Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Острую кишечную инфекцию кампилобактериоз, обусловленную термофильными представителями рода Campylobacter, сегодня повсеместно расценивают как одну из ведущих проблем здравоохранения со значительными социально-экономическими последствиями. Главными источниками причинного агента при ней являются пищевые продукты, получаемые от продуктивного скота и птицы, особенно от бройлерных кур, выращиваемых путём интенсивного откорма [Шурышева Ж.Н., 2007; Hara-Kudo Y., et al. 2010, Wilson D.J., 2008; de Jong A.E., 2008]. В EC кампилобактериоз отнесен к самым распространённым заболеваниям среди зоонозов с числом случаев 45,6 на 100000 населения [EFSA, 2005,2009]. Подобная ситуация имеет место в США, где более чем в половине штатов показатели заболеваемости кампилобакте-риозом в 1,5-2 раза превышает таковые при сальмонеллёзе [CDC, 2005, 2008, 2010]. Повсеместный поступательный рост потребления мяса птицы в общем объёме потребляемых мясопродуктов соответственно всё более повышает и риск заражения потребителей ОКИ кампилобактериозной природы.
В нашей стране более чем за 20 лет с начала регистрации кампилобактериоза как самостоятельной нозологической формы число зафиксированных случаев в общей сумме ОКИ у населения остаётся минимальным (не более 0,3%). В то же время, доля ОКИ от неустановленных возбудителей на протяжении этих лет практически не снижалась, составляя 70-75% [Роспотребнадзор, 2006-2010], что свидетельствует о неотложности усовершенствования лабораторной диагностики.
Традиционные методы посева для определения трудно культивируемых по природе Campylobacter spp. не позволяют быстро осуществлять лабораторную диагностику инфекции, а также оценивать загрязнённость возбудителем пищевых продуктов при расследовании вспышек. В клинической практике, где стала весьма актуальной проблема дифференциальной лабораторной диагностики хронического кампилобактериоза от синдрома раздражённого кишечника, также резко возросла потребность в новых некультуральных методиках анализа Campylobacter spp. [Молочный В.П., Шипулин Г.А., 2007; Лучшев В.И., Жаров С.Н., 2007; Al Amri A., et al., 2007; Bessede E.,DelcampA.,2011].
Кроме того, важнейшим условием предупреждения кампилобактериоза является надёжный лабораторный контроль эффективности мер биобезопасности в основном источнике данного патогена - на птицеперерабатывающих предприятиях, который должен базироваться на адекватных для его осуществления методах с высокой чувствительностью, воспроизводимостью, скоростью и минимальной трудоёмкостью [Кафтырева Л.А.,1999, Покровский В.И. и др., 2009, Гущин В.В.,2009, 2010, EFSA, 2010].
Основой таких методов должен служить современный молекулярно-генетический анализ, который позволяет максимально специфично проводить определение возбудителя в пище и клиническом материале, идентификацию видовой принадлежности, факторов патогенности, типирование изолятов по характеристике нуклеиновых кислот. Учитывая преимущества в плане доступности приборной базы, отечественных тест-систем, низкой себестоимости анализа, задачам практической микробиологии в наибольшей степени удовлетворяет технология ПІДР с гибридизацион-но-флюоресцентной детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Этот формат, наряду с контаминационной безопасностью, имеет реальный потенциал для автоматизации и для оценки жизнеспособности анализируемых микробов [Тартаковский И.С., 2002; Josefsen М.Н., et al., 2004; Pitkanen Т., et al., 2009; Liibeck M., et al., 2010; Шипулин Г.А., 2010; Jacobsen N.R, et al, 2011].
Внедрение методов ПЦР позволит наладить мониторинг загрязненности пищевых продуктов кампилобактериями, своевременно выявлять критические в плане контаминации этим патогеном этапы в пищевой цепи и в процессе технологии, повысить эффективность диагностики кампилобактериоза. В перспективе это даст возможность для реализации одной из задач ОМР - подтверждения связи между потреблением инфицированных Campylobacter spp. продуктов и степенью риска отдалённых отрицательных последствий инфекции для здоровья, в т.ч. в виде гастроэнтерологических и неврологических осложнений, разработке мер для их направленной профилактики и минимизации [Lindqvist R., Lindblad М., 2008; FAO/WHO, 2009].
В то же время, обеспечить воспроизводимость и эффективность методики без исследований по адаптации выбранных тест-систем к условиям практических лабораторий, разработки адекватных приёмов пробоподготовки пищевых продуктов и биоматериалов, экстракции ДНК, способов подтверждения жизнеспособности возбудителя, а также стандартизации всей процедуры по отношению к действующим методам бактериологического анализа невозможно.
Перечисленный круг нерешенных вопросов определил актуальность и составил цель и задачи настоящей работы.
Целью настоящей работы являлось усовершенствование подходов к анализу загрязнённости пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter и к лабораторной диагностике кампилобактериоза у больных кишечными инфекциями. Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Адаптировать метод ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией для определения термофильных кампилобактерий в пищевых продуктах и биоматериале от больных кампилобактериозом.
-
Изучить загрязнённость кампилобактериями различных пищевых продуктов методом ПЦР-РВ.
-
При использовании метода ПЦР-РВ оценить влияние на показатели загрязнённости птицепродуктов кампилобактериями различных технологических факторов.
-
Провести лабораторную диагностику с использованием метода ПЦР-РВ наличия возбудителей кампилобактериоза в биоматериале от больных острым кам-пилобактериозом и от лиц с синдромом раздражённого кишечника.
-
Изучить генетические детерминанты факторов патогенности у штаммов кам-пилобактерий, выделенных из пищевых продуктов и от больных кампилобак-териозом.
-
Оптимизация процедур пробоподготовки и обогащения материала позволит использовать метод ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с тест-системами, предназначенными для анализа изолированных штаммов Campylobacter spp., для прямого определения возбудителя в пищевых продуктах и биоматериале без потерь чувствительности, специфичности и скорости выполнения.
-
Методика парных проб исследуемых образцов (подвергнутого и неподвергнутого обогащению) обеспечивает подтверждение жизнеспособности искомых Campylobacter spp. в режиме реального времени без выделения чистой культуры из пищевого продукта и биоматериала.
-
ПЦР-анализ в формате реального времени улучшает эффективность контроля контаминации птицепродуктов трудно культивируемым возбудителем кампилобактериоза по сравнению с бактериологическим посевом.
-
Использование ПЦР в реальном времени и предложенного алгоритма отбора и подготовки биоматериала повышает раскрываемость острого кампилобактериоза при острых кишечных инфекциях.
-
Метод ПЦР в режиме реального времени увеличивает возможности дифференциальной лабораторной диагностики хронического кампилобактериоза у больных СРК и глубокими нарушениями кишечной микрофлоры.
-
Сопоставление генетических детерминант патогенности у Campylobacter spp., выделенных от больных ОКИ и из пищевых продуктов, может рассматриваться как подход для оценки потенциальной патогенности штаммов, контаминирующих пищу.
Впервые в России проведена адаптация метода ПЦР в реальном времени с гиб-ридизационно-флуоресцентной детекцией для целей выявления возбудителя кампи-
лобактериоза в пищевых продуктах и в фекалиях от больных и его стандартизация относительно утверждённого метода бакпосева. Установлен предел обнаружения на уровне 1 КОЕ/25г.
В экспериментах с чистыми культурами и искусственно контаминированными образцами птицепродуктов оценена чувствительность и специфичность экспресс-методов определения бактерий рода Campylobacter основанных на технологии ПЦР и ИФА. Показана большая чувствительность метода ПЦР в реальном времени с использованием тест-систем «Амшшсекс-Campylobacter spp.» в сравнении с другими методами.
Экспериментально обоснован новый подход для подтверждения жизнеспособности обнаруженных в ПЦР кампилобактерий с использованием формата ПЦР-РВ с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в процессе амплификации, основанный на различиях в достижении порога детекции ДНК-мишени в парных пробах, подвергнутых и не подвернутых обогащению, и не требующий изоляции чистой культуры.
Впервые изучено влияние технологических факторов на выживаемость кампилобактерий в контаминированных птицепродуктах. Установлено, что замораживание не обеспечивает деконтаминацию мяса птицы от возбудителя кампилобактериоза, а использование погружного способа охлаждения тушек кур способствует повышению частоты обнаружения кампилобактерий в среднем 2,7 раза по сравнению с другими способами.
Предложенный алгоритм пробоподготовки и анализа путём ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с использованием тест-системы «Амплжекс-Campylobacter spp.» позволил повысить результативность лабораторной диагностики острого кампилобактериоза у больных с ОКИ в 2,5 раза по сравнению с бакпосевом.
Впервые в России обнаружено наличие Campylobacter spp. у больных синдромом раздраженного кишечника с диареей, установлено носительство возбудителя кампилобактериоза у лиц, не имеющих манифестаций острой кишечной инфекции. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Разработаны алгоритмы и методики прямого определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах и биоматериале от больных, на основе метода ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, с использованием отечественных тест-систем и доступных в практике приборов, позволившие повысить точность и результативность обнаружения возбудителей кампилобактериоза в указанных объектах. Утверждены методические рекомендации MP № 02.036-08 «Идентификация патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением
системы ВАХ System Q7», Методические указания МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридиза-ционно - флуоресцентной детекцией», Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2816 - 2010 «Профилактика кампилобактериоза среди людей», Методические указания МУК 4.2.2878-11 «Дополнения и изменения №1 к Методическим указаниям МУК 4.2.2321-08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах».
Результаты исследования позволяют усовершенствовать анализ пищевых продуктов и биоматериала на наличие возбудителя кампилобактериоза и проводить адекватную оценку загрязнённости кампилобактериями пищевых продуктов, экспресс-диагностику кампилобактериоза у людей и мониторинг последствий перенесённого кампилобактериоза.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7-й всероссийской конференции «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010 г), Ежегодной конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ питания» РАМН» (Москва, 2009 г.), XII и XIII Всероссийских конгрессах диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2010 г.) и «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 в ведущих рецензируемых журналах, определенных высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ, 4 методических указания, санитарные правила и нормы.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора метода исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, включает 20 таблиц и 8 рисунков и диаграмм. Список литературы содержит 38 отечественных и 239 зарубежных источников.
Личный вклад диссертанта.
Основная часть исследований выполнена лично автором.
Теоретические и экспериментальные исследования выполнялись автором в ФГБУ «НИИ питания» РАМН в рамках программ и планов НИР №№ 095, 115. При выполнении разделов по адаптации метода ПЦР-РВ для прямого определения Сат-
pylobacter spp. в пищевых продуктах, идентификации генов патогенности у штаммов, изолированных из пищевых продуктов и из фекалий больных ОКИ, изучению влияния технологий охлаждения птицы на контаминацию Campylobacter spp. автор пользовался консультациями к.б.н. А.Т. Подколзина (ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора РФ), д.б.н., проф. С.А.Ермолаевой (ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея Минздравсоцразвития России), к.в.н. Козака С.С. (ГНУ ВНИИПП РАСХН). Первичную подготовку биоматериалов от больных, а также анализ данных анамнеза автор проводил совместно с Бурляевой Е.А. (Клиника лечебного питания ФГБУ «НИИ питания» РАМН), к.м.н. Литвиновой О.С, д.м.н., проф. Лучшевым В.И. (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздравсоцразвития России).
