Изучение частоты и уровня контаминации продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки некоторыми фузариотоксинами Седова Ирина Борисовна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Седова Ирина Борисовна. Изучение частоты и уровня контаминации продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки некоторыми фузариотоксинами : Дис. ... канд. биол. наук : 14.00.07 Москва, 2005 164 с. РГБ ОД, 61:05-3/1086

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 10

2.1. Микотоксины, продуцируемые микроскопическими грибами рода Fusarium

2.1.1. Дезоксиниваленол 13

2.1.2. Зеараленон 17

2.1.3. Фумонизины 21

2.1.3.1. Строение и физико-химические свойства

21 фумонизинов

2Л .3.2. Продуценты и распространенность фумонизинов 23

2.1.3.3. Биологическое действие фумонизинов 29

2.1.3.4. Методы определения фумонизинов 32

3. Экспериментальная часть 35

3.1. Обоснование цели и выбора методов исследования 35

3.2. Материалы и методы исследования 37

3.2.1. Отбор проб зерна 37

3.2.2. Микологические методы исследования 37

3.2.3. Метод определения дезоксиниваленол а и зеараленона 38

3.2.4. Иммуноферментный метод определения фумонизинов 40

3.2.5. Приготовление и хранение стандартных растворов микотоксинов

3.2.6. Материалы, используемые в работе 45

3.2.7. Статистическая обработка результатов 45

4.3. Результаты собственных исследований 47

4.3.1. Изучение распространенности и токсигенной активности штаммов грибов Fusarium moniliforme.

4.3.1.1. Изучение растространенности грибов Fusarium moniliforme в отечественном зерне кукурузы

4.3.1.2. Исследование токсигенной активности штаммов Fusarium moniliforme

4.3.2. Изучение контаминации зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами методом иммуноферментпого 61 анализа

4.3.3. Разработка метода количественного определения фумонизинов В] и В2 в кукурузе и продуктах ее переработки с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.3.3.1. Выбор состава экстракционной смеси для экстракции фумонизинов BL и Вг из образца

4.3.3.2. Выбор сорбента для твердо-фазной очистки экстракта

4.3.3.3. Оптимизация условий реакции дериватизации фумонизинов

4.3.3.4. Выбор типа подвижной фазы для определения фумонизинов методом высокоэффективной 66 жидкостной хроматографии

4.3.3.5. Методика обнаружения, идентификации и определения содержания фумонизинов В[ и В2 в зерне кукурузы и продуктах ее переработки

4.3.4. Сравнительная характеристика методов определения фумонизинов: иммуноферментного и высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.3.5. Изучение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии частоты и уровня контаминации фумонизинами зерна кукурузы и продуктов ее переработки.

4.3.5.1. Изучение частоты и уровня контаминации фумонизинами зерна кукурузы

4.3.5.2. Изучение частоты и уровня контаминации фумонизинами основных продуктов переработки 90 кукурузы

4.3.5.3. Изучение частоты и уровня контаминации фумонизинами продуктов детского питания

4.3.6. Изучение частоты и уровня контаминации дезоксиниваленолом зерна кукурузы и продуктов ее переработки

4.3.7. Изучение частоты и уровня контаминации зеараленоном зерна кукурузы и продуктов ее переработки

4.3.8. Расчет суточной нагрузки фумонизинами В і и В2 на население России

4.3.8.1. Расчет суточной нагрузки OBj и ФВ2 на население России в среднем

4.3.8.2. Расчет суточной нагрузки фумонизинами Bt и В2 на группу населения, регулярно потребляющую продукты переработки кукурузы 113

4.3.8.3. Расчет нагрузки фумонизинами Bt и В2 на детей 116

5. Заключение 119

6. Выводы 125

7. Приложение

8. Список цитированной литературы

Дезоксиниваленол
Биологическое действие фумонизинов
Иммуноферментный метод определения фумонизинов
Выбор состава экстракционной смеси для экстракции фумонизинов BL и Вг из образца

Введение к работе

Проблема биобезопасности на современном этапе непосредственно связана с предотвращением попадания в пищевую цепь природных контаминантов биологического происхождения, воздействующих на здоровье человека. Среди наиболее опасных природных загрязнителей пищевых продуктов особое место занимают микотоксины, которые являются продуктами жизнедеятельности повсеместно распространенных микроскопических плесневых грибов, способных поражать пищевые продукты на всех этапах производства, обработки и хранения.

Микотоксины - это высокотоксичные, высокостабильные соединения, некоторые из которых являются сильными канцерогенами (афлатоксины, охратоксин), большинство из них - иммунодепрессанты. По данным ФАО, более 25% всего производимого в мире зерна контаминировано микотоксинами [Mannon J., Jonson Е., 1985]. Невозможность полного предотвращения образования токсинов в растительном сырье и попадания их в организм приводит к необходимости организации контроля за уровнем их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах, а в ряде случаев, - введения гигиенических регламентов.

Проведенные исследования показали, что наиболее часто обнаруживаемыми микотоксинами являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium, среди которых наибольшим распространением отличаются дезоксиниваленол (ДОН, вомитоксин) и зеараленон (ЗЛ) [Билай В.И., 1977; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; Bhat R. 1999; Miller J.D., 1995; Schuh М., 2001]. В отличие от других микотоксинов, фузариотоксины накапливаются в зерне колосовых культур, пораженных фузариозом колоса в период созревания, и интенсивность их синтеза зависит в значительной степени от климатических и погодных условий. Основным возбудителем фузариоза колоса и продуцентом ДОН и ЗЛ является Fusarium graminearum Sclrwabc [Scott P.M. 1990; Львова Л.С. и др., 1992, 1993, 1994; Parry D.W., et al., 1995]. Исследования, проводимые в ГУ НИИ питания РАМН в течение 16 лет,

7 показали высокую частоту обнаружения микотоксина ДОН, главным образом в зерне пшеницы из Северо-Кавказского региона, причем в отдельные годы частота выявления ДОН в пшенице в ареалах фузариоза варьировала от 60 до 100% обследованных партии. Помимо ДОН, в фузариозной пшенице обнаруживался также ЗЛ [Соболев B.C., и др., 1990; Львова Л.С. и др., 1992, 1994; Захарова Л.П. и др., 1994, Кравченко Л.В. и др., 1998; Tutelyan V.A. et al, 1990;Tutelyan V.A., 1998, 2004].

Количество идентифицированных фузариотоксинов постоянно увеличивается. В последнее время особое внимание уделяется фумонизинам. Фумонизины - новый класс микотоксинов, образуемых грибами рода Fusarium. Наиболее часто в природных условиях встречается фумонизин В і (ФВі), значительно реже и в меньших количествах - фумонизины В; (ФВ2) и Вз (ФВз). Основными продуцентами этих токсинов являются F. moniliforme Sheldon (син. F. verticillioides (Sacc. Nirenberg) [Nelson P.E., et al., 1993, Marasas W.F.O., 1994]. Установлена высокая частота обнаружения фумонизинов в зерне кукурузы и продуктах ее переработки в США, Австралии, в ряде стран Европы [Miller J.D., et al., 1993, Nelson P.E., et al., 1993, Norred W.P., et al, 1999, Thiel P.G., et al., 1993, Turner P.C., et al., 1999].

Фумонизины обладают выраженными токсическими свойствами. В экспериментах показано, что фумонизины поражают печень и почки, легкие, поджелудочную железу и центральную нервную систему у разных видов животных. Доказано, что они также обладают канцерогенным действием на крыс и мышей. Кроме того, эти токсины являются причиной лейкоэнцефаломаляции у лошадей и отека легких у свиней [Marasas W.F.O., et al., 1984, 1992]. Международное агентство по изучению рака относит фумонизины к соединениям, вероятно канцерогенным для человека (группа 2В) [IARC, 1993,2002].

Учитывая выраженное токсическое действие фумонизинов и отсутствие каких-либо сведений о возможности загрязнения этими токсинами продуктов переработки зерна в Российской Федерации, основной целью этой работы было

8 изучить возможность загрязнения продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами, а также возможность одновременного загрязнения этих продуктов другими фузариотоксинами.

В связи с вышеизложенным, в настоящей работе были определены следующие задачи:

Изучить пораженность зерна кукурузы и продуктов его переработки F. moniliforme и токсигенный потенциал штаммов, выделенных с отечественного и импортного зерна;

Исследовать частоту загрязнения фумонизинами продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки с помощью адаптированного скринингового иммуноферментного метода;
Разработать на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии метод количественного определения содержания ФВ\ и ФВ₂ в зерне кукурузы и продуктах ее переработки.
Установить частоту и уровни загрязнения продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки другими фузариотоксинами - ДОН и ЗЛ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые в России проведен скрининг продовольственного зерна кукурузы на содержание микотоксинов фумонизинов и обнаружена высокая частота загрязнения этими микотоксинами кукурузы продовольственного назначения.

Впервые на основе системного анализа исследована распространенность инфекции Fusarium moniliforme в отечественном зерне кукурузы и установлена высокая токсинообразующая способность этого вида.

Впервые в России проведен количественный анализ содержания микотоксинов ФВі и ФВ₂ в продовольственном зерне кукурузы и основных продуктах ее переработки, результаты которого свидетельствуют о высокой частоте и широкой вариабельности уровней загрязнения объектов этими фумонизинами.

9 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Разработан новый высокочувствительный, селективный, количественный метод определения ФВ] и ФВ₂, позволяющий проводить серийные анализы. На основании результатов работы разработаны «Методические указания по определению фумонизинов Bi и В₂ в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (МУК 4.1.1962-05, М.: Роспотребнадзор, 2005).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы доложены на: Третьем Симпозиуме «100-летие хроматографии» (Москва, 2003), Первом (Москва, 2003), Втором (Москва, 2004) и Третьем (Москва, 2005) Всероссийских Конгрессах по медицинской микологии.

ПУБЛИКАЦИИ По результатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 18 публикаций в сборниках научных трудов, разработаны 1 Методические указания (Роспотребнадзора России, МУК 4.1.1962-05).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 302 источника, из которых - 279 иностранных авторов.

10 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. МИКОТОКСИНЫ, ПРОДУЦИРУЕМЫЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ

ГРИБАМИ РОДА Fusarium

Микроскопические грибы рода Fusarium широко распространены в природе и отличаются выраженной способностью приспосабливаться к изменяющимся условиям существования, что обусловливает возможность перехода их от сапрофитной стадии роста к паразитированию на тканях высших растений, ослабленных вследствие воздействия каких-либо из неблагоприятных факторов окружающей среды [Билай В.И., 1977]. Грибы рода Fusarium являются основными возбудителями так называемых гнилей корней, стеблей, листьев, семян, плодов, клубней и сеянцев растений, объединенных под общим названием фузариозы. Они вызывают также задержку роста, бесплодие и некоторые виды пигментации у различных растений.

В качестве возбудителей фузариоза колоса и початков зерновых культур наиболее часто проявляются такие виды грибов рода Fusarium, как F. graminearum, F. moniiiforme, F. culmorum, F. nivale, F. avenaceum и некоторые другие [Smith J.E., et al., 1994; Parry D.W., et al., 1995]. Видовой состав возбудителей фузариоза зерновых варьирует в зависимости от культуры и связан с климатическими особенностями зон возделывания. Так, возбудителями фузариоза початков кукурузы чаще всего являются F. graminearum и F. moniiiforme [Snijders С.Н.А., 1992; Miller J.D., 1995; Bottalico A., Perrone G., 2002; Logrieco A., et al., 2002; Munkvold G.P., 2003]. Возбудители фузариоза колосовых культур обычно представлены такими видами, как F. graminearum, F. culmorum, F, nivale, F. avenaceum [Chelkowski J., et al., 1988; Snijders C.H.A., Pcrcowski J., 1990; Miller J.D., ct al., 2001]. F. graminearum преобладает в странах с теплым и мягким климатом, тогда как F. culmorum и F. avenaceum - в регионах с более засушливым или прохладным климатом, Необходимым условием для развития патогенных штаммов F. graminearum на зерновых является повышенное количество осадков в период вегетационного цикла

растений при относительно прохладной погоде (оптимальная среднесуточная температура 15-20С) [Sutton J.C., 1982]. Однако причинами распространения фузариоза в южных районах европейской части страны могут быть не только погодные условия, но и нерациональное применение приемов интенсивной технологии возделывания сельскохозяйственных культур, перенасыщение севооборотов зерновыми, в особенности - пшеницей и кукурузой. Широкое использование минеральных удобрений и пестицидов, связанное с интенсификацией сельского хозяйства, также стимулировало распространение фузариоза колоса. Установлено, что применение гербицидов и стимуляторов роста способствуют прогрессирующему развитию заболеваний [Miller J.D., ct al., 1994; Edwards S.G., 2004].

Фузариозы колоса и початка приводят к снижению урожая и ухудшают качество зерна. Наряду с этим грибы-возбудители фузариоза образуют в пораженном зерне высокотоксичные и канцерогенные продукты разной химической природы, объединенные под общим названием фузариотоксины. Каждый из видов фузариев способен синтезировать определенный набор мнкотоксинов. Наиболее часто в злаковых накапливаются микотоксины грибов рода Fusarium, такие как фумонизины (главным образом, В! и В₂), ЗЛ и трихоте ценовые микотоксины (ДОН, ниваленол и Т-2 токсин). Основными микотоксинами, обнаруживаемыми в отечественном зерне, пораженном фузариозом, являются ДОН и ЗЛ [Захарова Л.П. и др., 1994, 2003; Кравченко Л.В. и др., 1998; Tutelyan V.A., 1998, 2004].

Высокие уровни содержания фузариотоксинов, обнаруживаемые в некоторые годы в партиях фузариозного зерна, могут являться причиной массовых отравлений и заболеваний населения. Опасность фузариотоксикозов человека неоднократно подтверждалась на практике и зачастую приводила к самым тяжелым последствиям вплоть до массовой гибели людей, вызванных потреблением продуктов, пораженных микроскопическими грибами рода Fusarium_y что обусловлено высокой токсичностью продуцируемых ими метаболитов [Bcardall J., Miller J.D., 1994].

Впервые на Дальнем Востоке в 1882 г было установлено и описано заболевание человека и животных от употребления зерновых продуктов пораженных F. graminearum - «пьяный хлеб», «опьяняющая рожь», «ядовитый ячмень» [Саркисов А.Х., 1954; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Имеются сообщения о случаях заболеваний в отдельные годы в Швейцарии, Финляндии, Швеции и Франции от завезенных из Америки значительных партий зерна, пораженных микроскопическими грибами [Matossian М.К., 1989]. У людей потребление в пищу продуктов, изготовленных из этого зерна, проявлялось в виде отравления: резкие головные боли, рвота, боли в области живота, диарея, слабость и тяжесть в конечностях. Это зерно было также болезнетворно для лошадей, свиней, собак, реже для крупного рогатого скота [Sarkisov А.К., 1984].

С 1980 г. в Японии периодически были отмечены вспышки акабаби-токсикоза, вызванные «красной плесенью», у людей и сельскохозяйственных животных. Причиной этого заболевания является потребление зерна и зернопродуктов, пораженных грибами F. nivale и F. graminearum, и, содержащих трихотеценовые микотоксины - ДОН и ниваленол [Ueno Y., 1977; YoshizawaT., 1983].

В отдельные годы (1932, 1944-1945г.г.) на территории СССР было отмечено заболевание - алиментарно-токсическая алейкия (ATА), связанное с употреблением в пищу продуктов, приготовленных из перезимовавшего под снегом зерна [Рубенштейн Ю.И., Лясс Л.С, 1948], пораженного микроскопическими грибами F. sporotrichiella, продуцирующими Т-2 и НТ-2 токсины [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Перезимовавшее в поле зерно вызывало токсикозы и у сельскохозяйственных животных, что проявлялось в виде острого поражения желудочно-кишечного тракты, дистрофии паренхиматозных органов, геморрагии и вызывало лейкопению [Саркисов А.Х., 1954].

С 1928 года во многих странах мира периодически наблюдался эстрогенизм свиней, который был связан с потреблением зерна загрязненного F. graminearum и микотоксином ЗЛ [Kuiper-Goodman Т., et al., 1987].

13 Таким образом, микроскопические грибы рода Fusarium, чрезвычайно широко распространенные в природе и обладающие выраженным токсическим действием и поражающие пищевые продукты и корма, могут явиться этиологическим фактором в развитии ряда алиментарных микотоксикозов человека и сельскохозяйственных животных. Экономические потери, наносимые сельскому хозяйству микотоксинами, определяются не только прямыми потерями продовольственного сырья, продуктов питания и кормов, но и гибелью, резким снижением привесов и воспроизводимости сельскохозяйственных животных, возрастанию их чувствительности к инфекционным заболеваниям.

2.1.1. Дезоксиниваленол

ДОН - трихотеценовый токсин (ТТМТ), относящийся к трихотеценам группы В. По своей химической структуре ТТМТ относятся к сесквитерпенам. Они содержат основное ядро из трех циклов, называемых трихотеканом, в составе которого эпоксидное кольцо при С-12, 13 и двойная связь при С-9, 10, поэтому эти соединения получили название трихотец-9-ены. К группе В относятся соединения, имеющие в положении C-S карбонильную группу [Banburg J., 1976]. Основными продуцентами ДОН являются штаммы F. nivale, F. graminearum и F. culmorum [Miller J.D., et al., 2001; Ueno Y., et al., 1973]. Этот токсин растворим в воде и является химически стабильным.

Острое токсическое действие ДОН у животных характеризуется уменьшением потребления пищи, диареей и рвотой. Наблюдаются нарушения центральной нервной системы, поражение кровеносной, кроветворной и иммунной систем. ДОН отличается выраженным тератогенным действием. LD₅₀ ДОН для мышей составляет 70 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном способе введения токсина, 45 мг/кг массы тела при подкожном введении и 46 мг/кг массы тела при введении ДОН внутрь [Forsell J.H., et al., 1987; Thompson W.L., Wanermacher R.W., 1986]. Для цыплят-бройлеров при введении внутрь LD₅o составляет 140 мг/кг массы тела [Huff W.E., et al., 1981], для уток при

14 подкожном введении токсина - 27 мг/кг массы тела. Особенно чувствительны к воздействию ДОН свиньи [Тутельян В .А., Кравченко Л.В., 1985].

Комитет экспертов ФАО/В03 по пищевым добавкам (JECFA) отмечает, что потребление загрязненного ДОН продовольственного сырья может привести к вспышкам острых заболеваний у людей [WHO, 2001].

Вспышки острых заболеваний у людей наблюдались в странах Азии (Индия, Китай и Япония) в период с 1961 по 1987 г.г. и были связаны с употреблением в пищу фузариозного зерна пшеницы и кукурузы, контаминированного ДОН, максимальные уровни загрязнения достигали 93 мг/кг [IARC 1993; Kuper-Goodman Т., 1994; WHO, 2001].

Возбудители фузариоза могут поражать зерно еще в период цветения и молочной спелости. Гриб-патоген развивается вместе с зерном и пронизывает все его части: эндосперм, зародыш, оболочки [Bechtel D.B., et al., 1985]. Оптимальными для накопления ДОН в фузариозной пшенице являются влажность зерна 25-30% и температура 17-20С [Львова Л.С. и др., 1992].

По оценке JECFA, ДОН обнаруживали, как контаминант зерновых культур в Аргентине, Бразилии, Канаде, Китае, Финляндии, Италии, Нидерландах, Норвегии, Швеции, США, Уругвае и Великобритании [WHO, 2001]. Наиболее часто он загрязнял такие зерновые культуры, как пшеницу (57% из 11444 проб), кукурузу (41% из 5349), овес (68% из 834), ячмень (59% из 1662), рожь (49% из 295) и рис (27% из 154). Средние концентрации ДОН в контаминированном зерне варьировали от 4-9000 мкг/кг в ячмене, 3-3700 мкг/кг в кукурузе, 4-760 мкг/кг в овсе, 6-5100 мкг/кг в рисе, 13-240 мкг/кг во ржи и 1-5700 мкг/кг в пшенице [WHO, 2001]. Этот токсин обнаруживали в гречихе, сорго, сое, тритикале и продуктах переработки зерна, таких как пшеничная мука, хлеб, сухие завтраки, продукты детского питания, а также солод и пиво [Jacobsen В., 1995; Molto G., et al., 2000; Niessen L., ct al., 1993; Scott P.M., ct al., 1993].

Следует отметить, что в России пшеница является основной зерновой культурой, реже потребляется ячмень и рожь. В южных регионах возделывания

зерновых культур в отдельные годы имел широкое распространение фузариоз зерна и колоса. Наиболее часто наряду с фузариозом пшеницы отмечался фузариоз ячменя. Вспышки фузариоза наблюдались, в 1985 году, 1988-1989, 1992-1993 годах с необычно влажными условиями в период созревания [Захарова Л.П. и др., 1994; Соболев B.C. и др., 1990]. Основные ареалы фузариоза охватывали южные районы России, Краснодарский и Ставропольский края. Однако отмечена тенденция к расширению фузариоза и в других регионах производства сильных и ценных сортов пшеницы: в Центрально-Черноземном районе, Московской области, Молдове и Украине, что приводило к значительным потерям ресурсов наиболее высококачественного зерна [Tutelyan V.A., et al., 1990; Tutelyan V.A., 1998, 2004].

Данных о загрязнении ДОН продовольственного зерна кукурузы значительно меньше. Имелись сведения об обнаружении ДОН в зерне кукурузы в Австрии и Нидерландах. ДОН присутствовал в 66-100% проб из этих стран при среднем содержании 0,091-0,662 мг/кг, максимальное содержание ДОН достигало 2,57 мг/кг [Ellend N., et al., 1997; Spanjer M.C., 2000]. В кукурузе из Канады уровень максимального загрязнения составил 4,09 мг/кг, а среднее содержание варьировало от 0,17 до 1,086 мг/кг [Scott P.M., 1997а]. Описаны случаи обнаружения ДОН в кукурузе, максимальное загрязнение составило 3 мг/кг, а среднее содержание 1,575 мг/кг. ДОН был обнаружен и в кукурузе в Африке, среднее содержание ДОН в пробах варьировало от 0,082 до 0,169 мг/кг, а максимальный уровень загрязнения составил 2,75 мг/кг [Rava Е., et al., 1996]. В Аргентине - от 0 до 33% зерна кукурузы содержали ДОН в среднем в количестве от 0,0046 до 0,129 мг/кг, максимальный уровень достигал - 2,7 мг/кг [Broggy L.E., et al., 2000; Solovey M.M.S., et al., 1999]. Также высокая частота обнаружения и высокие уровни загрязнения ДОН зерна кукурузы были отмечены в Китае и Новой Зеландии [Kim J., et al., 1993; Lauren D.R., 1991; Lee Y., et al., 1995; Wang -S., et al., 1993]. Так, например, в Новой Зеландии в

отдельные годы среднее содержание ДОН в кукурузе варьировало от 0,286 до 0,92 мг/кг, а максимальные уровни загрязнения - от 0,71 до 8,5 мг/кг.

В России данных о загрязнении ДОН продовольственного зерна кукурузы мало. ДОН был обнаружен в 5% исследованных партий зерна кукурузы, максимальный уровень загрязнения ДОН составил 2,4 мг/кг [Львова Л.С. и др., 1993].

Распространенность фузариотоксинов в зерне в разных географических районах, бесспорное доказательство их реальной опасности для здоровья человека, явилось причиной введения регламентов на их содержание в продовольственном сырье в ряде стран: в США в готовых продуктах из пшеницы - 1 мг/кг, в Канаде в неочищенной мягкой пшенице - 2 мг/кг, в Австралии в пшенице и ржи - 0,5 мг/кг и в твердой пшенице - 0,75 мг/кг [FAO, 1997], в Нидерландах - 0,120 и 0,060 мг/кг в пшенице и хлебе, соответственно [Pieters N.N., et al., 1999]. В России было введено ограничение содержания ДОН в пшенице на уровне 0,7 мг/кг и для ячменя - 1 мг/кг [СанПиН 2.3.2.1078-01]. Ни в одной из стран, в том числе и в России, нет регламентов на содержание ДОН в кукурузе и продуктах ее переработки.

JECFA установил величину переносимого суточного поступления (ПСП) ДОН для человека на уровне 1 мкг/кг массы тела при коэффициенте безопасности- 100 [WHO, 2001].

Для определения ДОН разработан ряд иммунохимических, биологических [Chu F.S., 1995; Langseth W., Elen О., et al., 1997, Langseth W., Rotter B.A., et al., 1993; Rundberget Т., 1999; Widestrand J., 2001] и химических методов[Іе8Ші M., et al., 2004, Krska R., et al., 2001]. Иммунохимические методы [Pestka J.J., et al., 1995] и иммуноферментныи метод (ИФА или ELIZA) [Usleber Е., et al.; 1996; Yoshizawa Т., et al., 2004], а также биологические методы используют для скринингового анализа [Chu F.S., 1995; Widestrand J., 2001].

Большинство методов количественного определения основано на применении различных видов хроматографии - тонкослойной (ТСХ) [Eppley R.M., et al., 1986; Scott P.M., et al., 1970; Ueno Y., et al., 1973],

17 высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) и газовой (ГХ) [Wilson D.M., et al._s1998]. Жидкостную хроматографию с масс спектрометрией (ВЭЖХ-МС) и ВЭЖХ-МС/МС [Berger U., et al., 1999; Krska R., et al., 2001; Lagana A., et al., 2003; Mirocha C.J., 1998; Plattner R.D., Maragos СМ., 2003;] также используют для идентификации и количественного определения ДОН, однако эти методы требует дорогостоящего инструментального сопровождения. Для анализа ДОН используют метод обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ с электрохимическим детектированием или спектро фотометрическим детектированием с применением послеколоночной дериватизации [Malone B.R., et al., 1998], но наибольшее распространение получили ОФ ВЭЖХ методики с применением УФ детектирования [Trucksess M.W., et al., 1996; Visconty A., Bottalico A., 1983]. При анализе ДОН возможно применение УФ-детектора, так как этот токсин содержит в составе молекул хромофорные группы, которые поглощают в УФ-области спектра с максимумом поглощения при 225 нм [Pohland et al., 1984].

2.1.2. Зеараленон

Возбудители фузариоза зерна - микроскопические грибы F. graminearum наряду с ДОН способны синтезировать другой микотоксин - ЗЛ [Nesh G.A., et al., 1983]. История открытия этого токсина начинается с 1927 года, когда впервые в ряде стран Европы, а также в США, Канаде, Японии и Австралии были зарегистрированы вспышки заболевания неизвестной этиологии у свиней. Основными симптомами этого заболевания являлись вульвовагиниты. При этом отмечалась связь заболевания с употреблением в качестве корма кукурузы, пораженной плесневыми грибами, в частности F. graminearum. Но впервые этот токсин был выделен и идентифицирован в 1962 году из культуры F. roseum «graminearum'» (Gibberella zeae), выделенной из заплесневелой кукурузы. Позднее ЗЛ был обнаружен в кукурузе, пораженной F. graminearum и явившейся причиной заболевания у свиней [Mycotoxins in Asia, 1995].

3Л, известный также как F-2, по своей структуре является лактоном резорциловой кислоты. Основными продуцентами ЗЛ считаются F.graminearum

IS и F.culmorum. Способность к синтезу ЗЛ была установлена в лабораторных условиях также у F.nivale, F. equisetum и F. semitectum и у других видов [Miller J.D., 1991]. Грибы-продуценты способны синтезировать ЗЛ в кукурузе, как в поле при развитии растения, так и при хранении початков, а в некоторых случаях и в свежеубранном зерне кукурузы [Львова Л.С.и др., 1992]. В природных условиях ЗЛ встречается главным образом в зерновых: пшенице, кукурузе, ячмене, овсе, сорго и ряде других культур [Kuiper-Goodman Т., et al., 1987].

Оптимальная температура для накопления ЗЛ находится в диапазоне 15-20С и не зависит от региона и среды. Это подтверждается сведениями об обнаружении ЗЛ в зерне кукурузы, продуктах ее переработки, рисе в странах различных географических зон: Египте, Дании, Франции, Китае, Тайване и США [Jelinek C.F., et al., 1989].

ЗЛ не обладает острым токсическим действием на животных, однако, обладает сильно выраженными эстрогенными (гормоноподобньши) свойствами. Наиболее чувствительны к эстрагенному действию ЗЛ свиньи, а также крупный рогатый скот, овцы, цыплята, индейки, крысы, мыши, морские свинки и обезьяны [Kuiper-Goodman Т., et al., 1987; Mirocba С.J., et al., 1980]. Было показано, что 3Л вызывает вульвовагиниты, гиперплазию матки, атрофию яичников [NTP, 1982].

Установлено тератогенное действие этого токсина на беременных крысах, мышах, свиньях, обезьянах [Chang C.-F., et al., 1979].

ЗЛ влияет на репродуктивную функцию и вызывает бесплодие у крупного рогатого скота [Pestka J.J., Bondy G.S., 1994; Prelusky .В., et al., 1994]. ЗЛ рассматривают как возможный агент, который вызывает преждевременное половое созревание у детей в Пуэрто-Рико [Saenz de Rodrigues С.А., 1984].

Загрязнение зерна кукурузы ЗЛ выявлено в большинстве стран мира: Европе, Азии, Африке, Новой Зеландии [WHO, 2000]. В Европе обнаруживали загрязнение кукурузы в Венгрии, Германии, Нидерландах, Чехословакии, Франции, Югославии и Италии [Bartos J., Matyas Z., 1981; Fazekas В., ct al. ,

19 1996; Petkova-Bocharova Т., et al., 1991; Ranfft K., et al., 1990; Tanaka Т., et al., 1990; Visconty A., Pascale M,, 1998]. В Югославии 3% проб кукурузы были загрязнены ЗЛ, среднее содержание в контаминированных пробах составило 5,1 мг/кг, уровень загрязнения варьировал от 0,043 до 10 мг/кг [Balser Т., et al., 1977]. Высокая частота обнаружения ЗЛ показана для кукурузы в Германии и Италии, уровень загрязнения этих проб был невысок - 0,004 - 0,15 мг/кг, среднее содержание ЗЛ в пробах в Италии составило 0,046 мг/кг, в Германии -0,012 мг/кг [Fazekas В., et al., 1996; Visconty A., Pascale М., 1998]. Высокий уровень загрязнения ЗЛ обнаружен в кукурузе во Франции, среднее содержание токсина составило 2,35 мг/кг [Jemmali М,, 1973]. Ни в одной из 264 проб кукурузы из Болгарии не было выявлено загрязнение ЗЛ [Fazekas В., ct al., 1996]. Имеются сообщения о загрязнении этим токсином пшеницы из других Европейских государств, таких как Швеции, Норвегии, Финляндии, Швейцарии, Шотландии и Болгарии - в этих пробах были показаны относительно невысокие уровни загрязнения [WHO, 2000].

Частота обнаружения ЗЛ в зерне кукурузы в Канаде в отдельные годы варьировала от 11 до 69% , уровень контаминации сильно различался от менее 0,01 до 141 мг/кг, а среднее содержание - от 0,013 до 3,85 мг/кг [Funnell H.S., 1979; Scott P.M., et al., 1997; Williams B.S., 1985]. Имеются сведения о высоких уровнях загрязнения кукурузы в Новой Зеландии, 59% исследованных проб были контаминированы ЗЛ в количестве от 0,1 до 16 мг/кг [Hussein Н.М., et al., 1989]; в Египте, в 59% проб кукурузы содержали ЗЛ в концентрации от 9,8 до 38,4 мг/кг [El-Maghraby О.М., et al, 1995], и в Нигерии [Gbody Т.A., et al., 1986]. Кроме того, ЗЛ обнаруживали в таких продуктах переработки пшеницы и кукурузы, как мука и крупа, кукурузные хлопья, глютен, попкорн, пшеничные отруби, а также в продуктах детского питания [WHO, 2000].

В России в период с 1992 по 1995 и с 1999 по 2001 гг. наиболее высокий уровень загрязнения ЗЛ был отмечен в 1992 году и составил 0,53 мг/кг. Случаев выявления ЗЛ в зерне продовольственного назначения урожаев 1993-1995 гг. не было [Кравченко Л.В. и др., 1998]. С 1999 по 2001 г.г. частота обнаружения ЗЛ

20 в пшенице варьировала от 1% в зерне урожая 1999 г. до 6% - в 2001 г. Величина среднего содержания ЗЛ в пробах всего ряда составляла соответственно 0,0005 и 0,004 мг/кг [Захарова Л.П. и др., 2003].

JECFA установил величину ПСП ЗЛ для человека на уровне 0,5 мкг/кг массы тела (фактор безопасности - 100) [JECFA, 2000].

В некоторых странах были введены регламенты или предельно-допустимые концентрации (ПДК) ЗЛ в пищевых продуктах, главным образом, в зерне, в пределах от 0,03 до 1 мг/кг [Krska R., et al., 2004]. Так, ограничения на содержание ЗЛ были установлены в Австрии - 0,06 мг/кг для мягкой и твердой пшеницы, ржи, во Франции - 0,2 мг/кг для зерна, в Румынии - 0,03 мг/кг для всех видов пищевых продуктов, в Уругвае - 0,2 мг/кг для пшеницы и кукурузы, в Бразилии - 0,2 мг/кг для кукурузы. Консервированные продукты в Венгрии и зерновые в Нидерландах не должны были содержать ЗЛ. В трех странах (Кипр, Венгрия и Нидерланды) была установлена ПДК ЗЛ от 0 до 0,5 мг/кг в некоторых пищевых продуктах [Krska R., 1999].

В России ПДК ЗЛ для пшеницы, ячменя и кукурузы составлял 1 мг/кг, для муки и крупы допустимый уровень ЗЛ был установлен на уровне - 0,2 мг/кг [СанПиН 2.3.2.1078-01; Тутельян В.А. и др., 2002].

Существует большое количество методик количественных, полуколичественных и скрининговых методов определения ЗЛ в зерне и зернопродуктах. Для полуколичественного анализа ЗЛ используют ТСХ метод [Hadiani M.R., et al., 2003; Langseth W., et al., 2003]. Для определения ЗЛ разработали иммунохимические (Trucksess M.W., ct al., 1995; Usleber E., et al., 1996) и аналитические методы (ГХ и ВЭЖХ).

Большинство методов количественного определения ЗЛ основано на применении различных видов хроматографии: ВЭЖХ и ГХ [Wilson D.M., et al., 1998]. На стадии экстракции ЗЛ из зерновых чаще всего используют такие органические растворители (ацетонитрил, этилацетат, метанол, хлороформ и ацетон) с водой или подкисленными растворами [Schuhmacher R., et al., 1997]. На стадии очистки экстрактов могут быть использованы твердофазная

21 экстракция [Llorens A., et al., 2002; Scudamorc К.A., Patel S., 2000], MycoSep колонки [Silva C.M.G., Vargas E.A., 2001] и некоторые специфичные ИА-колонки [Schuhmacher R., et al., 1997; Scott P.M., Trucksess M.W., 1997]. Наиболее часто для количественного определения ЗЛ в зерновых применяют ВЭЖХ метод [Josephs R.D., et al., 2001; Schuhmacher R., et al., 1997, 1998; Sydenham E.W., Shephard G.S.,1996], в частности - ОФ определение с применением флуоресцентного детектирования. Кроме этого, может быть использовано электрохимическое и спектрофотометрическое детектирование, УФ - и диодная матрица [Llorens A., et al., 2002; Pallarony, 2003; Schuhmacher et al., 1997]. Метод газовой хроматографии, чаще с масс спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) и ВЭЖХ-МС/МС [Royer D., et al., 2004; Tanaka Т., et al., 2000] используют для идентификации и количественного определения ЗЛ, однако эти методы требуют применения дорогостоящего оборудования.

2,1.3. Фумонизины

2.1.3.1. Строение и физико-химические свойства

Фумонизины - это новый класс микотоксинов, впервые выделенные и идентифицированные из культуры Fusarium verticilUoides (Sacc.) Nirenberg (Fusarium moniliforme Sheldon) в 1988 году [Bezuidenhout S.C., et al., 1988; Marasas W.F.O., 2001]. В настоящее время охарактеризовано 28 фумонизинов [Rheeder J.P. et al., 2002], по особенностям строения их можно разделить на 4 основных группы, как А, В, С и Р. В природных условиях в зерне обнаруживают в основном ФВі, являющийся наиболее токсичным, реже ФВ₂ и ФВз [Norred W.P., et al., 1999; Rheeder J.P.et al., 2002; Shephard G.S., et al., 1996; Turner P.C., et al., 1999]. Различие между тремя токсинами группы В состоит только в наличии или отсутствии ОН-групп при атомах углерода С-5 и С-10 карбоксильной цепи молекулы фумонизина.

По химической структуре ФВі (Cj^gNOis, молекулярная масса 721,8) представляет собой диэфир пропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты и 23-амино-12S,16R-flHMeTRn-3S,5R,10R,14S,15R-neHTarHflpoKCH3fiKO3aim, в котором С-14 и

22 С-15 гидроксигруппы этерифицированы концевой карбоксильной группой пропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты. ФВ₂ (C34H59NOU, молекулярная масса 705) - это аналог ФВі, несодержащий гидроксильной группы в положении С-10, соответствующие стереометрические части в основе эйкозана имеют ту же самую конфигурацию (рис. 1).

О V— ОН

( он

О j² он

^~\^-\^>\^\^^N ^н2

СН₃ О СН₃

О:

1 R(=R₂=OH (FB|) Rl=H, R₂=OH (FB₂) R^OH, R₂=H (FB₃)

Рис. 1. Структура ФВ_І5 ФВ₂ и ФВ₃

Полные стереометрические формулы ФВз и ФВ₄ не известны, однако аминоконцевая группа ФВз имеет абсолютно ту же самую конфигурацию, что и ФВ_Ь

ФВ[ и ФВ₂ представляют собой белый гигроскопичный порошок, они растворимы в воде, не менее 20 мг/л [US NTP, 1999], в метаноле [Sydenham E.W., 1992], в смеси ацетонитрил-вода. Стабильны в смеси ацетонитрил-вода (1:1) при t от -18 до 25С в течение 6 месяцев. Фумонизины не стабильны в метаноле при 25С: через 3 недели концентрация токсинов в растворе уменьшается на 25%) растворе, через 6 недель - на 35% растворе [Gelderblom W.C.A., et al., 1992а; Visconty A. et аЦ 1994]. ФВі остается стабильным в метаноле в течение 6 недель при t=-18C_s а при t = 4, +25 и +40С

23 концентрация ФВі в метаноле уменьшается, соответственно, на 5, 35 и 60% [Visconti A., et al., 1994), и стабилен при 78С в течение 16 часов в буферных растворах при рН 3,5 и 9 [Howard Р.С. et al., 1998].

Два деривата ФВі и ФВ₂ (Аі и А₂) образуются в результате гидролиза исходных молекул [Blackwell В.А., et al, 1999]. N-ацетил-кето-дериваты ФВ! обнаружены в культурах F. proliferatum [Musser S.M., et al., 1995]. Также показано наличие трех 3-гидроксипиридин-содержащих фумонизинов, которые были отнесены к группе Р, и четырех фумонизинов группы С [Mackenzie S.E., et al., 1998; Musser S.M., ct al., 1996; Rumbeiha W.K., Oehmc F.W., 1997; Seo J.A., Lee Y.W., 1999].

Распространение фумонизинов группы С и уровень их содержания [в среднем от 500 до 1900 мкг/г сухого остатка] сравнимы с показателями для фумонизинов группы В [Seo J,A., Lee Y.W., 1999]. Фумонизины Cj, С₂ и гидрокси-Q более фитотоксичны, чем ФВ[, тогда как фумонизины Сз и С4 -менее токсины, чем ФВ! [Abbas Н.К., et al., 1998].

К группе Р относятся фумонизины Pj, Р₂ и Р₃, которые в С2-положении углерода карбоксильной цепи вместо аминогруппы содержат 3-гидроксипиридин. Содержание фумонизинов группы Р составляет одну треть содержания аминосодержащих аналогов фумонизинов группы В [Musser S.M., et al., 1996]. Фумонизин Pi токсичен и обладает действием, сходным с ФВі [Abbas Н.К., et al., 1998].

2.1.3.2. Продуценты и распространенность фумонизинов.

Фумонизины - класс микотоксинов, образуемых преимущественно микроскопическими грибами F. moniJiforme J. Sheldon (син. F. verticilUoides (Sacc.) Nirenberg), поражающими растение в поле и при хранении. Способность к синтезу фумонизинов обнаруживают некоторые штаммы видов F. proliferatum, F. anthophilum, F. dlamini, F. napiforme, F, nygama, F. thapsinwn, F. globosum, F. beomiforme, F. oxysporum, F. polyphialidicum, F, subglutinans и F, thapsinum^ распространеных на всех континентах и поражающих зерновые

24 культуры [Chelkowski J., Lew H., 1992; Gendcrblom W.C.A., et ah, 1988; Marasas W.F.O., et al, 1988; Marasas W.F.O., 2001; Nelson P.E., et al., 1992b, 1993]. Наиболее сильными продуцентами фумонизинов являются F. verticillioides штамм MRC 826 и F. proliferatum [Shephard G.A., et al, 1996], они накапливают наибольшее количество токсинов при культивировании в лабораторных условиях на стерильной кукурузе: до 17900 мг/кг ФВі первый [Alberts J.F., et al., 1990] и до 31000 мг/кг OBj - второй [Rheeder J.P., et al, 2002].

Фумонизины группы В продуцируются также растущими преимущественно на рисе микроскопическими грибами Alternaria alternata f. sp. lycopersici [Abbas H.K., Riley R.T., 1996]. При культивировании Л. alternata f, sp. lycopersici обнаружены, помимо ФВі, ФВ^ и ФВз, также один изомер ФВ! (Mb 564) и два изомера ФВ₂ (Мв 548).

Эти микотоксины накапливаются чаще всего в кукурузе во всех регионах ее возделывания, в том числе в странах с умеренным климатом. Несмотря на повсеместное распространение F, moniliforme, контаминация фумонизинами зависит от природных условий. Основная масса фумонизинов образуется фузариями в зерне на последних этапах его созревания и при хранении. На уровень загрязнения этими токсинами в поле влияют технология возделывания, устойчивость растений к F. moniliforme и другие факторы. Многочисленные наблюдения показывают, что сухая жаркая погода до или во время цветения злаковых повышает обычное содержание фумонизинов более чем в 2 раза. Синтезу фумонизинов способствует также повреждение растений насекомыми, что создает предпосылки для распространения плесневых грибов внутри тканей развивающегося растения [Miller J.D., 1999; Bacon C.W., Nelson Р.Е.; 1994]. Загрязнение этими токсинами возрастает при неправильном хранении зерна [Bacon C.W., Nelson Р.Е.; 1994]. Во влажном зерне при повышенных температурах может наблюдаться значительный прирост концентрации фумонизинов. Уровень фумонизинов в зернопродуктах варьирует в зависимости от технологии производства: способа размола зерна, температурной обработки, использования эмульгаторов, щелочей и пр. Следует

25 отметить, что гибриды кукурузы, полученные с помощью генной инженерии путем встраивания генов от бактерий Bacillus ihuringiensis (Bt-кукуруза), которые производят белки, токсичные для насекомых (особенно для мотылька кукурузного), менее подвержены поражению грибами Fusarium и загрязнению фумонизинами, чем обычная кукуруза [Munkvold G.P., Desjardins А.Е., 1997, Munkvold G.P., et al, 1999].

При культивировании гриба-продуцента в лабораторных условиях на кукурузе или рисе, или на жидкой среде на долю ФВі приходится 70-80%, в то время как ФВ₂ - до 15-25%, а ФВ₃ - 3-8% от общего количества фумонизинов [Branham В.Е., Planner R.D., 1993; Diaz С J., Boermans H.J., 1994; IARC 1993; Marin S„ et al., 1995; Stockenstrom S. et al., 1998; Visconty A., Doko M.B., 1994]. Кроме фумонизинов группы В, некоторые другие аналоги могут быть обнаружены в естественно контаминированной кукурузе в относительно малых количествах (< 5% от общего количества обнаруженных фумонизинов) [Musser S.M., et al., 1996]. Однако, в некоторых случаях была выявлена противоположная закономерность, когда содержание ФВ₂ выше, чем ФВ[ и соотношение ФВ^ФВг составляет 1,1:3,5 [Sanchis V., et al., 1995].

В естественно загрязненной кукурузе соотношение концентраций ФВ[ к ФВ₂ составляет 3:1, а ФВі и ФВ₃ соотносятся как 12:1 [Weidenborner М., 2001]. В естественно контаминированных пробах кукурузы могут накапливаться небольшие количества ФВ₄, ФС] (1 % от содержания ФВ[) и ФА₍ и ФА₂ (N-ацитилированные фумонизины) [Ross P.F., et al., 1992].

По мере физиологического созревания початков наблюдается повышение концентрации ФВ_1? максимальный уровень ФВі обнаружен в вызревших початках зараженной кукурузы [Warfield C.Y., Gilchrist D.G., 1999].

При контаминации кукурузы грибы рода Fusarium продуцируют семь гидролитических ферментов, три из которых — a-D-галактозидаза, p-D-глюкозидаза и ЬГ-ацетил-р-О-глюкозаминидаза, превалируют по активности и уровню синтеза над остальными четырьмя ферментами, а именно, P-D-

26 фукозидазой, a-D-маннозидазой, P-D-ксилозидазой и N-ацетил-а-О-глюкозаминидазой [Marin S., et al., 1998].

Уровень синтеза трех наиболее активных ферментов особенно высок между 3- и 15- днями колонизации посевов фузариями, причем их активность максимальна при 98% относительной влажности воздуха. Эти три фермента играют несомненную роль в ускорении поражения растущих зерновых культур грибами рода Fusarium и контаминации их фумонизинами [Marin S., et al., 1998].

Основным производителем кукурузы в мире является США, продукция этой культуры превышает 200 миллионов т/год. Интересно заметить, что концентрация ФВі и ФВг на кукурузных полях в США часто превышает 1 мг/кг кукурузы [Murphy Р.А., et. al., 1993]. Из 200 миллионов тонн в питание населения страны поступает примерно 10% собранной кукурузы, в то время как в Мехико 72% всей кукурузной продукции используют для питания человека. Следует подчеркнуть, что самое высокое потребление кукурузы - 460 г/ 70 кг массы тела/день отмечают в Южной Африке.

Контаминация фумонизинами кукурузы выявляется повсеместно. Имеются данные о загрязнении кукурузы в странах Европы (Хорватии, Венгрии, Италии [Doko M.V., et al., 1995], Германии [Meister U., et al., 1996], Нидерландах [De Nijs M. et al., 1998], Испании, Швеции, Швейцарии [Marasas W.F.O., et al., 1996], Великобритании, Англии [Scudamore К.A., et al., 1998] и Чехии [Ostry V., Ruprich J., 1998]), Северной Америки (Канады, США), Южной и Центральной Америки (Бразилии [Ono Е., et al., 2000], Аргентине, Колумбии, Коста-Рике, Гондурасе, Уругвае и Венесуэле), а также в странах Азии и Африки [WHO, 2001].

Анализ данных по распространенности ФВ! и ФВ₂ в Европейских странах показал особо высокую частоту и уровни загрязнения этими токсинами заплесневелого зерна кукурузы. 71% исследованных партий кукурузы в Венгрии содержали фумонизины в количестве от 1,842 до 19,8 мг/кг зерна, в Италии - практически все изученные партии зерна были загрязнены токсинами,

27 при этом концентрации их были чрезвычайно высокими - среднее содержание составляло 67 мг/кг, а максимальный уровень загрязнения достигал 300 мг/кг [Fazekas В., et. al., 1996; Ritieni Л., et al., 1997]. В Хорватии от 93 до 97% проб зерна кукурузы содержали токсин, среднее содержание в отдельные годы составляло 0,627 мг/кг, а максимальные уровни достигали 11,661 мг/кг [Jurjevic Z., et. al., 1999]. В кукурузе, поступившей по импорту в Аргентину из Франции, диапазон загрязнения находился в пределах от <0,03 до 5 мг/кг [Scudamore К.Е., Patel S„ 2000].

Высокие концентрации ФВ| в зерне кукурузы также были обнаружены в Австралии - до 40,6 мг/кг, 27 мг/кг в Аргентине, 117 мг/кг в Южной Африке, 155 мг/кг в Китае, 38 мг/кг в США. Кукуруза, поступившая по импорту в Нидерланды, была загрязнена фумонизинами в диапазоне от 0,03 до 3,35 мг/кг [de Nijs М., et. al., 1998]. В Аргентине 92 % исследованных партий кукурузы содержали фумонизины в концентрации более 1,0 мг/кг, максимум загрязнения составил 3,406 мг/кг [Scudamore К.Е., Patel S., 2000].

В процессе переработки наибольшее снижение содержания фумонизинов достигается при использовании различных методов термической обработки, обработки щелочью, при сухом и влажном помоле кукурузы [Alberts J.F., et al., 1990, Jackson L.S., et al., 1996]. Согласно данным Брера и соавторов процесс сухого помола кукурузы обеспечивал заметное снижение содержания фумонизинов в крупе крупного и мелкого помола и кукурузной муке. Наибольшие концентрации фумонизинов были обнаружены в кукурузном зародыше, отрубях и продуктах кормового назначения [Вгега С, et al., 2004]. Технологическая обработка кукурузы при производстве кукурузных хлопьев приводила к существенному снижению концентрации фумонизинов, при этом около 30% токсина разрушалось при экструзии (70-170С в течение 2-5 минут) [Pineiro М., et al., 1999]. Никстамализация, - традиционный метод, используемый за рубежом при производстве масы и тортилла муки, с применением кипячения и обработки кукурузы щелочью, значительно снижал уровни загрязнения ФВі в конечных продуктах, однако приводил к

28 образованию гидр ол изо ванного ФВ_1? обладающего токсичностью [Dombrink-Kurtzman М.А., et al., 2000]. Процесс влажного помола, используемый для получения кукурузного крахмала, обеспечивал значительное, либо полное удаление фумонизинов из основного продукта - крахмала, при этом эти токсины, будучи хорошо растворимыми в воде, переходят в водную фракцию, и концентрируются в кукурузном зародыше и глютене. Термическая обработка кукурузы при жарке (218С в течение 15 мин.) приводила к разрушению фумонизинов, но эти токсины проявляли стабильность к процессам консервирования (121С до 87 мин.) и выпечки.

Анализ данных по контаминации основных продуктов переработки кукурузы, таких как мука, крупа, полента и семолина, также свидетельствует о высокой частоте обнаружения и уровнях контаминации фумонизинами этих продуктов. Самые высокие концентрации фумонизинов в продуктах переработки кукурузы, обнаруженные в Европе составили 16 мг/кг, несколько меньшие в Северной Америке, Латинской Америке, Африке и Азии и (6,32; 4,93; 3,63 и 2,60 мг/кг соответственно) [Machinsky М. Jr., Soares L.M.V., 2000; Pestka J.J., Bondy G.S., 1994; Sydenham E.W., et al., 1993; Usleber E., et. al., 1994].

Наименее загрязненными оказались такие продукты переработки кукурузы, как попкорн, хлопья, тортиллы, чипсы, содержащие кукурузу [Usleber Е., et. al., 1994; Henningen M.R., et. al., 2000; Mashinsky M. Jr., Soares L.M.V., 2000]. Например, загрязнение этих продуктов во Франции варьировало от 0,02 до 1,5 мг/кг. В Испании 10% продуктов переработки кукурузы содержали очень низкие концентрации токсина 0,05-0,2 мг/кг [Sanchis V., et. al., 1994]. В странах Северной Америки контаминация фумонизинами этой группы продуктов переработки кукурузы варьировала от 0,004 до 0,7 мг/кг [Hopmans E.S., et. al., 1993; Pestka J.J., Bondy G.S., 1994; Sydenham E.W., et. al., 1991; Trucksess M.W., et. al., 1995].

Фумонизины обнаруживают также в единичных случаях и в низких концентрациях в сорго [Abbas Н.К., et al., 1998; Da Silva J.B., 2000; Shatty P.M., Bhat R.V., 1997], рисе [Patcl S., et al., 1997], специях [Pittet A., 1998], томатах

29 [Mirocha C.J., et al., 1996], спарже [Logrieco A., et. al., 1998] и пиве [Torres M.R., et al., 1998]. Очень редко и в небольших количествах ФВі обнаруживают в пшенице, ячмене и сое и продуктах из них [Castella G., et al., 1999b, Cirillo Т., et. al., 2003], а также в черном чае [Martins M.L., Martins H.M., 2001].

JECFA установил величину ПСП фумонизинов (ФВ|+ФВ₂+ФВ₃) для человека на уровне 2 мкг/кг массы тела (коэффициент безопасности - 100) [WHO, 2001].

Некоторые страны ввели ограничения на содержание фумонизинов в продуктах из кукурузы. Так, например, рекомендуемое ограничение на содержание фумонизинов в продуктах переработки кукурузы в США установлено на уровне 2 мг/кг (помол с отбором зародыша, содержание жира менее 2,25%), 4 мг/кг (помол без отбора зародыша, содержание жира более 2,25%) [FDA, 2000], а в Швейцарии для кукурузных продуктов - на уровне 1 мг/кг для суммы ФВі+ФВ₂ [Marasas W.F.O., 2001].

2.1.3.3. Биологическое действие фумонизинов

Механизм токсического действия фумонизинов недостаточно изучен.

Исследования показали, что фумонизины являются природными ингибиторами биосинтеза сфинголипидов, которые обладают высокой биологической активностью и регулируют многочисленные процессы в клетках прокариотов и эукариотов [Merrill A.H.Jr., et al., 1991; Wang D.-S., et al., 1993]. Фумонизины, обладая строением, сходным со сфингозином, ингибируют действие ферментов сфингозин-сфингонин-трансферазы и церамидсинтазы, что приводит к нарушению клеточных процессов, таких как рост клетки, клеточная дифференциация, проницаемость клеток эндотелия и апоптоз [Merill A.H.Jr., 1991, Norred W.P., et. al., 1996, 1998; Riley T.R., et al., 1996; Wang E., et al., 1999]. Доза фумонизинов, вызывающая апоптоз, зависит от способа введения и может варьировать от 0,9 до 12 мг ФВ₍/кг массы тела грызуна (в долгосрочном и краткосрочном исследовании, соответственно). Одним из показателей воздействия фумонизинов является возрастание отношения свободный

сфинганин/свободный сфингозин в сыворотке крови, внутренних органах и моче. Полагают, что фумонизины могут являться одной из причин развития дефектов нервной трубки как следствие нарушение ими транспорта фолиевой кислоты [Delongchamp R.R., Young J.F., 2001; Riley R.T., et al., 1994, 1996; Stevens V.L., Tang J., 1997]. Фумонизины ингибируют фермент сфинганин-iV-ацилтрансферазу [Wang Е., et al., 1991], что приводит к накоплению свободных сфинганинов, снижению сфингозинов, которые являются промежуточными звеньями в цепи биосинтеза сложных сфинголипидов. Ингибировапие биосинтеза гликосфинголипидов наблюдается уже через несколько часов после введения внутрь ФВї [Riley R.T., et al., 1996].

Изучение метаболизма фумонизинов в экспериментах на лабораторных животных показало, что фумонизины плохо всасываются из желудочно-кишечного тракта, быстро удаляются из кровотока и концентрируются, главным образом, в печени и почках [Norred W.P., et al., 1993, 1996, 1998; Prelusky D.B., et at., 1994, 1995, 1996]. He обнаружена способность к плацентарному переносу и выделению с молоком. Выводятся фумонизины, главным образом, с калом в неметаболизированном виде, в моче обнаруживают следовые количества токсинов (менее 1 %) [Collins T.F., et al., 1998a,b; LaBorde J.B., et al, 1997; Norred W.P., et al., 1993, 1996, 1998; Smith J.S.,Thakur R.A., 1996; WHO, 2000].

Главными органами — мишенями токсического действия фумонизинов у животных являются печень и почки [Gelderblom W.C.A., et al., 1996a,b,c; SCF, 2000].

Фумонизины обладают нефротоксичным действием для свиней, крыс, овец, мышей и кроликов. В хроническом эксперименте на крысах установлено, что потребление крысами-самцами 0,25 мг ФВ)/кг массы тела/день приводит к поражению почек. Нефротоксичность проявлялась в жировой инфильтрации, единичных некрозах почек или пикнозе, гиперплазии.

31 мышей-самок, так, потребление 0,7 мг ФВ^кг массы тела вызывало поражение печени [Gelderblom W.C.A., et а!., 1988, 1991, 1992а,Ъ, 1993, 1994]. Гепатотоксичиость характеризовалась рассеянными единичными некрозами клеток, сопутствующими жировыми изменениями.

ФВі обладает канцерогенными свойствами. Высокие уровни потребления ФВі могут привести к образованию злокачественных опухолей у животных [Dutton M.F., 1996]. Показано, что потребление 2,5 мг ФВ|/кг массы тела приводит к формированию у крыс-самцов аденом и карценом в почках, доза 7 мг ФВ]/кг массы тела/день вызывает увеличение случаев рака печени, что проявляется в образовании узлов в печени, аденофиброза, гепатоцеллюларных опухолей и опухолей желчных путей. [Gelderblom W.C.A., et al., 1996a,b,c]. Воздействие ФВі в дозе 250 мг/кг массы тела на крыс в течение 5 недель приводит к развитию токсического гепатита и печеночной недостаточности, сопровождающейся повышением активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови более, чем в четыре раза [Lemmer E.R., et al., 1999].

В системе клеточных культур, фумонизины проявляют мутагенное и цитотоксичное действие без проявления генотоксичности [Bhatnagar D., et al., 2002; Gelderbloom W.C.A., etal., 1993, 1994].

Фумонизины вызывали лейкоэнцефаломаляцию у лошадей и пони, которая проявлялась в виде неврологических изменений у животных, включая некоординируемые движения и слепоту. Эта болезнь характеризуется отеком мозжечка [Kellerman T.S., et al, 1990; Ross P.F., et al, 1993, 1994; Uhlingcr C, 1997]. Минимальные дозы ФВ_Ь которые вызывают это заболевание у лошадей находятся в диапазоне от 0,2 до 0,44 мг ФВ^кг массы тела/день [Ross P.F, et al, 1994]. Уровни ФВі и ФВ₂ в кормах, связываемых со случаями лейкоэнцефаломаляции у лошадей варьируют от 1,3 до 27 мг/кг [Chu F.S, 1995].

Фумонизины являются причиной отёка легких у свиней, нарушения костной ткани и опорно-двигательного аппарата у домашней птицы [Lemmer E.R, et al, 1999; Li W., et al, 1999; Marasas W.F.O, 1994; Motelin G.K, et al, 1994; Munkvold G.P, et al, 1999; Wu W, et al, 1995].

В ряде сообщений указывают на роль ФВ] в этиологии рака пищевода у людей в регионе Южной Африки, Китае и Северной Италии, где виды Fusarium являются основными контаминантами.

Международное Агентство по Изучению рака классифицирует фумонизииы, как соединения класса II В (вероятно канцерогенные для человека) [IARC 1993, WHO, 2002].

2.1.3.4. Методы определения фумонизинов

Современные методы определения фумонизинов основаны на применении ВЭЖХ [Duncan К., et al., 1998; Shephard G.S., et al, 1995, 1996, Shephard G.S., 1998], TCX [Gelderblom W.C.A., et al., 1991; Shelby R.A., et al., 1994; Shephard G.S., Sewram V., 2004], ГХ [Plattner R.D., et al., 1990; Sydenham E.W., et al., 1990], и каппилярного электрофореза [Hines H.B., et al., 1995; Marasas W.F.O., 1995]. В качестве скрининг-метода используют ИФА [Azcona-Olivera J.A., et al., 1992; Meister U., 2001]. Использование ГХ/МС позволяет значительно увеличить чувствительность определения фумонизинов [Shephard G.S., et al., 1996], исключить стадии дериватизации анализируемого вещества и его концентрирования и очистки на патроне [Hartl М., et al., 1999]. Однако ГХ/МС является трудоемкими и требующим дорогостоящего оборудования методом, что не позволяет проводить серийные анализы большого количества проб.

Дезоксиниваленол

ДОН - трихотеценовый токсин (ТТМТ), относящийся к трихотеценам группы В. По своей химической структуре ТТМТ относятся к сесквитерпенам. Они содержат основное ядро из трех циклов, называемых трихотеканом, в составе которого эпоксидное кольцо при С-12, 13 и двойная связь при С-9, 10, поэтому эти соединения получили название трихотец-9-ены. К группе В относятся соединения, имеющие в положении C-S карбонильную группу [Banburg J., 1976]. Основными продуцентами ДОН являются штаммы F. nivale, F. graminearum и F. culmorum [Miller J.D., et al., 2001; Ueno Y., et al., 1973]. Этот токсин растворим в воде и является химически стабильным.

Острое токсическое действие ДОН у животных характеризуется уменьшением потребления пищи, диареей и рвотой. Наблюдаются нарушения центральной нервной системы, поражение кровеносной, кроветворной и иммунной систем. ДОН отличается выраженным тератогенным действием. LD50 ДОН для мышей составляет 70 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном способе введения токсина, 45 мг/кг массы тела при подкожном введении и 46 мг/кг массы тела при введении ДОН внутрь [Forsell J.H., et al., 1987; Thompson W.L., Wanermacher R.W., 1986]. Для цыплят-бройлеров при введении внутрь LD5o составляет 140 мг/кг массы тела [Huff W.E., et al., 1981], для уток при подкожном введении токсина - 27 мг/кг массы тела. Особенно чувствительны к воздействию ДОН свиньи [Тутельян В .А., Кравченко Л.В., 1985].

Следует отметить, что в России пшеница является основной зерновой культурой, реже потребляется ячмень и рожь. В южных регионах возделывания зерновых культур в отдельные годы имел широкое распространение фузариоз зерна и колоса. Наиболее часто наряду с фузариозом пшеницы отмечался фузариоз ячменя. Вспышки фузариоза наблюдались, в 1985 году, 1988-1989, 1992-1993 годах с необычно влажными условиями в период созревания [Захарова Л.П. и др., 1994; Соболев B.C. и др., 1990]. Основные ареалы фузариоза охватывали южные районы России, Краснодарский и Ставропольский края. Однако отмечена тенденция к расширению фузариоза и в других регионах производства сильных и ценных сортов пшеницы: в Центрально-Черноземном районе, Московской области, Молдове и Украине, что приводило к значительным потерям ресурсов наиболее высококачественного зерна [Tutelyan V.A., et al., 1990; Tutelyan V.A., 1998, 2004].

Биологическое действие фумонизинов

Механизм токсического действия фумонизинов недостаточно изучен. Исследования показали, что фумонизины являются природными ингибиторами биосинтеза сфинголипидов, которые обладают высокой биологической активностью и регулируют многочисленные процессы в клетках прокариотов и эукариотов [Merrill A.H.Jr., et al., 1991; Wang D.-S., et al., 1993]. Фумонизины, обладая строением, сходным со сфингозином, ингибируют действие ферментов сфингозин-сфингонин-трансферазы и церамидсинтазы, что приводит к нарушению клеточных процессов, таких как рост клетки, клеточная дифференциация, проницаемость клеток эндотелия и апоптоз [Merill A.H.Jr., 1991, Norred W.P., et. al., 1996, 1998; Riley T.R., et al., 1996; Wang E., et al., 1999]. Доза фумонизинов, вызывающая апоптоз, зависит от способа введения и может варьировать от 0,9 до 12 мг ФВ(/кг массы тела грызуна (в долгосрочном и краткосрочном исследовании, соответственно). Одним из показателей воздействия фумонизинов является возрастание отношения свободный сфинганин/свободный сфингозин в сыворотке крови, внутренних органах и моче. Полагают, что фумонизины могут являться одной из причин развития дефектов нервной трубки как следствие нарушение ими транспорта фолиевой кислоты [Delongchamp R.R., Young J.F., 2001; Riley R.T., et al., 1994, 1996; Stevens V.L., Tang J., 1997]. Фумонизины ингибируют фермент сфинганин-iV-ацилтрансферазу [Wang Е., et al., 1991], что приводит к накоплению свободных сфинганинов, снижению сфингозинов, которые являются промежуточными звеньями в цепи биосинтеза сложных сфинголипидов. Ингибировапие биосинтеза гликосфинголипидов наблюдается уже через несколько часов после введения внутрь ФВЇ [Riley R.T., et al., 1996].

ФВ] гепатотоксичен для большинства видов животных, включая крыс, лошадей, мышей, кроликов и свиней. Хронические эксперименты, проводимые на мышах, показали, что ФВі проявляет гепатотоксическое действие для мышей-самок, так, потребление 0,7 мг ФВ кг массы тела вызывало поражение печени [Gelderblom W.C.A., et а!., 1988, 1991, 1992а,Ъ, 1993, 1994]. Гепатотоксичиость характеризовалась рассеянными единичными некрозами клеток, сопутствующими жировыми изменениями.

ФВі обладает канцерогенными свойствами. Высокие уровни потребления ФВі могут привести к образованию злокачественных опухолей у животных [Dutton M.F., 1996]. Показано, что потребление 2,5 мг ФВ/кг массы тела приводит к формированию у крыс-самцов аденом и карценом в почках, доза 7 мг ФВ]/кг массы тела/день вызывает увеличение случаев рака печени, что проявляется в образовании узлов в печени, аденофиброза, гепатоцеллюларных опухолей и опухолей желчных путей. [Gelderblom W.C.A., et al., 1996a,b,c]. Воздействие ФВі в дозе 250 мг/кг массы тела на крыс в течение 5 недель приводит к развитию токсического гепатита и печеночной недостаточности, сопровождающейся повышением активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови более, чем в четыре раза [Lemmer E.R., et al., 1999].

Фумонизины вызывали лейкоэнцефаломаляцию у лошадей и пони, которая проявлялась в виде неврологических изменений у животных, включая некоординируемые движения и слепоту. Эта болезнь характеризуется отеком мозжечка [Kellerman T.S., et al, 1990; Ross P.F., et al, 1993, 1994; Uhlingcr C, 1997]. Минимальные дозы ФВЬ которые вызывают это заболевание у лошадей находятся в диапазоне от 0,2 до 0,44 мг ФВ кг массы тела/день [Ross P.F, et al, 1994]. Уровни ФВі и ФВ2 в кормах, связываемых со случаями лейкоэнцефаломаляции у лошадей варьируют от 1,3 до 27 мг/кг [Chu F.S, 1995].

Иммуноферментный метод определения фумонизинов

Для определения содержания фумонизинов в зерне кукурузы и культурах F. moniliforme применяли тест-систему для иммунофермеытного анализа Ридаскрин Фаст Фумонизин ("R-Biopharm», Германия). Данная методика позволяет проанализировать сумму трех фумонизинов ФВі+ФВ2+ФВ3. Тонко измельченное зерно или культуру гриба (5 г) экстрагировали 70% раствором метанола в воде при постоянном встряхивании в течение 3 мин. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр и 1 мл фильтрата разбавляли 6 мл дистиллированной воды.

В лунки планшета, сенсибилизированные антителами, специфичными к фумонизину, добавляли по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов. В каждую лунку вносили по 50 мкл препарата коньюгата и по 50 мкл препарата антител. Тщательно перемешивали и оставляли для инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Выливали жидкость из лунок и промывали дважды дистиллированной водой. В каждую лунку добавляли по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена и субстрата, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут в темноте. Добавляли по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента и хорошо перемешивали. В течение 30 минут после его добавления измеряли оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

Оптическую плотность в лунках измеряли на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» АИФР-1 (Россия) при длине волны 450 км. Предел обнаружения фумонизина -0,1 - 0,222 мг/кг, диапазон определяемых концентраций фумонизинов - 0,1 - 0,222 - 6,4 мг/кг, время анализа одной пробы 0,5 - 1,0 ч., перекрестная чувствительность для ФВьФВггФВз составляет 100:40:100%.

Концентрацию фумонизинов в исследуемых растворах в мг/кг рассчитывали по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.

Для определения содержания фумонизинов (ФВі+ФВ2+ФВз) в продуктах переработки кукурузы и продуктов питания на основе кукурузы применяли более чувствительную тест-систему иммуноферментного анализа Ридаскрин Фумонизин Фаст ("R-Biopharm», Германия). Тонко измельченное зерно кукурузы или кукурузной продукции (5 г) растворяли в 10 мл метанол-дистиллированной воды (75:25), перемешивали 20 минут на магнитной мешалке и центрифугировали 15 минут при 2700 оборотах в минуту. Супернатант отфильтровывали через бумажный фильтр и разбавляли в буфере PBS (0,55 rNaH2P04x Н20; 2,85 г Na2HP04 х 2Н20 + 8,7 rNaCL, добавляя 1000 мл дистиллированной воды). Этот разбавленный фильтрат разбавляли еще раз в отношении 1:3 раствором метанола (10% об.) в фосфатном буфере. Фактор разбавления пробы равен 45.

В лунки планшета, сенсибилизированные антителами, специфичными к фумонизинам, добавляли по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов. В каждую лунку вносили по 50 мкл препарата коньюгата. Тщательно перемешивали и оставляли для инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут. После двойной промывки дистиллированной водой в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора хромогена и субстрата, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. Затем вносили по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешивали. В течение 60 минут после его добавления измеряли оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха на «Униплане» АИФР-1.

Предел обнаружения фумонизинов - 0,009 мг/кг, диапазон определяемых концентраций фумонизинов - 0,009 - 5,6 мг/кг, время анализа 1 пробы 2,0-2,5 ч., перекрестная чувствительность для ФВі:ФВ2:ФВз составляет 100:40:100%.

А) Приготовление и хранение стандартных растворов ДОН и ЗЛ.

Приготовление растворов хранения ДОН и ЗЛ осуществляли следующим образом. Навеску микотоксина (1-10 мг) помещали в мерную колбу емкостью 100 или 250 мл, приливали 20-30 мл смеси бензол-ацетонитрил (5:1) для ДОН или бензол для ЗЛ, тщательно перемешивали до полного растворения вещества, доводили растворителями до метки и измеряли оптическую плотность по данным УФ-спектрометрии против соответствующего растворителя (табл, 1). Поскольку измерение оптической плотности ДОН и ЗЛ проводят в метаноле, для этого 3 мл бензольного или раствора бешол-ацетонитрила переносили в чистую пробирку, растворитель упаривали в токе азота досуха и к остатку добавляли 3 мл метанола.

Выбор состава экстракционной смеси для экстракции фумонизинов BL и Вг из образца

С целью определения распространенности F. moniliforme в отечественном зерне нами была изучена внутренняя микофлора 158 проб кукурузы, в том числе 138 проб отечественного происхождения и 20 проб импортированных из разных стран. Поверхностную микофлору исследовали в 10 пробах зерна и в 39 пробах продуктов переработки кукурузы.

Согласно принятому в микробиологии зерна подходу, грибы распределяли на две экологические группы - так называемые «полевые грибы» и «грибы хранения». Полевые грибы включают в себя факультативных паразитов и сапрофитов, развивающихся на созревающем зерне в поле: виды Fusarium, Cladosporium, Altemaria, Nigrospora, Trichoderma и др. К грибам хранения, называемым также грибами порчи, относили типичные сапрофитные виды родов Aspergillus, Penicillium и мукоровые грибы, вызывающие процессы порчи зерна в неблагоприятных условиях хранения.

Численность и видовой состав микофлоры зерна кукурузы является интегральным показателем, характеризующим условия его созревания и хранения. В поле микофлора преимущественно представлена полевыми грибами. При хранении свежеубранного зерна с высокой влажностью и температурой в нем возрастает численность сапрофитных грибов хранения, вытесняющих полевые грибы. Появление в микофлоре кукурузы видов A.Jlavus и A. candidus является показателем начавшихся процессов самосогревания и порчи зерна, поскольку эти виды развиваются лишь при высокой влажности ( 18%) и температуре 30-40С.

Микробиологический анализ 158 проб зерна урожаев 1999-2002 г.г. показал, что самым распространенным видом во внутренней микофлоре кукурузы является полевой гриб F. moniliforme — основной продуцент фумонизинов, который поражал 97-100% проб отечественного зерна (табл. 3). Прочие виды фузариев встречались в единичных случаях. Из грибов хранения значительное распространение получили представители вида A. flavus -потенциальные продуценты афлатоксинов (73-96% проб) и мукоровью грибы (74-100%). Согласно данным, представленным в табл. 3, зерно разных лет практически не отличалось по распространенности этих групп грибов. Частота обнаружения других грибов хранения (Penicillium spp, A. glaucus) заметно колебалась по годам, например, у A. glaucus в пределах 5-51% проб, что отражает разный характер микробиологических процессов в отдельные годы.

В импортированной кукурузе F. moniliforme и A. flavus встречались реже, чем в отечественной: они поражали 85 и 65% исследованных проб, большее распространение имел ксерофитный вид аспергиллов - A. glaucus. Полученные результаты подтвердили существующее мнение о преимущественной взаимосвязи F. moniliforme с кукурузой [Trigo-Stockli D.M., et al., 1996].

Согласно данным, представленным в табл. 4, средняя пораженность грибами отечественного зерна была наименьшей в 1999 г. (56 кол./ЮО зер.), в зерне урожая 2002 г. она достигла 82 кол./100 зер. Полевая микофлора кукурузы состояла в основном из F. moniliforme (22-37 кол./ЮО зер.). Из других полевых грибов были обнаружены лишь единичные экземпляры Cladosporium herbatum, Nigrospora spp., Aliernaria tenuis и F. graminearum.

В целом, F. moniliforme являлся доминирующим видом в микофлоре, на его долю приходилось 36,0-53,6% от общего количества грибов. Среди грибов хранения доминирующее положение занимал A. flavus (10-25 кол.). По своей распространенности и численности во внутренней микофлоре F. moniliforme превосходил другие, сапрофитные, виды грибов (Aflavus, Penicillium spp, Мисогасеаё).

В 1999 г. кукуруза по всем показателям (по общей численности грибов, и по соотношению видов) была более благополучна, чем в другие годы. Для урожая 1999 г. характерно преобладание полевых грибов, более низкая численность и распространенность грибов, вызывающих порчу при хранении.

Кукуруза урожаев 2001 и 2002 г.г. сильнее поражалась грибами хранения, в особенности A.JIavus. Кукуруза урожая 2000 г. занимала по этим показателям промежуточное положение.

Импортированная кукуруза отличалась от отечественного зерна меньшей пораженностью F. moniliforme и A. flavus, что указывает на более благополучные условия ее возделывания и хранения.

Таким образом, проведенные исследования показали, что преобладающим видом среди других потенциально токсигенных грибов, поражавших кукурузу, является F. moniliforme.

Анализ средних данных по годам (табл. 4) не обнаружил связи между пораженностью зерна F. moniliforme и его загрязнением фумонизинами. Так, концентрация фумонизинов в кукурузе 1999 г. была в 1,8 раз ниже, чем в 2001 г., тогда как пораженность F. moniliforme оставалась практически на том же уровне. Однако зерно в эти годы отличалось по интенсивности поражения грибами хранения, в особенности A. flavus, что позволяет предположить возможность дополнительного накопления фумонизинов в хранящейся кукурузе в годы, благоприятствующие развитию микробиологических процессов в сыром свежеубранном зерне кукурузы.

Анализ поверхностной микофлоры зерна кукурузы и продуктов ее переработки не выявил отличий в видовом составе грибов от внутренней микофлоры. Однако соотношение разных групп грибов было иное (табл. 5). F. moniliforme присутствовал во всех пробах зерна, крупы, муки и зародыша, на его долю приходилось 35,1% от общего числа грибов в зерне, 77,0% - в крупе, 40,4% - в муке и 29,0% - в зародыше. Доминирующей группой в зерне и муке были пенициллы (38,1 и 47,1% от суммы грибов), в крупе доминировал F. moniliforme и только в зародыше A. flavus (39,8%).

Изучение частоты и уровня контаминации продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки некоторыми фузариотоксинами Седова Ирина Борисовна

Дезоксиниваленол

Биологическое действие фумонизинов

Иммуноферментный метод определения фумонизинов

Выбор состава экстракционной смеси для экстракции фумонизинов BL и Вг из образца

Похожие диссертации на Изучение частоты и уровня контаминации продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки некоторыми фузариотоксинами