53
Воспроизведение кишечной инфекции при пероральном введении Campylobacter jejuni, в эксперименте на белых мышах 53
2.1.4. Статистическая обработка результатов 55
2.2. Результаты собственных исследований 56
2.2.1. Разработка метода выявления и количественного определения
бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах 56
Адаптация, модификации и сравнительная оценка культуральных методов для исследования натурально контаминированных пищевых продуктов 58
Сравнительная оценка культуральных методов для исследования экспериментально контаминированных
пищевых продуктов 62
2.2.1.3. Оценка эффективности методов количественного
определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах 66
2.2.2. Изучение биологических свойств Campylobacter spp выделенных
из пищевых продуктов 70
Изучение видовой принадлежности 70
Изучение антибиотикорезистентности 73
2.2.3. Изучение распространенности и количественного содержания
Campylobacter spp. в пищевых продуктах 80
Изучение распространенности и количественного содержания кампилобактерии в сырьевых пищевых продуктах 80
Изучение распространенности и количественного содержания кампилобактерии в продуктах, готовых к употреблению 88
2.2.4. Изучение патогенности Campylobacter jejuni, выделенных из
пищевых продуктов 90
Изучение гемолитических свойств 90
Воспроизведение кишечной инфекции, вызванной Campylobacter jejuni в эксперименте на белых мышах 90
Обсуждение результатов исследования. 101
ВЫВОДЫ 113
Список литературы 115
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ-антигены;
АЛА - антилизоцимная активность;
АМП - антимикробные препараты;
ЗЗР - зона задержки роста;
ОСМ - оптический стандарт мутности;
ПТИ - пищевые токсикоинфекции;
ПУ - промежуточная устойчивость;
ЖКТ - желудочно - кишечный тракт;
ЖНКФ - жизнеспособные некультиьируемые формы бактерий;
FDA - Food & Drag Administration (Управление по контролю за качеством
пищевых продуктов и лекарственных препаратов (США); ISO - Международная организация стандартизации; GBS - Guillian-Barre Syndrome (Гиллиан - Барр синдром).
Введение к работе
По данным ВОЗ, в последние годы микроаэрофильные и термотолерантные бактерии рода Campylobacter являются одним из основных причинных агентов диарейных заболеваний у людей во всем мире. Почти во всех развитых странах кампилобактериоз обуславливает большее количество случаев диареи с пищевым путем передачи, чем бактерии рода Salmonella, Shigella и E.coli [Rautelin Н. et al., 2000; Friedman J. et al., 2000; Mead P.S., SlutskerL. etal., 1999;Tauxe RV., 1992; Altekruse S.F., Stem N.J. et al., 1999]. В развивающихся странах именно бактерии рода Campylobacter являются наиболее распространенной причиной кишечных заболеваний (64-96/100 тыс.нас. в год) и смертности от них у детей до 2-х лет жизни [Oberhelman R.A., Taylor D.N., 2000; Coker О. A.. Isokpehi D. R., 2002; Adetunji J., 2000].
В Российской Федерации официально регистрируется незначительное число заболеваний кампилобактериозом (0,27 на 100 тысяч населения) однако, наблюдается явный рост кишечных инфекций с не установленным возбудителем, число которых в 2005г. составило 66 % [Инф. заб. В РФ. 2006]. При этих заболеваниях также, как в Европе, превалирует пищевой путь передачи, а спорадическая форма заболеваемости многократно превышает вспышечную. В целом, это дает основания полагать, что за существенную долю нерасшифрованных пищевых инфекций и отравлений в нашей стране ответственны те бактериальные агенты, состояние диагностики которых до сих пор неудовлетворительно, в первую очередь - бактерии рода Campylobacter.
По данным зарубежных исследователей до 70% случаев кампилобактериоза связано с употреблением контаминированных пищевых продуктов и воды [FDA, 2001; Vellinga A. etal., 2002].
Многочисленные эпидемиологические исследования
идентифицировали употребление мяса птицы в качестве основного фактора риска при кампилобактериозе [Deming M.S. et al., 1987; Effler P. et al., 2001;
7 Friedman С. et al., 2000; Neal K.R. et al., 1995; Rodrigues L.C., et al., 2001; Neal K.R., et al., 1997; Eberhart-Phi Hips J. et al., 1997]. К потенциально опасным продуктам относят также сырое молоко, овощи, салаты [Rohrbach B.W. et al., 1992, Hudson P.J. et al., 1984; Evans M.R., 2003; Wanyenya I. et al., 2004]. Однако, точный вклад, который вносит употребление вышеуказанных продуктов, в заболеваемость кампилобактериозом не определен.
Недостаточно изученным остается влияние новых технологий упаковки (полимерная упаковка, модифицированная газовая среда) и различных факторов, оказывающих воздействие на продукт (охлаждение, замораживание) в процессе продвижения его к потребителю, на сохранность и биологические свойства возбудителя кампилобактериоза. Недостаточно изучена взаимосвязь отдельных видов Campylobacter spp. с различными видами пищевых продуктов, значительно варьируются данные об уровнях инфицирующих доз [Evans M.R., 2003; Eberhart-Phillips J. et a!.. 1997; Friedman C.R. et al., 2004; Blaser M.J. et al., 1986; Black R.E. et al., 1988; ButzlerJ.P. etal., 1984].
Работ, посвященных изучению загрязненности пищевых продуктов Campylobacter spp., в нашей стране крайне мало. [Минаева Н.З.. 1992; Порин А.А., 1990; Алабугина Т.В.,1998]. Имеющиеся данные не пригодны для оценки микробиологического риска, по причине использования авторами разных методических подходов к культивированию Campylobacter spp., не учитывающих специфику выделения их из пищевых продуктов, к тому же, они не предусматривают количественного определения кампилобактерий, что является обязательным для современной оценки микробиологического риска.
Таким образом, учитывая возросшее в последние годы влияние кампилобактерий на возникновение острых кишечных инфекций у людей, особую важность приобретает не только усовершенствование диагностики
8 инфекции, но и оценка потенциального риска для потребителей
загрязненности пищи бактериями рода Campylobacter.
Необходимо отметить, что модель оценки микробиологического риска на современном этапе, признана наиболее эффективным подходом к управлению рисками и разработке мер направленной профилактики. Для ОМР необходимо иметь данные о загрязненности пищевых продуктов конкретными видами микроорганизмов, особенностях биологических свойств возбудителей, наличии у них факторов патогенности, характере их взаимодействия с макроорганизмом, что позволяет оценить степень наносимого ими вреда для здоровья человека [Buchanan R.L., 2000; Lammerding A.M., Fasil A., 2000].
Исходя из вышеизложенного, была определена цель исследования: оценить риск загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Адаптировать имеющиеся в международной практике культуральные методы обнаружения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и разработать доступный для практических исследований метод выявления и количественного определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах.
Изучить распространенность и количественное содержание бактерий рода Campylobacter в мясе птицы и птицепродуктах (сырых и готовых у употреблению), сыром коровьем молоке.
3. Изучить видовые характеристики выделенных из пищевых
продуктов штаммов Campylobacter spp., наличие у них маркеров
антибиотикорезистентности и факторов патогенности.
4. В экспериментах на животных с пероральным введением бактерий
рода Campylobacter изучить степень их вредного воздействия на
макроорганизм в зависимости от дозы и биологических свойств возбудителя.
9 НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые в нашей стране получены данные по частоте загрязнения и количественному содержанию бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах массового потребления. Установлено широкое распространение Campylobacter spp. в птицепродуктах куриных сырых (37%) при невысоком количественном содержании (от4 до 1100 КОЕ/1 ООг, медиана- 15 КОЕ/1 ООг, 90% - 240 КОЕ/1 ООг). Показано отсутствие кампилобактерии в пищевых продуктах, готовых к употреблению, в том числе, упакованных в пленочные оболочки и модифицированную газовую атмосферу, а также изготовленных в мелкорозничных предприятиях сети общественного питания быстрого обслуживания (салаты многокомпонентные с добавлением мяса птицы, куры -гриль, шаурма).
Установлено доминирование термофильного вида Campylobacter jejuni в птицепродуктах куриных сырых.
Впервые охарактеризованы биологические особенности Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов. Установлено, что все штаммы обладали устойчивостью к антимикробному препарату группы фторхинолонов (ципрофлоксацину). Сочетанной устойчивостью к двум и более антибактериальным препаратам обладали 90% штаммов.
Впервые обнаружена способность штаммов Campylobacter jejuni, выделенных из замороженных птицепродуктов, чаще (в 74%) формировать при культивировании морфологически измененные формы колоний (R-формы).
Обнаружено существенное (в 10 раз) снижение количества жизнеспособных клеток Campylobacter spp. в процессе морозильного хранения в течение 3 недель и более. Установлено, что в пробах мяса и полуфабрикатов птицы, полученных из торговой сети и после манипуляций в быту (оттаивание, нарезка и повторное замораживание), частота
10 обнаружения Campylobacter spp. была в 2-4 раза ниже, чем в пробах, отобранных после окончания технологического процесса.
Установлено, что штаммы Campylobacter jejuni, выделенные из пищевых продуктов, находящихся в обороте, способны при пероральном введении обусловливать развитие кишечной инфекции у здоровых взрослых лабораторных животных (белых мышей).
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Разработаны методические указания «Методы выявления и определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах». М: Роспотребнадзор, 2007 (в печати) Методические указания могут использоваться для исследования пищевых продуктов на соответствие требованиям безопасности, при расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи, а также при производственном контроле.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Результаты работы доложены на Восьмом всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации» (Москва, 2005) и I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты» (Москва, 2006), межлабораторной конференции ГУ НИИ питания РАМН (Москва, 2006).
ПУБЛИКАЦИИ
По результатам работы опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 2 статьи в научном журнале, определенном ВАК Минобрнауки РФ.
