Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Обзор литературы
2.1. Этиологическая роль бактерий рода Citrobacter 8
2.2. Факторы патогенности бактерий рода Citrobacter 11
Глава 3. Материал и методы исследования 23
Глава 4. Собственные исследования
4.1. Сравнительная морфологическая и культуральная характеристика бактерий рода Citrobacter, выделенных при инфекционных процессах в составе микст- и монокультуры 37
4.2. Биохимический и серологический пейзаж Citrobacter spp . 43
4.3. Питательные потребности клинических штаммов бактерий рода Citrobacter (ауксо - и прототрофность) 45
4.4. Адгезивная активность бактерий рода Citrobacter 47
4.5. Факторы бактерий рода Citrobacter, коррелирующие с патогенностью микроорганизмов 52
4.6. Персистирующие свойства бактерий рода Citrobacter 58
4.7. Тестирование на биологических моделях вирулентности бактерий рода Citrobacter, выделенных в микст- и моноинфекциях 60
4.8. Молекулярно-генетическое типирование клинических штаммов Citrobacter, выделенных в моно- и в микст-инфекциях 68
4.9. Плазмидный профиль бактерий рода Citrobacter 73
Заключение 80
Выводы 99
Список литературы 101
- Этиологическая роль бактерий рода Citrobacter
- Факторы патогенности бактерий рода Citrobacter
- Сравнительная морфологическая и культуральная характеристика бактерий рода Citrobacter, выделенных при инфекционных процессах в составе микст- и монокультуры
- Биохимический и серологический пейзаж Citrobacter spp
Введение к работе
Актуальность работы. В последние годы наблюдается изменение этиологической структуры инфекционной заболеваемости человека, с четкой тенденцией повышения удельного веса условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов. Данная патология человека характеризуется выраженным клиническим. полиморфизмом, связанным с одновременным воздействием нескольких этиологических агентов, каждый, из которых имеет в своем арсенале комплекс факторов патогенности. Интерпретацию результатов при этих инфекциях затрудняет высокая частота выявления условно-патогенных микроорганизмов в составе микст-культур, каждая из которых обладает рядом характеристик,, сочетание которых может определять высокий вирулентный потенциал патогенов в целом (Воробьев А.А., 1998; Бухарин О.В., 2000).
В наибольшей степени это относится к условно-патогенным бактериям семейства Enterobacteriaceae, выделяемым в составе микст-инфекций (Габидуллин З.Г., 1999).
В качестве оптимальной модели мы избрали бактерии . рода Citrobacter, поскольку темпы изменений свойств патогенных представителей этих микроорганизмов, выделенных при моно- и микст-инфекциях высоки и отмечено возрастание их роли в инфекционной патологии человека (Туйгунов М.М., 2003).
К тому же литературные данные свидетельствуют о широкой распространенности представителей рода Citrobacter в окружающей среде, в воде, почве [21, 37]. Некоторые исследователи относят их даже к естественным обитателям кишечника, т.к. они нередко выделяются и у практически здоровых людей [34,46].
Вместе с тем следует признать, что в последние годы появились сообщения о развитии тяжелых гнойно-воспалительных, урологических и кишечных инфекций, вызванных бактериями рода Citrobacter в ассоциации с другими представителями условно-патогенных микроорганизмов [16, 32,47].
Отмечено, что по частоте встречаемости бактерии рода Citrobacter при различных инфекционных процессах колеблются от 9,3% до 14,5%, от общего числа всех выделенных условно-патогенных грамотрицательных возбудителей [49, 206]. По данным других авторов, высеваемость бактерий рода Citrobacter при острых кишечных заболеваниях еще выше, достигая 19,4 - 39,0 % случаев [27, 82, 86]..
Провести при этом дифференцировку патогенных и непатогенных представителей данного рода по культуральным и ферментативным свойствам представляется не всегда возможным. Для осуществления четкого контроля за распространением и проведением противоэпидемических мероприятий, а также разработки критериев отнесения выделенных культур в каждом конкретном случае к этиологическим, требуется всестороннее изучение сравнительных биологических свойств клинических штаммов Citrobacter, выделенных при инфекционных процессах как в виде моно-, так и в микст-культурах..
В связи с вышеуказанным, актуальным представляется сравнительная характеристика биологических свойств бактерий рода Citrobacter выделенных клинических культур как при моно-, так и в ассоциированных микст-инфекциях.
Цель исследования
Провести сравнительное изучение некоторых биологических свойств бактерий рода Citrobacter, выделенных от больных с инфекционными процессами различной локализации при моно- и ассоциированных бактериальных инфекциях.
Задачи исследования
1. Установить частоту встречаемости Citrobacter spp. при кишечных, гнойно-воспалительных и урологических: инфекциях и изучить их культуральные свойства и морфологические особенности с использованием электронного микроскопа.
Провести сравнительную оценку адгезивной, гемолитических (а-, тиолзависимый и энтерогемолизин), лецитиназной, ДНК-азной активности, персистирующих свойств Citrobacter spp, выделенных при ассоциированных бактериальных инфекциях и в монокультуре.
Провести сравнительную оценку патогенных свойств клинических штаммов Citrobacter spp., выделенных в моно- и ассоциированных бактериальных инфекциях, на различных биологических моделях экспериментальной инфекции.
Выяснить природу генетических детерминант, контролирующих адгезивную, гемолитическую, LT-, ST-энтеротоксигенную активности Citrobacter spp.
Научная новизна. Впервые с помощью электронного микроскопирования описаны морфологические особенности Citrobacter spp. и изучены взаимоотношения бактериальных клеток Citrobacter spp. в колониях. При этом выявлено два типа контактов: плотное слипание и образование перемычек на уровне наружных мембран..В концентрических зонах колоний микробы преимущественно представлены клетками, образующими швермеры, с избыточным количеством жгутиков и не способных к делению.
У клинических изолятов Citrobacter spp., выделенных при острых ассоциированных кишечных инфекциях чаще обнаружена способность к синтезу холероподобного термолабильного и термостабильного энтеротоксинов.
Выявлены различия серологического пейзажа Citrobacter spp., в зависимости от источника выделения. культур: 022 серогруппа: выделялась при патологии желудочно-кишечного тракта, ЗаЗвЗс - от больных урологического профиля в основном в составе микст-инфекций.
Представлена сравнительная характеристика данных об адгезивной,
гемолитической, антилизоцимной и антиинтерцидной, лецитиназной, ДНК-
азной активности Citrobacter spp, при моно- и ассоциированных инфекциях:
бактерии рода Citrobacter, выделенные в микст-инфекциях обладают способностью синтезировать высокоактивный термолабильный и термостабильный энтеротоксины, а-гемолизин, энтеро- и тиолактивируемый гемолизины, ферменты агрессии и способны к адгезии, что подтверждает их этиологическую роль при инфекционных процессах различной локализации.
Впервые у части штаммов, выделенных при кишечных инфекциях, обнаружена способность к синтезу энтерогемолизина, формирующего на кровяном агаре с 5% дефибринированной кровью барана зоны двойного лизиса и; в эксперименте морфологически вызывающего накопление геморрагической жидкости в петле тонкого кишечника кролика.
Практическая и теоретическая значимость. Обнаружение среди клинических штаммов Citrobacter spp. культур, характеризующихся наличием ряда факторов патогенности, свидетельствует об их возможной роли в этиологии инфекционных заболеваний человека.
Результаты исследования, освещающие биологические свойства бактерий рода Citrobacter, выделенных в монокультуре и при ассоциированных процессах внедрены в практические и лекционные курсы по микробиологии на кафедре микробиологии; Башкирского государственного медицинского университета.
Положения, выносимые на защиту:
Факторами вирулентности бактерий рода Citrobacterу выделенных при острых кишечных инфекциях являются термолабильные и термостабильные энтеротоксины.
Штаммы бактерий рода Citrobacter, изолированные в микст-инфекциях, чаще в сравнении с монокультурами обладают ДНК-азной, лецитиназной и гемолитическими активностями и проявляют четко выраженные персистентные свойства.
У бактерий рода Citrobacter генетической детерминантой, контролирующей адгезивность являются гены, входящие в состав хромосомы бактериальной клетки, а-гемолизина - плазмида массой 120
7 МД, термолабильной энтеротоксигенности - плазмида массой 60 МД.
Апробация работы. Материалы работы представлялись во Всероссийских научных конференциях: «Клинические перспективы в инфектологии» Санкт-Петербург 2001г., «Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке, взгляд в будущее» Санкт-Петербург, 2001г., «Актуальные аспекты природноочаговых болезней» г.Омск, 2001г., III Всероссийской конференции Российской Академии Естествознания «Гомеостаз и инфекционный процесс» г.Догомыс, 2002 г., «III Геллеровские чтения, посвященные памяти профессора Л.И. Геллера» г.Хабаровск, 2002 г., на IV Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» г.Оренбург, 2003 г., на научных конференциях Башкирского государственного медицинского университета (2000-2003 г.г.)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 10 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 18 рисунков. Список литературы включает 207 источников (65 отечественных и 142 зарубежных авторов).
Этиологическая роль бактерий рода Citrobacter
Название бактерий рода Citrobacter впервые предложено С. Werkman, G.Gillen (1932), а позже было подтверждено И.Е.Микекевичем (1948) благодаря; их способности утилизировать цитрат, и использовать его, как единственного источника углерода. Согласно IX Определителю Берги род Citrobacter входит в семейство Enterobacteriaceae и включает 3 вида: Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Citrobacter amalonaticus [77].
Геномный полиморфизм бактерий рода Citrobacter и разнородность биохимических признаков позволили Brenner D.J et al. предложить совершенно новую классификацию бактерий рода Citrobacter, где разделяются на следующие виды: Citrobacter freundii, Citrobacter koseri(Cdiversus), Citrobacter amalonaticus, Citrobacter farmeri, Citrobacter youngae, Citrobacter braakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter sedlakii [70, 78, 157], Citrobacter rodentium [111] и пока еще неназванные 2 вида: 10 и 11, хотя данная классификация не получила широкого применения.
Представители рода Citrobacter широко распространены в почве, в воде открытых водоемов, [21, 27, 37, 44, 55, 63], в окружающей среде [20, 31]. Некоторые исследователи считают их представителям естественной микрофлоры кишечника человека, т.к. часто обнаруживаются у практически здоровых людей [34,35,42,46, 54, 89,149,200].
Тем не менее, в последние годы участились сообщения, где авторы не сомневаются в этиологии развития гнойно-воспалительных, урологических и кишечных инфекций, вызванных исключительно бактериями рода Citrobacter и особенно C.freundii О-антигеннесущими серотипами (022, 03, 04, 08, 05, Об, 09, О10, 023, 024, 029, ОЗО) [16, 32, 47, 50,185, 198]. При этом данные ряда исследователей [49, 206] показывают, что по частоте встречаемости бактерии рода Citrobacter при различных инфекционных процессах составляет от 9,3% до 14,5%, от общего числа из всех выделенных условно-патогенных грамотрицательных возбудителей. По мнению же других авторов высеваемость бактерий рода Citrobacter при острых кишечных заболеваниях значительно выше и достигает 19,4-39,0% [5, 24, 27, 37,40,82,86,207].
Sedlak J. et Rische H. описали случай вспышки пищевой токсикоинфекции, вызванные бактериями рода Citrobacter, еще в первой половине XX века. Plots J. et al. у больных с пищевой токсикоинфекцией выделили культуры Citrobacter серотипов 8а, 1 с:8, а у реконвелесцентов обнаружили соответствующие агглютинины в титре 1:320. Описан случай вспышки; пищевой токсикоинфекции, вызванный исключительно токсигенной культурой C.freundii, источником которых явился растительный салат, удобрение для которых использовали навоз свиней [198].
Имеются многочисленные сведения о том, что бактерии рода Citrobacter могут вызывать заболевания мочеполовой системы [48, 57, 61, 88, 125, 198], а также являться причиной воспалительных процессов у гинекологических больных [81, 195]. Они часто выделяются также от больных с бронхитами и воспалительными процессами легких [108, 171, 206], при раневых инфекциях, аппендиците [29, 85, 151, 183], септическом состоянии [28, 72,90, 92, 164, 197, 199].
В последние годы особую актуальность приобретает внутрибольничная инфекция, вызываемая условно-патогенными грамотрицательными микроорганизмами. Так, по данным В.Г.Петровской с соавт.[43] внутрибольничная инфекция, вызываемая условно-патогенными микроорганизмами регистрируется у 4,5-18% госпитализированных больных и 3% из них погибает от осложнений. При этом дети и люди пожилого возраста представляют группы риска. На долю, так называемых условно-патогенных грамотрицательных бактерий, к которым относятся и бактерии рода Citrobacter, приходится 40% всех возбудителей внутрибольничных септициемий. Многочисленны случаи послеоперационных осложнений в виде перитонита [168, 183], абсцесса печени [71], перитонзилярного и ретрофоренгиального абсцессов [91,197].
Наряду с E.coli, P.mirabilis и другими возбудителями внутрибольничных инфекций, C.freundii обнаруживается на раневых поверхностях при ожогах[125,135], осложняя при этом заживление ран.
C.diversus вызывает спорадические и эпидемические вспышки менингитов [108,155, 168]. При этом одна третья часть заболевших погибает, у 75% реконвелесцентов наблюдается тяжелые неврологические осложнения, что свидетельствует о наличии определенных особенностей возбудителя, который проходит через гематоэнцефалический барьер макроорганизма [193, 195, 207]. Finn et al. [199] описали случай септицемии и менингита у новорожденного, вызванного исключительно C.diversus. При этом источником инфекции у новорожденного явилась мать, что, возможно, свидетельствует о внутриутробном заражении плода. Зачастую менингиты осложняются абсцессом мозга, и заканчиваются летально [87, 189].
В литературе имеется немало сообщений, где указывается на развитие септического шока, вызванными5 токсигенными и антибиотикорезистентными штаммами C.freundii [92, 164]. Описаны случаи обнаружения штаммов Citrobacter в составе микст из кишечника больных, страдающих дизбактериозом [60].
Таким образом, из кратко представленного обзора видно, что бактерии рода Citrobacter могут быть причиной развития гнойно-воспалительных, токсико-септических, урологических и кишечных заболеваний. Однако до настоящего времени многие стороны этиопатогенеза инфекционных процессов, вызванных бактериями рода Citrobacter, факторы их патогенности и механизмы патогенного действия для человека остаются еще не до конца выясненными, и требует своего решения.
Факторы патогенности бактерий рода Citrobacter
В основе любого инфекционного процесса лежат сложные взаимоотношения между микро- и макроорганизмом, в котором патоген, для преодоления защитных механизмов хозяина, использует все свои потенциальные возможности, называемые "факторами; патогенности". К разряду существенных патогенных факторов бактерий семейства Enterobacteriaceae многие исследователи относят адгезивную, цитотоксическую, гемолитические активности и продукцию различных ферментов и токсинов.
В экологической нише патоген, для уклонения от защитных механизмов макроорганизма, приобретает способность» к молекулярной мимикрии, продуцирует вещества подавляющие иммунный ответ, индуцирует "неэффективные" антитела, обходит действия комплемента и других бактерицидных субстанций хозяина [16, 60].
В системе взаимоотношений "хозяин-патоген" наиболее остро на сегодняшний день стоит вопрос, касающиеся условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ), к числу которых относятся и бактерий рода Citrobacter. Это связано с тем, что УПЭ являются постоянными составляющими экологической ниши различных эпитопов человека, но зачастую выделяются как этиологический агент в виде монокультуры, а также при ассоциированных гнойно-инфекционных процессах различной локализации, и что затрудняет дифференцировать их на предмет причастности, и особенно когда обнаруживаются в составе микст культуры.
Вопросы интерференции возбудителя с клеточными и гуморальными защитными механизмами хозяина, устойчивость микробов к факторам защиты макроорганизма и способности; к размножению in vivo у разных видов микробов могут определяться специфическими для возбудителя факторами, химическая природа которых у различных представителей Enterobacteriaceae хорошо изучена. Пусковым и наиболее важным моментом на начальном этапе развития инфекционного процесса является адгезия микроорганизмов [130, 144], которая осуществляется благодаря наличию специальных адгезинов [83, 107], входящих в состав фимбрий бактериальных клеток [130] или поверхностных структур клеточной стенки [35, 84, 114].
Наличие фимбрий у бактерий часто коррелирует с их способностью к адгезии. Молекула белка фимбрий состоит из нескольких участков, среди которых доминирует Fim А, а также присутствуют Fim G и Fim Н. Последний, как оказалось, ответственен за связывание Д-маннозы [107, 199]. Наличие фимбрий 1 типа отмечено у большинства представителей семейства Enterobacteriaceae [101,106, 114, 159], в том числе и у Citrobacter spp. [203].
В настоящее время, многие исследователи, отмечая важную роль фимбрий в адгезивной активности, не исключают значения других структурных компонентов бактериальной клетки, ферментов и продуктов жизнедеятельности в лиганд-рецепторном: взаимодействии между возбудителем и чувствительными клетками макроорганизма. Так, некоторые авторы относят поверхностный белок Citrobacter spp. к факторам, которые усиливают адсорбцию бактериальных клеток на клетках НЕр-2 [84].
Преодолев защитные механизмы хозяина, достигнув определенного популяционного уровня, параллельно синтезируя высоко специфические токсины или токсические вещества, возбудитель поражает восприимчивый организм, который в свою очередь реагирует на это развитием определенного симптомокомплекса инфекционной болезни.
Поскольку бактерии рода Citrobacter spp. и ряд представителей семейства Enterobacteriaceae обуславливают острые кишечные инфекции, урологические и гнойно-воспалительные заболевания, то особую актуальность приобретают исследования именно тех основных факторов патогенности, через которые осуществляется патогенез и связанные с ними все возможные клинические проявления инфекционной болезни. Согласно последним данным, факторы патогенности, а это в основном бактериальные токсины, подразделяются в соответствии с механизмом их действия, на чувствительные клетки хозяина следующим образом: - повреждающие клеточные мембраны; - ингибирующие белковый синтез; - активирующие пути метаболизма, контролируемые вторичными мессенджерами; - ингибирующие высвобождение нейромедиаторов; - активирующие иммунный ответ макроорганизма.
Многие бактериальные экзоферменты и экзотоксины (гиалуронидазы, коллагеназы и фосфолипазы) способны повреждать экстрацеллюлярные структуры; или плазматическую мембрану эукариотических клеток с помощью ферментативного гидролиза или в результате формирования пор. Эти повреждения могут вызвать не только прямой лизис клеток, но также способствовать распространению бактерий в макроорганизме. К представителям этой группы токсинов относятся: сс-токсин Clostridium perfringens,стрептокиназа Streptococcus pyogenes, [119, 138, 182]. Наиболее изученными в этом отношении у Citrobacter spp. является нейраминидаза и гиалуронидаза [42].
Порообразующие токсины и ферменты в соответствии со своим названием формируют трансмембранные поры и нарушают селективный вход и выход ионов через плазматическую мембрану. Эта группа токсинов включает RTX-токсины {repeats in toxins) грамотрицательных УПЭ -цитолизины, гемолизины, лейкотоксины, металлопротеазы, липазы [75, 122, 136, 192].
В научной литературе встречаются лишь единичные сообщения о продукции гемолизинов Citrobacter spp.[140,152, 159], где авторы указывают о нечастой встречаемости сс-гемолизина, тогда как продукция тиолзависимого гемолизина более характерна для них и составляет 79,0% случаев [54]. Мембранный белок у C.diversus с молекулярной массой 32 KD, выделенный при менингитах, обладает гемолитической активностью [133], которая, по мнению ряда авторов, является этиологическим маркером бактерий, обусловливающих менингиты, и возможно, также связан с данными биоварами Citrobacter spp.
По данным других авторов, ос-гемолизин представляет собой белок определенной молекулярной массы [16, 32]. Механизм лизиса эритроцитов а-гемолизином не расшифрован, однако доказано, что при постоянном увеличении концентрации эритроцитов, количество высвобождающегося гемоглобина увеличивается до определенного уровня, а потом выходит на плато, что свидетельствует о том, что гемолизин действует по принципу единичного удара [201].
Отмечено, что при образовании пор под действием гемолизина запускаются вторичные процессы, которые обусловливают развитие патологических последствий в тканях. Эти процессы включают активацию эндонуклеаз, увеличение экзоцитоза тромбоцитов, высвобождение цитокинов и медиаторов воспаления, а также высвобождение эйкозаноидов [184].
Синтез и экспрессия гемолизина сопряжена с наличием Ыу-детерминант как плазмидной, так и хромосомной локализации. Известно, что Ыу-детерминанта состоит из 4 цистронов: ЫуА, ЫуВ (Ва), ЫуС, hlyD(Bd), которые тесно взаимосвязаны между собой и отвечают за определенные механизмы в целом экспрессии, синтеза и секреции гемолизина. Методом молекулярного зондирования у C.diversus некоторые исследователи обнаружили аналогичные участки ЫуА и ЫуВ детерминант с S.typhimurium [97], тогда как Ыу-детерминанта гемолитически активных штаммов P.vulgaris и M.morganii [201], S.marcescens [173] не были обнаружены, что может указывать на неоднородность генов, кодирующих синтез гемолизинов, либо на иную природу гемолитической способности изученных культур.
Данные литературы о гемолитической активности бактерий рода Citrobacter продолжают оставаться немногочисленными и противоречивыми. Вместе с тем выявлено, что их гемолизины вызывают деструктивные изменения монослоя культуры клеток [47], включают механизмы апоптоза в макрофагах и культурах клеток J744 [121], развитие геморрагической пневмонии у мышей [50], оказывают цитотоксическое действие [161].
Бактериальные токсины, объединенные во вторую группу, поражают клетки-мишени в результате подавления синтеза белков.. Субстратами для этих токсинов являются фактор элонгации биосинтеза и рибосомальная РНК. Так, дифтерийный токсин и экзотоксин A Pseudomonas spp. вызывают АДФ-рибозилирование фактора элонгации 2 (EF2) [93, 202], нарушая синтез белка. S. dysenteriae серотипа 1 и некоторые другие клинически значимые бактерии, например Stx-продуцирующие Е. coli (STEC) [160], вырабатывают Stx-токсины (веротоксины). Stx-токсины инактивируют рибосомальную РНК, нарушая ее взаимодействие с факторами элонгации [105, 132, 161, 171, 174, 179]. Подавление белкового синтеза данной группой токсинов приводит в конечном итоге к гибели клетки-мишени.
Сравнительная морфологическая и культуральная характеристика бактерий рода Citrobacter, выделенных при инфекционных процессах в составе микст- и монокультуры
В качестве объекта исследований использованы 77 клинических штаммов бактерий рода Citrobacter, 45 из которых были выделены при ассоциированных бактериальных- микст-инфекциях, 32 — в виде монокультуры. Штаммы цитробактер, выделенные при микст-культуре были ассоциированы совместно с E.coli 13 случаев, со Staphylococcus spp.— 9, Pseudomonas aeruginosa — 7, Proteus spp.- 6, Enterobacter spp. - 5, с другими штаммами - 5. Citrobacter, выделенные в монокультуре в основном изолировались при острых кишечных заболеваниях, лишь в 4-х случаях — при гнойно-воспалительном процессе.. В качестве эталонов мы в своих исследованиях использовали 3 штамма Citrobacter, депонированные в ГИСК им Л.А.Тарасевича и 2 штамма любезно предоставленные профессором В.М.Бондаренко (НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи)..
Из 77 клинических и 5 эталонных штаммов бактерий рода Citrobacter чистые культуры при первичном посеве на плотные питательные среды 70 штаммов давали характерный рост в виде изолированных колоний. На среде Эндо лактозоположительные варианты Citrobacter spp. образовывали колонии, окрашенные в розовый или красный цвет, у лактозоотрицательных вариантов колонии были бесцветными или сероватыми с розовым оттенком. Штаммы, выделенные при микст инфекциях и в монокультуре не отличались друг от друга разлагать лактозу. На висмут-сульфит агаре давали обильный рост, образуя светло-зеленые, коричневые и черные колонии без окрашивания участка среды под колонией.
На жидких питательных средах через 2 суток бактерии рода Citrobacter давали помутнение с образованием слабого осадка на дне пробирки, а также нежной пленки на поверхности среды. Бактериоскопия в раздавленной и висячей капле показала, что клетки обладают поступательными и маятникообразными движениями вне зависимости от источника выделения. При посеве на полужидкий агар бактерии диффундировали в среду через 12-24 часов при температуре 37 С. На окрашенных по Граму препаратах, бактериальные клетки представляли собой мелкие грамотрицательные палочки.
В настоящее время постепенная происходящая смена микробиологической парадигмы - переход от представлений об одноклеточности микроорганизмов к представлению о микробных колониях, как целостных "сверхорганизмах" - находит своё отражение в нарастающем интересе к форме, рисунку, макро- и микроструктуре бактериальных колоний, что особенно проявляется у бактерий существующих в различных эпитопах человека в виде ассоциации с другими представителями грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Электронно-микроскопические исследования "колоний" демонстрируют способность к клеточной дифференцировке и многоклеточной организации. Эта способность, возможно, имеется у бактерий в их природных местообитаниях, где они в основном существуют в виде био-плёнок, цепочек, матов и "микроколоний" [26]. Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в её состав клеток [30, 94]. Вне зависимости от источника выделения колонии бактерий рода Citrobacter как бы сложены из нескольких различных "тканей"-клеточных кластеров (рис.4.1). В качестве типичных кластеров рассматриваются: 1) активно делящиеся; 2) покоящиеся; 3) спонтанно аутолизирующиеся клетки.
Имеется как вертикальная слоистость колонии, так и наличие в ней горизонтально разделённых зон (секторных и концентрических). Так и в колониях Citrobacter обнаружены три слоя: 1) нижний окрашенный 2) средний, в основном светлый, по-видимому, сложенный из нежизнеспособных клеток (часто неправильной формы) 3) верхний окрашенный, в котором хорошо заметна дальнейшая дифференциация на два слоя - более нижний тонкий (толщиной 1-3 клеточных слоя), с чёткой границей и особенно ярко окрашенный и толстый слой, содержащий отдельные неокрашенные клетки. Эти данные свидетельствуют о том, что у бактерий рода Citrobacter имеются определенные сходства с ранее изученными колониями УПЭ [30, 94, 176].
Помимо вертикальной слоистости, колониям микроорганизмов на плотных средах свойственны также секторные и концентрические зоны. Сектора соответствуют генетически различающимся клонам, что находит своё отражение в их различной консистенции, форме, скорости роста, активности ферментов и др. Наглядный пример - фазовая диссоциация бактерий на R-, S- и М-формы, различающиеся толщиной клеточной стенки, наличием или отсутствием микрокапсулы, характеристиками фибриллярного (R- и S-варианты) или везикулярно-тубулярного (М-вариант) межклеточного матрикса и др. При получении изогенной пары Citrobacter длительное культивирование штаммов в неблагоприятных условия, содержащих 2-5% Sds, способствовало переходу S-формі колоний в R-формы. Фазовые диссоцианты обусловливают различие в архитектонике секторов колоний. Что касается R-варианта, то в соответствующем секторе клетки нижних слоев располагаются перпендикулярно или под углом к питательной среде, клетки верхних слоев - радиально и параллельно к поверхности агара.
Концентрические зоны отражают стадии "онтогенеза" бактериальных клеток - они соответствуют различным этапам программ индивидуального развития клеток. Отмечено, что при выращивании бактерий на богатых питательных средах популяции обычно относительно однородны по формам и размерам, имеются в колониях лишь возрастные различия: непосредственно перед делением; клетки имеют большие размеры, чем только что поделившиеся — дочерние. Клетки, выращенные на бедных полусинтетических средах, обладали выраженным полиморфизмом.
Биохимический и серологический пейзаж Citrobacter spp
При определении групповой, родовой и видовой принадлежности учитывали ферментативную активность штаммов Citrobacter по способности утилизировать цитрат в среде Симонса, образование газа в глюкозе, способность ферментировать маннит, рамнозу, сорбит, арабинозу, ксилозу и мальтозу. Citrobacter не обладали ферментами; лизиндекарбоксилазой, фенилаланиндезаминазой и желатиназой.
Мочевину гидролизовали слабо и медленно. Давали положительную реакцию с метиловым красным и были отрицательны в реакции Фогеса-Проскауэра, а также обладали, в зависимости от видовой принадлежности, способностью образовывать сероводород и индол (таб.4.1).
По биохимическим признакам клинические штаммы Citrobacter по видовому составу не отличались от источника выделения, 51 были отнесены к C.freundii, 17 к C.diversus и 7 к C.amalonaticus.,
При помощи поливалентных и типовых О-сывороток из 77 штаммов было типировано 66, у остальных не удалось установить серологическую группу по О-антигену. При этом наибольшее количество штаммов по О-антигену были отнесены серогруппе 022 (12 штаммов), 8 і штаммов к ЗаЗвЗс, по 3 штамма к серогруппам Іаівіс; 2а1в; 4а4в; 8а8в; 7а7вЗв1с;, 21а21в;по2-64в5в; 8а1с; 8а8с; по одному штамма - 12а12в; 7а7сЗв1с; 15; 16; 24;.7; 2; 32; 33; 37а37в37с; 38; 30; 28 1с; 10а9в; 17; 12а12с; 19; 20; 41; 40а40в; 35; 42.
В связи с отсутствием тест-системы по определению Н-антигена, культуры Citrobacter на Н серовары не тестировались.
Культуры, относящиеся к 22 серогруппе, выделялись при патологии. желудочно-кишечного тракта и гнойно-воспалительных процессах, ЗаЗвЗс -от больных урологического профиля. Серогруппа 022 бактерий рода Citrobacter в основном выделялся при смешанных бактериальных инфекциях.
Представленные данные показывают, что от больных,, страдающих гнойно-воспалительными, урологическими и кишечными инфекциями, наиболее часто выделяются і штаммы, принадлежащие по биохимическим свойствам к C.freundii, реже - C.diversus и C.amalonaticus. По О-антигенным свойствам преобладали серогруппы 22; ЗаЗвЗс; Іаівіс;. 2а1в; 4а4в; 8а8в; 7а7вЗв1с; 21а21в, что указывает на эпидемиологическую значимость указанных видов и серогрупп в развитии инфекционной патологии человека различной локализации. 022 серогруппа является маркером ассоциации Citrobacter, выделенных при ассоциированных бактериальных инфекциях.
Как известно, организм хозяина - это среда, в которой бактерии осуществляют свои обменные процессы. Рост и размножение бактерий могут быть подавлены не только действием разнообразных защитных механизмов макроорганизма, но и определенными биохимическими факторами, которые подавляют или задерживают его существование в условиях живого организма. К таким факторам можно отнести дефицит некоторых метаболитов, которые необходимы микроорганизмам для нормальной жизнедеятельности. К тому же потребность определенных веществ для роста и размножения может быть видовым или родовым признаком. Частое обнаружение микроорганизмов в ассоциации может быть обусловлено именно ауксотрофностью тех и других, которые могут существовать в биотопах человека только совместно. Исходя из вышеуказанного, мы сочли необходимым изучение ауксо- и прототрофности клинических штаммов Citrobacter. Для идентификации выделенных штаммов по их потребностям в тех или иных факторах роста использовали минимальную среду на агар-агаре с аминокислотами и витаминами.
В начале мы изучали прототрофность, затем, используя набор аминокислот изучали ауксотрофность штаммов Citrobacter (гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин), а также витаминов В,, В2, В5, В6, В9, В)2. В качестве источника углерода использовали глюкозу.
Анализ полученных данных показывает, что из 77 клинических штаммов Citrobacter 41 оказались прототрофами, а 36 ауксотрофами. Из ауксотрофов 32 штаммов были выделены со смешанной флорой и лишь 4 штамма - в монокультуре (Рис.4.4).
Большинство ауксотрофов были среди штаммов, выделенных при смешанных бактериальных инфекциях. Указанный признак клинических штаммов Citrobacter, на наш взгляд, характеризует необходимость существования бактериальных клеток в эпитопах человека, именно в ассоциации с другими микроорганизмами, продукты жизнедеятельности, которых являются субстратом для существования ауксотрофов.
Выявление ауксотрофности бактериальных клеток к тем или иным сустратам показало, что штаммы проявляли потребность не к одной определенной аминокислоте или витамину, а к нескольким. Причем, добавление в минимальную среду необходимой для роста аминокислоты или витамина проявлялось в виде роста ауксотрофов (Таб. 4.2).
