Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. С-парадокс: две стороны одной загадки 12
1.2. Основные гипотезы о биологической роли избыточной ДНК 14
1.3. Рекомбинация ДНК 15
1.3.1. Гомологичная рекомбинация 16
1.3.2. Негомологичная, или незаконная рекомбинация 17
1.4. Диминуция хроматина как возможный ключ к решению С-
парадокса 21
1.4.1. Реорганизация генома при созревании вегетативных ядер (макронуклеусов) у инфузорий 22
1.4.2. Диминуция хроматина у нематод 28
1.4.3. Диминуция хроматина у циклопов 35
Заключение по обзору литературы 41
Глава II Материалы и методы 44
2.1. Микродиссекция гранул и создание библиотек 45
2.2. Мечение ДНК и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 47
2.3. Подготовка компетентных клеток Е. coli 48
2.4. Трансформация плазмидной ДНК в клетки Е. coli 49
2.5. Выделение нуклеиновых кислот 49
2.5.1. Выделение геномной ДНК циклопов 49
2.5.2. Быстрое выделение микроколичеств плазмидной ДНК для скрининга большого количества трансформантов 50
2.5.3. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса 50
2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях 51
2.7. Элюция ДНК из агарозного геля 51
2.8. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 52
2.9. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 52
2.10. Молекулярное клонирование 54
2.15. Определение последовательности нуклеотидов ДНК методом Сэнгера 54
2.16. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК 55
Глава III. Результаты 56
3.1. Изучение структуры элиминированной ДНК С. kolensis московской популяции 56
3.1.1. Получение диминуционной ДНК циклопа 56
3.1.2. Общая характеристика последовательностей эДНК 58
3.1.3. Семейства повторяющихся последовательностей 59
3.1.4. Анализ выборки S1 64
3.2. Создание клонотеки постдиминуционной ДНК С. kolensis московской популяции 70
3.2.1. Общая характеристика последовательностей постдиминуционной ДНК 71
3.2.2. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей постдиминуционной ДНК 72
3.3. Сравнительный анализ ДХ у С. kolensis московской и байкальской популяций 79
3.4. Присутствие фрагментов эДНК в геноме С. kolensis байкальской популяции 81
Глава IV. Обсуждение 88
Выводы. 101
Список литературы
- С-парадокс: две стороны одной загадки
- Микродиссекция гранул и создание библиотек
- Быстрое выделение микроколичеств плазмидной ДНК для скрининга большого количества трансформантов
- Изучение структуры элиминированной ДНК С. kolensis московской популяции
Введение к работе
Результаты недавних проектов по секвенированию геномов различных видов животных и растений, а также генома человека, подтвердили тот факт, что большую часть генома эукариот составляют некодирующие последовательности ДНК. Однако данное открытие не только не разрешило загадку парадокса размера генома эукариот, так называемый С-парадокс, но поставило перед учеными новые вопросы о функциональной необходимости и роли данной ДНК.
В настоящее время в качестве попытки разрешения этой загадки было предложено одновременно два направления: первое - это сравнение ортологических последовательностей ДНК хорошо изученных и довольно близких видов, второе, развиваемое в настоящей работе, - изучение фрагментов ДНК, элиминируемых в процессе диминуции хроматина (ДХ). Данное явление, хотя и было открыто около 120 лет тому назад, до сих пор слабо изучено методами молекулярной генетики у многоклеточных животных. ДХ является запрограммированным в онтогенезе процессом, в ходе которого происходит необратимая потеря части генетического материала из генома соматических клеток. В связи с этим, ДХ может быть рассмотрена как биологическое явление, при котором клеточный механизм как бы освобождает геномы соматических клеток от избытка ДНК.
В качестве объекта для изучения ДХ и, в частности, структуры элиминируемой ДНК (эДНК) нами был выбран вид Cyclops kolensis из московской популяции. Представители семейства Cyclopoidae являются удобными, хотя и довольно трудными объектами. Главной особенностью, определившей перспективность Cyclopoidae, является элиминация огромной
% ф
доли генома в клетках зародышевого пути (у С. kolensis — до 94%) при сохранении исходного числа хромосом (Гришанин и др., 1996). Кроме того,
упаковка эДНК в специфические гранулы позволяет экстрагировать образцы данной ДНК для изучения ее молекулярной структуры.
Немецкая исследовательница Сигрид Берман подробно изучила методами цитогенетики различные виды рода Cyclops ещё во второй половине прошлого столетия. Она показала, что количество элиминируемой ДНК, а также её расположение в ядрах делящихся клеток видоспецифичны (Beermann, 1977). Однако в литературе встречается достаточно много противоречий в характеристике процесса ДХ даже у циклопов, отнесенных к одному и тому же виду. Это может быть связано с ошибкой в идентификации видов по морфологическим признакам, которая, в частности, у представителей копепод представляет, как правило, серьезные трудности. Поэтому изучение картины процесса диминуции у С. kolensis из байкальской популяции является не только интересным и важным, но и позволяет провести сравнительный анализ двух географически изолированных популяций: московской и байкальской. Это позволило бы ответить и на вопрос, может ли ДХ быть использована в качестве одного из признаков для идентификации видов.
В 1998 г. А.П. Акифьевым было выдвинуто предположение о том, что избыточная ДНК создает уникальный молекулярный портрет генома вида и, таким образом, служит фактором генетической изоляции, препятствуя синапсису гомеологичных хромосом в первом поколении межвидовых гибридов (если таковые могут возникать) (Акифьев и др., 1998). Сравнение геномов С. kolensis из московской и байкальской популяций (в первую очередь, размеров тотального и постдиминуционного генома, временной картины протекания процесса диминуции; гомологии последовательностей эДНК) может дать информацию, свидетельствующую в пользу данной гипотезы, либо ее опровергающую.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было изучение молекулярной структуры последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе диминуции у Cyclops kolensis (Crustacea: Copepoda), и их сравнительный анализ у представителей двух географически изолированных популяций (московской и байкальской). В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Изучить структуру последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе
диминуции у С. kolensis из московской популяции:
а) с помощью метода микродиссекции собрать материал гранул,
содержащих эДНК;
б) клонировать и определить первичную структуру ДНК,
экстрагированной из диминуционных гранул; провести компьютерный
анализ структуры последовательностей эДНК. -
2. Провести сравнительный анализ структуры последовательностей ДНК
постдиминуционного генома С. kolensis из московской популяции и '
эДНК:
а) создать клонотеку постдиминуционной ДНК генома С. kolensis из
московской популяции;
б) изучить структуру полученных последовательностей ДНК;
3. Оценить консерватизм структуры генома С. kolensis из двух
географически изолированных популяций: московской и байкальской:
а) исследовать картину ДХ у С. kolensis из байкальской популяции,
определить стадию деления, во время которой проходит ДХ,
продолжительность интерфазы, предшествующей процессу диминуции;
б) определить, насколько последовательности эДНК, полученные из
диминуционных гранул у С. kolensis из московской популяции, являются
консервативными: показать с помощью ПЦР анализа присутствие (или
отсутствие) данных последовательностей в додиминуционном геноме С.
kolensis из байкальской популяции и сравнить их нуклеотидный состав.
4. Выявить, удаляются ли полностью во время ДХ последовательности ДНК, полученные из диминуционных гранул.
Научная новизна
Впервые получены последовательности ДНК, элиминируемые из хромосом презумптивных соматических клеток Cyclops kolensis (Crustacea: Copepoda) в процессе диминуции хроматина. Проведен компьютерный анализ и выявлены закономерности в организации данных последовательностей нуклеотидов, свидетельствующие о высокой степени упорядоченности в организации ДНК, ограниченной клетками зародышевого пути.
Впервые проведено сравнительное изучение последовательностей эДНК геномов двух географически изолированных популяций С. kolensis: московской и байкальской, обнаружена высокая консервативность данных последовательностей.
Показано, что ДХ может использоваться в качестве одного из важных признаков при определении видов рода Cyclops (Cyclopoidae), что снимает ряд противоречий между литературными данными относительно корректности идентификации видов Практическая ценность
Впервые с помощью микродиссекции получена библиотека фрагментов эДНК Cyclops kolensis. Определена первичная структура ДНК, экстрагированной из диминуционных гранул, и проведен компьютерный анализ структуры данной ДНК. Последовательности эДНК являются АТ-богатыми и насыщены повторами. Показана мозаичная структура многих повторов и высокая степень гомологии внутри отдельных семейств повторов.
Впервые изучена картина ДХ у С. kolensis из байкальской популяции. ДХ происходит во время 4-го деления дробления с сохранением числа хромосом
(2п=22), длительность преддиминуционной интерфазы составляет 9-10 часов, как и у С. kolensis из московской популяции.
Показано, что, во-первых, 20 из 21 проанализированного фрагмента, полученного из диминуционных гранул С. kolensis из московской популяции, присутствуют в геноме С. kolensis из байкальской популяции, во-вторых, данные последовательности эДНК не полностью элиминируются во время ДХ и присутствуют в постдиминуционном геноме циклопов из обеих популяций. Изучаемые фрагменты эДНК являются консервативными (90-99% гомологии). Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на международных конференциях в докладах и стендовых сообщениях: на III Международной конференции «Проблема вида и видообразования» (Тбмск, 2005), 9th International Conference on Copepoda (Hammamet, Tunisia, 2005), 7th International Conference on Drosophila Heterochromatin (Gubbio, Italy, 2005), 4-ой Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2005). Объем работы
Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, разделов Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и списка цитируемой литературы, в который входит 147 ссылок. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 16 рисунков. Публикации по теме диссертации
Degtyarev S., Boykova Т., Grishanin A., Belyakin S., Rubtsov N., Karamysheva Т., Makarevich G., Akifyev A., and Zhimulev'I. The molecular structure of the DNA fragments eliminated during chromatin diminution in Cyclops kolensis// Genome Research. 2004. V. 14. N. 11. P. 2287-2294.
Акифьев А.П., Бо її ко ва Т.В., Гришанин А.К., Зоткевич Е.А., Жимулев И.Ф. Диминуция хроматина у циклопов как модель эволюционного
преобразования геномов// Эволюционная биология. Томск. 2005. Т. 3. С. 133-144.
Boykova Т., Grishanin A., Shekhovtsov S., Melnik N., Naumova E., Akifyev A., Zhimulev I. Chromatin diminution in Cyclops kolensisll A 9th International Conference on Copepoda. 2005. P. 206.
Boykova Т., Zotkevich E., Grishanin A., Melnik N., Naumova E., Akifyev A., Zhimulev I. On the chromatin diminution in Cyclops// A 7th International Conference on Drosophila Heterochromatin. 2005. P. 84.
Зоткевич E.A., Бойкова T.B., Гришанин А.К., Акифьев А.П., Жимулёв И.Ф. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей элиминируемой ДНК Cyclops kolensis и геномной ДНК Cyclops insignisll Вестник Томского государственного университета. 2005. №4. С. 47.
Гришанин А.К., Зоткевич Е.А., Бойкова Т.В., Наумова Е.Ю., Мельник Н.Г., Акифьев А.П., Жимулёв И.Ф. Диминуция хроматина как
« ф
фактор генетической изоляции видов рода Cyclops// Материалы 4-ой Верещагинской Байкальской конференции. 2005. С. 60.
Гришанин А.К., Шеховцов СВ., Бойкова Т.В., Акифьев А.П., Жимулев И.Ф. Проблема диминуции хроматина на рубеже XX и XXI веков// Цитология. 2006. (в печати).
А.К. Гришанин, Т.В. Бойкова, Т.Л. Маршак, Н.Г. Мельник, Е.Ю. Наумова, М.В. Загоскин, А.П. Акифьев, И.Ф. Жимулев Консерватизм структуры генома в двух популяциях Cyclops kolensis (Copepoda, Crustacea), обитающих в прудах г. Москва и о. Байкал// ДАН. 2006. Т. 408. №5. (в печати).
Вклад автора
Основные результаты получены автором ' самостоятельно. Микродиссекция гранул эДНК была проведена совместно с д.б.н. Рубцовым Н.Б. (ИЦиГ, СО РАН) и к.б.н. Гришаниным А.К. (ИОГен, РАН). Работа по
секвенированию последовательностей эДНК была проведена автором в лаборатории проф. М. Эшбернера (Университет Кэмбриджа, Англия). Благодарности
Автор выражает глубокую признательность член-корр. РАН Жимулеву И.Ф. и профессору Акифьеву А.П. за помощь в работе и обсуждении результатов; д.б.н. Рубцову Н.Б. и к.б.н. Карамышевой Т.В. за проведение микродиссекции; проф. М. Эшбернеру за предоставленную возможность провести секвенирование клонов на базе его лаборатории. Особая благодарность директору Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск) академику РАН Грачеву М.А. и сотрудникам данного .института к.б.н. Мельник Н.Г. и Наумовой Е.Ю. за предоставленную возможность работать и помощь в сборе материала, за взаимное сотрудничество и обучение идентификации некоторых видов рода Cyclops, а также сотрудникам института Общей генетики РАН (г. Москва) к.б.н. Гришанину А.К. и Кетовой Т.А. Автор благодарен всем без исключения сотрудникам лаборатории молекулярной цитогенетики (в особенности к.б.н. Белякину С.Н. и аспирантке Зоткевич Е.А.) за их постоянную помощь.
Список использованных сокращений
ДХ - диминуция хроматина
РХР - районы хромосомных разрывов
эДНК - элиминируемая ДНК
SSA - от англ. single-strand annealing
SSB - от англ. single strand binding
Ma - макронуклеус
Ми - микронуклеус
IES - от англ. internal eliminated sequences
MDS - от англ. macronuclear destined sequences
CkD - Cyclops kolensis Drops
glCkM - germ line Cyclops kolensis Moscow
glCkB - germ line Cyclops kolensis Baikal
sCkM - somatic Cyclops kolensis Moscow
sCkB - somatic Cyclops kolensis Baikal
С-парадокс: две стороны одной загадки
Главным отличием эукариот от прокариот является огромная избыточность генома. Проблема парадокса размера генома эукариот, или С-парадокс, существует в генетике уже более 50-ти лет.
1. В 1951 г. Мирский и Рис впервые показали, что нет прямой зависимости между сложностью организации вида животных и количеством генетического материала, которым он обладает (Mirsky, Ris, 1951). Например, у некоторых амеб геном в 200 раз превышает геном человека (Петров, 2000), а у лилии, саламандры, некоторых двоякодышащих рыб он на порядок больше, чем у человека (рис. 1).
2. Вторая сторона С-парадокса заключается в различии размеров геномов близких видов, часто не обладающих по отношению друг к другу какими-либо адаптивными преимуществами. Классический пример тому -два вида вики Viciafaba и V. sativa. Геном первого вида в 5 раз превышает по размерам геном второго, причем эта разница не обусловлена полиплоидией (см. Акифьев и др., 2002). Такая же ситуация касается размеров геномов у Drosophila melanogaster и D. virilis (Moriyama et ah, 1998).
Геном эукариот устроен по типу интерсперсии уникальных и повторяющихся последовательностей. Например, у ксенопуса, мыши и человека короткие повторы длиной около 300 п.н. перемежаются с уникальными последовательностями длиной 1500 п.н., а у D. melanogaster наблюдается чередование повторов, достигающих 5000 п.н., с уникальными последовательностями, распространяющимися в длину более чем на 10.000 п.н.
В скобках указано число исследованных видов для каждой из групп. Среднее значение С-параметра обозначено вертикальной палочкой внутри серых прямоугольников; начало и конец прямоугольника показывают максимальное и минимальное значения внутри каждой группы, (из: Gregory, 2005).
Поскольку большинство различий в размере геномов у эукариотических организмов связано с некодирующей ДНК, то другой проблемой, тесно связанной с С-парадоксом, является изучение молекулярной структуры данной ДНК и поиск ее функциональной роли.
Несмотря на результаты недавних проектов по секвенированию геномов человека, а также различных видов животных и растений, ответы на данные вопросы не были получены.
На эту тему высказано множество гипотез. В лервых из них фактически отрицалось наличие у такой ДНК неизвестных функций. Гипотеза Х.-Г. Кэллана (Callan, 1967) постулировала, что каждый ген состоит из серии тандемных повторов, которые для устранения мутационной дивергенции периодически проверяются по одной какой-то копии. Сам Х.-Г. Кэллан в одной из последних своих работ отмечал, что его гипотеза не выдержала критики со стороны молекулярных биологов, установивших, что, за редким исключением, гены эукариот представлены уникальными последовательностями (Callan, 1986). Некоторые авторы (Britten, Davidson, 1973) отстаивали идею о регуляторной функции избыточной ДНК, полагая, что генные локусы эукариот могут быть организованы в опероноподобные структуры (Георгиев, 1970). Гипотезу, не похожую ни на одну из упомянутых, предложил шведский биолог Я.-Е. Эдстрем. По его мнению, избыточная ДНК представляет собой содержимое гипотетического «эволюционного котла», в котором созревают новые структурные гены и новые регуляторные последовательности. Об этом говорил также в 20-е годы русский генетик А.С. Серебровский (см. Акифьев, 2004). В 80-е годы наступил период концепции У.-Ф. Дулитла и К. Сапьенсы (Doolittle, Sapienza, 1980; Orgel et al, 1980; Дулитл, 1986), рассматривающих избыточную ДНК как эгоистическую, иногда эту ДНК называют «мусорной». Однако, геномный «мусор» существует, по-видимому, столько же, сколько существует вид. Более того, в гомологичных хромосомах «мусор» должен быть сходным, чтобы не препятствовать их синапсису в мейозе, иначе гибридам придется расплачиваться стерильностью. Это обстоятельство налагает сильные ограничения на мутационную дивергенцию «мусорной» ДНК (см. Акифьев, 2004). Гипотеза Т. Кавалье-Смита (Cavalier-Smith, 1978) приписывала избыточной ДНК адаптивные функции. Автор и сторонники этой идеи пытаются связать такие показатели генома и организма, как размер генома, объем клеточного ядра и клетки, скорость репликации и, следовательно, продолжительность митотического цикла и мейоза, со скоростью развития организма, уровнем его метаболизма. В одной из последних своих работ Т. Кавалье-Смит, продолжая сравнительный анализ размера генома с объемом ядра и клетки, настаивает, что проблема С-парадокса, на самом деле, уже решена, если мы примем положение, что избыточная ДНК выполняет структурную роль и составляет, так называемый «скелет» или «каркас» ядра (Cavalier-Smith, 2005).
Микродиссекция гранул и создание библиотек
Мечение ДНК проводили в дополнительных 15 циклах ПЦР с 2 мкл наработанного продукта. 20 мкл реакции содержали 0,4 ед. акт. AmpliTaq полимеразы (Perkin Elmer) с подходящим буфером, 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 160 мкМ dTTP и 40 мкМ biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim), и 20 пмоль праймера MW6 (Telenius et al, 1992).
Флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) и детекцию сигнала (авидин-FITS/биотинилированный антиавидин/авидин-FITS) проводили по стандартным методикам (Karamysheva et al, 2001; Lichter et al, 1988). Препараты, предназначенные для FISH, предварительно инкубировали 1 час при 37С в растворе РНКазы А (0,1 мг/мл) в 2xSSC с последующей дегитратацией и фиксацией в 1% формальдегиде в фосфатном буфере и 50 мМ MgCb в течение 10 минут при комнатной температуре. Цитологические препараты денатурировали при 70С в 2xSSC в течение 2 минут. Гибридизацию проводили без супрессии повторенных последовательностей. После гибридизации in situ цитологические препараты окрашивали DAPI (4, 6-diamidino-2-phenyl-indole). Результаты FISH анализировали с помощью люминисцентного микроскопа AXIOSKOP 2 ("Zeiss", ФРГ); для регистрации и обработки микроизображений использовали CCD-камеру, комплекты фильтров и программное обеспечение "ISIS3" фирмы METASYSTEMS GmbH (ФРГ).
Ночную культуру клеток вносили в колбу со 100 мл 2xLB (на 1 литр 2xLB: дрожжевой экстракт - 10 г, триптон - 20 г, NaCl - 20 г) до плотности, не превосходящей 0,1 оптической единицы при длине волны Х,=600 нм (Аеоо ОД). Наращивали культуру при +30С до А6оо=0,95, после чего клеточную суспензию охлаждали 2 часа на льду и центрифугировали при 5x103 об/мин 10 минут при температуре +2С. Супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в 50 мл буфера С: 100 мМ СаС12, 70 мМ МпС12, 40 мМ CH3COONa рН=5.5, через 30 минут инкубации на льду суспензию центрифугировали при тех же условиях, что и выше. После удаления супернатанта осадок на льду суспендировали в 5 мл буфера С с 15% глицерином и фасовали по 200 мкл в пробирки Эппендорф, предварительно охлажденные до -20С, погружали в жидкий азот и хранили при -70С.
Метод 2. Обработка клеток Е. coli для электропорации Клетки выращивали в двух колбах по 250 мл среды LB при комнатной температуре до оптической плотности D60o=0,45. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, 4С и промывали суспендированием с последующим центрифугированием последовательно в 200 мл, 100 мл, 50 мл воды и 20 мл 10% раствора глицерина при 0-4С. После этого клетки суспендировали в 1200 мкл ледяного раствора GYT (10% глицерин, 0,125% дрожжевой экстракт, 0,25% бактопептон), расфасовывали по 40 мкл и замораживали при -70С.
К 100 мкл компетентных клеток добавляли 50 мкл раствора плазмидной ДНК в буфере ТЕ (10 мМ Tris-HCl рН=8.0, 1 мМ EDTA рН=8.0), содержащего не более 50 нг ДНК. После 30 минут инкубации на льду проводили «тепловой шок» суспензии клеток - 5 минут при 37С (или 1,5 минуты при 42С), затем клетки помещали на 5-Ю минут в лед и добавляли 1 мл LB. После 1,5-часовой инкубации при 37С производили рассев суспензии на чашки с соответствующей селективной средой. Если не оговорено отдельно, концентрации использованных антибиотиков и реагентов в жидких и твердых средах были следующими: ампициллин - 100 мкг/мл; тетрациклин - 13 мкг/мл; канамицин - 50 мкг/мл; стрептомицин - 25 мкг/мл; хлорамфеникол - 30 мкг/мл, X-GAL - 50 мкг/мл; IPTG - 500 мкМ.
Электропорация
К 40 мкл «электро-компетентных» клеток добавляли не более 50-100 нг ДНК в объеме 1-2 мкл, суспензию осторожно перемешивали и переносили в охлажденную заранее до 0-4С кювету для электропорации. Электропорацию проводили на мультипораторе Eppendorf (U=17000 В,х=4-5 мс). Затем добавляли 1 мл SOC (2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgS04, 20 мМ глюкоза), прогретого до 42С, инкубировали при 37С в течение 1 часа и высевали на селективную среду.
Быстрое выделение микроколичеств плазмидной ДНК для скрининга большого количества трансформантов
Материал каждой колонии осторожно переносили петлей с чашки в отдельную пробирку Эппендорф с 12 мкл 10 мМ раствора ЭДТА, суспендировали, и добавляли равный объем 2 х cracking buffer: NaOH - 0,2 N, SDS - 0,5%, сахароза - 20%. После перемешивания образцы прогревали в течение 5 минут при температуре +70С и затем охлаждали до комнатной температуры, добавляли 1 мкл 2 М КС1 и 1 мкл буфера нанесения, состава: 50% глицерин, 0.05% бромфенолового синего и 0,05% ксиленцианола. Пробирки с образцами инкубировали на льду 3-5 минут, затем центрифугировали 2-3 минуты на центрифуге "Эппендорф" при 12000 об./мин. Супернатанты наносили на 1% агарозный гель (см. описание ниже), "вгоняли" образцы при напряжении источника 30-50 В, и затем электрофорез вели при 70 В.
Выросшую на ампициллиновой чашке колонию переносили в колбу с 3 мл «. . » среды LB с ампициллином и выращивали в течение ночи на качалке при 37С. 2мл среды с клетками центрифугировали 1 минуту при 12000 об/мин при 4С. Осадок суспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (50 мМ глюкоза, 25 мМ
Трис-НСІ, pH=8.0; 10 мМ ЭДТА) и инкубировали при комнатной температуре. Затем добавляли 400 мкл денатурирующего буфера (0,2 М NaOH; 1% SDS) и инкубировали 5 минут при 0С. Далее добавляли предварительно охлажденный 300 мкл 7,5 М раствор Nt Ac и инкубировали 5 минут при 0С. Центрифугировали 5 минут при 12000 об/мин при 4С. Супер переносили в новую пробирку, добавляли 0,6 V изопропанола и оставляли в течение 10 минут при комнатной температуре. Проводили еще одно центрифугирование при 12000 об/мин. К осадку добавляли 100 мкл 2 М NH4AC, рН=7.4, встряхивали, оставляли в ледяной бане на 5 минут. После центрифугирования отбирали супер, осаждали ДНК равным объемом изопропанола, осадок промывали 70% этанолом, растворяли в 1хТЕ.
Для электрофоретического разделения фрагментов ДНК от 0,5 до 10 т.п.н. использовали 0,7-1,0% агарозные гели, приготовленные на буфере ТАЕ состава 40 мМ Tris-HCl рН=8.0, 20 мМ CH3COONa и 2 мМ EDTA. Для нанесения проб на гель их смешивали с 1/10 объема буфера нанесения, содержащего 50% глицерина, 0,05% бромфенолового синего и 0,05% ксиленцианола. Электрофорез проводили при напряжении электрического поля 5-1Q В/см. Анализ разделения фрагментов ДНК в геле и фотографирование проводили в УФ-свете с помощью системы Biometra BioDoc II
Элюция ДНК из агарозного геля позволяет эффективно и быстро провести очистку ДНК от различных составляющих реакционных смесей, прежде всего ПЦР, рестрикции, лигирования, дефосфорилирования - от ферментов, солей, нуклеотидов, от примесей нежелательных фрагментов ДНК и РНК. Элюцию проводили, используя системы QIAquick Gel Extraction Kit и QIAEX II Gel Extraction System, и следовали рекомендациям производителя/
Рестрикция ДНК, тупление концов и дефосфорилирование фрагментов ДНК, лигирование ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook et ah, 1989). Выделение фрагментов ДНК из агарозы и очистку ДНК от продуктов ферментативных реакций осуществляли с помощью наборов QIAquick PCR Purifacation Kit и QIAquick Gel extraction Kit (фирмы QIAGEN).
Для определения последовательности нуклеотидов ДНК по Сэнгеру использовали набор Sequenase Version 3.0 DNA Sequencing Kit (Cat. No. 70770) фирмы USB (США). Все процедуры проводили, как указано в руководстве по пользованию набором.
Для оценки гомологии нуклеотидных последовательностей фрагментов эДНК применяли тест на множественное сравнивание (AliBee-MultipleAlignment: http://www.genebee.msu.su/services/malign reduced.html). Для поиска мотивов использовали программу МЕМЕ (http://meme.sdsc.edu/meme/website/meme.html). Для анализа последовательностей нуклеотидов в ДНК использовали компьютерные программы: DNASIS (Hitachi Software Engeneering Co. LTD, 1984, 1989); DNA Strider V 1.2 (CEA); MAR-Finder (Singh et al, 1997) на сервере http://www.ncgr.org/MarFinder/; BLAST v.2.0 (Altschul et al, 1997) на сервере http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
Все нуклеотидные последовательности полученных фрагментов элиминированной ДНК Cyclops kolensis московской популяции зарегистрированы в базе компьютерных данных (GenBank Accession Numbers: AY533039-AY533099).
Изучение структуры элиминированной ДНК С. kolensis московской популяции
Получение диминуционной ДНК циклопа проводили методом микродиссекции с последующей амплификацией с помощью DOP-PCR. Постдиминуционные гранулы собирали с сухих цитологических препаратов с помощью микроманипулятора в каплю стерильного Triton Х-100. После протеиназной обработки, описанной в разделе Материалы и методы, ДНК подвергали амплификации с частично вырожденными праймерами (DOP-PCR), причем первые 8 циклов проводили при пониженной температуре отжига праймеров, чтобы обеспечить подшивание праймерной последовательности к ДНК. В результате этих действий нами были получены фрагменты ДНК длиной 100-1000 п.н. Часть этого материала была помечена биотином в дополнительных 15 циклах PCR и использована в качестве зонда при гибридизации in situ, оставшийся продукт был клонирован в плазмидный вектор pGEM Easy (Promega). С помощью гибридизации диминуционной ДНК с додиминуционными хромосомами циклопа было показано, что последовательности эДНК присутствуют в большей или меньшей доле во всех хромосомах. Сигналы гибридизации указывают на то, что ДНК, подлежащая удалению, располагается в различных районах хромосом: около теломер, в прицентромерных участках, либо в других районах хромосом, не связанных ни с теломерами, ни с центромерами (рис 5).
В результате клонирования было получено и секвенировано 90 клонов, длина которых варьировала от 129 до 650 п.н. (средняя длина составила 351 п.н., их общая длина - 31564 п.н.). Данные клоны были названы CkD (Cyclops kolensis Drop). При сравнении последовательностей нуклеотидов всех 90 «. .- фрагментов между собой мы обнаружили, что в полученной клонотеке присутствуют: - 19 уникальных фрагментов: CkD: 2, 3, 18;19, 22, 24, 25, 29, 36, 42, 43, 50, 62, 97, 101, 103, 108, 126, 134. - 30 фрагментов, высокогомологичных по нуклеотидному составу (77-96%). но не идентичных на 100%. Мы разделили их на 7 семейств повторяющихся последовательностей: семейство 1 - CkD 8, 20, 53, 57, 75, 106,112, 122, 131; семейство 2 - CkD 5, 33, 35, 37, 48, 51, 55, 58, 78; семейство 3 - CkD 44,120; семейство 4 - CkD 80, 93; семейство 5-CkD 16, 60, 87; .....,,,. семейство 6 - CkD 7, 76,136; семейство 7 - CkD 31, 61. - 41 клон входил в состав 8 групп фрагментов ДНК, которые состояли из точных копий: CkD 30=56=91=109=128=140; CkD 9=10=26=47=90=110=121=123=124; CkD 14=79=120=i 25=133; CkD 66=71=84=88=94; CkD 92=127; CkD 99=102=142=143; CkD 4=12=116=119; CkD 11=27=54=63=81=74.
В дальнейшем, анализ последовательностей эДНК мы вели в двух направлениях:
1 .Отдельный анализ фрагментов внутри каждой из 7 семейств повторов. 2. Для получения более реального представления о молекулярной сложности эДНК была составлена выборка (S1), в которую вошли все «уникальные» фрагменты и по одному представителю из каждого семейства повторов и фрагментов, имеющих свои точные копии (в качестве представителей были выбраны следующие клоны: CkD 8, 55,44, 93,16, 7,31, 30,47,133, 71, 92, 99, 116, 11). С одной стороны, это исключает риск того, что программа поиска будет выдавать, прежде всего, мотивы, характерные для групп повторяющихся последовательностей, с другой стороны, поскольку один из представителей будет участвовать в поиске с другими фрагментами, то можно ожидать, что мы получим более короткие гомологичные мотивы, присущие всем или, по крайней мере, большинству последовательностей эДНК.
В полученной нами клонотеке выделено 7 семейств повторяющихся последовательностей (семейства 1-7, см. выше). Наибольший интерес, в качестве примера, представляют первые две группы, включающие в свой состав наибольшее число клонов (по 9 фрагментов в каждой группе). С помощью компьютерной программы по поиску повторяющихся мотивов (http://meme.sdsc.edu/mcincAvcbsite/meme.html. см. Материалы и методы) мы анализировали последовательности данных клонов внутри каждой отдельно взятой группы. Результаты анализа представлены на рисунках 6 и 7. Для фрагментов группы 1 было выявлено 10 мотивов (№1-10, рис. 6) длиной от 11 до 79 п.н.
